Штамм Saccharomyces cerevisiae 1-TAE-2 для тестирования мутагенов окружающей среды Российский патент 2024 года по МПК C12N1/19 C12N15/81 

Изобретение относится к области использования микробиологических объектов для контроля загрязнения окружающей среды. Может найти применение в экологическом мониторинге и санитарно-токсикологическом контроле вод и почв.

В мировой практике широко используются различные тест-системы, позволяющие регистрировать генетические или канцерогенные эффекты веществ, загрязняющих окружающую среду. В таких тест-системах используются различные организмы - от бактерий до млекопитающих. Генетические или канцерогенные эффекты являются следствием повреждения ДНК. Следовательно, идеальная тест-система должна определять количество повреждений ДНК, возникших после воздействия мутагена. Повреждения структуры ДНК являются причиной смерти клетки и возникновению мутаций. Все существующие биологические тест-системы основаны на учете либо летального, либо мутагенного действия биологически активных веществ. Спектр повреждений ДНК достаточно широк, поэтому клетки выработали целый ряд репарационных систем, которые ответственны за удаление из ДНК повреждений разной химической природы. Для увеличения чувствительности тест-систем используется подход, связанный с блокированием какой-либо репарационной системы. При этом в ДНК остаются не удаленными повреждения, за которые отвечает блокированная репарационная система, что сказывается на гибели клетки или частоте возникающих мутаций. Тест-системы, созданные на основе микроорганизмов, оказались наиболее быстрыми и дешевыми. Генетическим событием, наиболее подходящим для обнаружения генетически опасных соединений, является индукция прямых генных мутаций. Другим генетическим событием, используемым для обнаружения потенциальных мутагенов, является митотическая рекомбинация - митотический кроссинговер и общая митотическая сегрегация.

Известны штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Т2 (генотип: МАТа ade2-192 rad2) и Т3 (МАТα ade2-192 rad54) для определения генотоксикантов, основанные на учете рекомбиногенной активности при повреждении ДНК, описанные в работе: Левитин М.М. и др. Использование дрожжей-сахаромицетов как тест-объекта для оценки генетических эффектов системных фунгицидов. Микология и фитопатология. 1993. Т. 27, N1, С. 60-66 [1]. Для повышения чувствительности к рекомбииогенному действию, этих диплоидных штаммов в обе гомологичные хромосомы были введены мутации rad2-1 и rad54. мутация rad2-1 блокирует репарацию повреждений, изменяющих структуру спирали ДНК, мутация rad54 блокирует репарацию двунитевых разрывов и сшивки комплементарных нитей ДНК [2]. Недостатком этих штаммов является то, что с их помощью нельзя учесть мутагенность испытуемых веществ, т.е. данные штаммы не могут фиксировать мутации, возникающие в клетках при повреждении ДНК.

Известен штамм 1ПГ-216 (генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 rad2-1), описанный А.С. СССР №1 135188, который обладает высокой точностью и чувствительностью определения прямых генных мутаций, т.е. мутагенности [3]. Ген МАТ контролирует пол клетки, мутантный ген ade2-248 блокирует биосинтез нуклеиновых кислот и вызывает красную окраску колоний, мутантный ген leu2 блокирует синтез аминокислоты лейцина, мутантный ген rad2, со сниженными репарационными способностями, приводит к высокой чувствительности клетки к ультрафиолетовым лучам и ряду химических мутагенов, которые изменяют спиральную структуру ДНК. Известно, что прямые мутации у штамма 1ПГ-216 фиксируются по изменению красного цвета колоний у исходных клеток на контрастный белый у колоний мутантов. В основе этого штамма лежит регистрация генных мутаций по 6 генам аденинзависимости (ade3, ade4, ade5, ade6, ade7, ade8). Введение в генотип мутации rad2-1 увеличивает чувствительность штамма к летальному и мутагенному действию мутагенов.

Недостатками этого гест-штамма является то, что ключевая мутация rad2-1 способна ревертировать (клетки приобретают устойчивость к повреждению ДНК) и эта мутация повышает чувствительность штамма только за счет высокой гибели клеток при повреждении ДНК, а значит снижает эффективность штамма.

Известен штамм 3С-СКВ-173 дрожжей Saccharomyces cerevisiae (генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 him1-1 rad2-1) для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2-1 и him1-1. Этот тест-штамм в отличие от предыдущего несет дополнительную мутацию, которая кратно увеличивает вероятность трансформации повреждения в мутацию him1-1, что значительно увеличивает чувствительность тест-штамма к мутагенному действию генотоксикантов. Штамм описан в работе: Ковальцова С.В., Королев В.Г. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2 и him1. Генетика. 1996. Т. 32, №3, с. 366-372 [4].

К недостаткам штамма 3С-СКВ-173 следует отнести способность мутаций him1-1 и rad2-1 ревертировать к дикому типу, что сказывается на стабильности работы тест-системы, основанной на использовании данного штамма.

На основе штамма 3С-СКВ-173 в Петербургском институте ядерной физики был создан штамм 1-ТАЕ-1 (генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 rad2A hsm3A) для тестирования мутагенов окружающей среды. В тестерной линии 1-ТАЕ-1 ген МАТ контролирует пол клетки, мутантный ген ade2-248 блокирует биосинтез нуклеиновых кислот, мутантный ген leu2 блокирует синтез аминокислоты лейцина, мутантный ген rad2 со сниженными репарационными способностями приводит к высокой чувствительности клетки к ультрафиолетовым лучам и ряду химических мутагенов, которые изменяют спиральную структуру ДНК. Мутантный ген hsm3 повышает уровень индуцированных мутаций. Этот штамм сохранил все целевые свойства штамма 3С-СКВ-173 и приобрел стабильность в результате использования неревертирующих мутаций rad2Δ и hsm3Δ. Данный штамм рассмотрен в качестве прототипа и описан в патенте РФ №2757018 [5].

К недостаткам штамма 1-ТАЕ-1 следует отнести низкую чувствительность штамма к химическим мутагенам, вызывающим повреждения азотистых оснований, т.е. внутреннюю структуру ДНК. Следует отметить, что этот тип повреждений ДНК характерен для большинства химических агентов, взаимодействующих с ДНК (2), т.е. важен.

Технический эффект настоящего изобретения заключается в возможности обеспечить тестирование мутагенов, вызывающих повреждения азотистых оснований внутренней структуры ДНК.

Технический эффект достигается тем, что создан штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, имеющий генотип МАТα ade2-248 Ieu2-3,112 ura3-160.188 apn1Δ hmo1Δ, обеспечивающий высокую чувствительностью к генотоксикантам окружающей среды, повреждающих азотистые основания внутренней структуры ДНК.

Суть изобретения заключается в том, что в отличие от генотипа штамма - прототипа 1-ТАЕ-1 (МАТα ade2-248 leu2-3,112 rad2Δ hsm3Δ) в генотипе заявляемого штамма 1-ТАЕ-2 (МАТα ade2-248 Ieu2-3,112 apn1Δ hmo1Δ) две базовые мутации rad2Δ и hsm3Δ заменены на apn1Δ и hmo1Δ. Мутация apn1Δ блокирует репарацию подавляющего числа повреждений азотистых оснований, мутация hmo1Δ кратно повышает вероятность выхода мутаций на одно повреждение ДНК. В совокупности такие замены обеспечивают специфичное тестирование мутагенов, вызывающих повреждения азотистых оснований внутренней структуры ДНК. Этот факт установлен экспериментальным путем.

К тому же все использованные для конструирования штамма мутации были неревертирующими мутациями своих генов. Это исключает возвращение к дикому типу ключевых мутаций и стабилизирует заявленный штамм. А - этот символ означает делецию, т.е. неревертирующую стабильную мутацию.

Получение заявляемого штамма

Для создания штамма 1-ТАЕ-2 использовали штамм дикого типа 11D-3031 (МАТα ade2Δ-248 leu2-3,112 ura3-160.188 trp1Δ) из коллекции дрожжевых штаммов Лаборатории генетики эукариот ПИЯФ. В этом штамме был делетирован ген НМО1. Для этой цели использовали плазмиду pJL15, любезно предоставленную др. S.J. Brill. Плазмида была разрезана рестрикиазой Sail. Полученные фрагменты трансформировали в клетки штамма 11D-3031, которые высевали на селективную среду без триптофана.

Через четыре дня отбирали выросшие колонии, в которых ген НМО1 был заменен на ген TRP1. Полученные таким образом штаммы проверяли с помощью ПНР на правильность встраивания маркерного гена TRP1. Таким образом получена мутация hmo1Δ (которая кратно увеличивает выход любых мутаций.)

На следующем этапе использовали один из полученных на первом этапе штаммов. Этот штамм трансформировали фрагментами плазмиды YIP5 (любезно предоставленная Dr. Kramer), которая была разрезана рестриктазой HpaI. и клетки высевали на селективную среду без урацила. Через четыре дня отбирали выросшие колонии, в которых ген APN1 был заменен на ген URA3. Полученные таким образом штаммы проверяли на чувствительность к метилметансульфонату (ММС), к которому мутации apn1 являются высоко чувствительными [2]. Один из полученных трансформантов, удовлетворяющих свойством обеспечить тестирование мутагенов, вызывающих повреждения азотистых оснований внутренней структуры ДНК назван 1-ТАЕ-2 (генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 ura3-160.188 apn1Δ hmo1Δ).

Для подтверждения чувствительности заявляемого штамма к повреждения азотистых оснований внутренней структуры ДНК и сранении ее с чувствительностью штамма-прототипа 1-ТАЕ-1 выполнено следующее.

Использовали стандартный мутаген метилметансульфонат (ММС), взаимодействующий исключительно с азотистыми основаниями нуклеиновых кислот [2] Клетки обоих штаммов выращивали в 3 мл жидкой полной среды в течение трех суток. Затем суспензии центрифугировали, осадок отделяли от среды и промывали дистиллированной водой. Полученные клетки ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды и прибавляли ММС в конечной концентрации 0,03% к клеткам заявляемого штамма 1-ТАЕ-2 и 0,1% к клеткам штамма 1-ТАЕ-1 - прототип, соответственно. В контрольной пробирке ММС отсутствовал. Пробирки инкубировали в термостате при 30°С в течение 1 часа. При этих условиях обработки (разная концентрация ММС) выживаемость клеток обоих штаммов была сравнимой. Затем на чашки с агаризованной средой, содержащей канаванин в концентрации 80 мг/л, наносили по 0,05 мл суспензий обоих штаммов для учета мутантов, устойчивых к канаванину. Для определения выживаемости клеток исходные суспензии разводили дистиллированной водой до концентрации ~10000 кл/мл и по 0,05 мл этих суспензий наносили на чашки с полной средой. Чашки инкубировали в течение 5 суток при 30°С. Выживаемость клеток определяли отношением числа колоний, выросших на полной среде после обработки ММС, к числу колоний, выросших на контрольных чашках (без ММС). Частоту мутаций определяли отношением числа колоний, выросших на чашках с канаванином, к числу посеянных клеток с учетом выживаемости. Усредненные частоты мутаций за вычетом контроля составили: для штамма прототип 1-ТАЕ-1 - 6,2×10^-6 и для заявляемого штамма 1-ТАЕ-2 - 31,1×10^-6. Пересчет на одинаковую концентрацию 0,03% ММС дает соотношение частот мутагенеза 1-ТАЕ-1: 1-ТАЕ-2 - 1,9: 31,1, т.е. чувствительность к повреждения азотистых оснований внутренней структуры ДНК у заявляемого штамма в 15 раз выше, чем у прототипа. Выживаемость обоих штаммов при обработке ММС с выбранными дозами была близка к 80%.

Выводы. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae имеет генотип МАТα ade2-248 Ieu2-3,112 ura3-160.188 apn1Δ hmo1Δ. Штамм обладает высокой чувствительностью к генотоксикантам окружающей среды, повреждающим азотистые основания ДНК. Штамм обладает стабильностью, неспособностью мутаций apn1Δ hmo1Δ ревертировать к дикому типу. Изобретение может быть использовано в экологическом мониторинге и санитарно-токсикологическом контроле вод и почв.

Список литературы

1. Левитин М.М., Ковальцова С.В., Королев В.Г., Федорова И.В. Использование дрожжей-сахаромицетов как тест-объекта для оценки генетических эффектов системных фунгицидов. Микология и фитопатология. 1993. Т. 27. N1. С 60-66.

2. Freidberg Е.С., Walker G.C., Siede W. et al. DNA repair and mutagenesis // 2nd ed. ASM Press. Washington. 2006. P. 1161.

3. Грачева Л.М., Касинова Г.В. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ЦМПМ Y-449, используемый для регистрации прямых генных мутаций. Авторское свидетельство СССР №1135188 А, МПК C12N 15/00.

4. Ковальцова С.В., Королев В.Г. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, основанный на взаимодействии мутаций rad2 и him1. Генетика. 1996. Т. 32, №3, с. 366-372.

5. Евстюхина Т.А., Королев В.Г. Штамм дрожжей Saccharomycesw cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды. Патент № 2757018. Регистрация 08.10.2021 - прототип.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, имеющий генотип МАТα ade2-248 Ieu2-3,112 ura3-160.188 apn1Δ hmo1Δ. Штамм обладает чувствительностью к генотоксикантам окружающей среды, повреждающим азотистые основания ДНК, а также неспособностью мутаций apn1Δ и hmo1Δ ревертировать к дикому типу. Изобретение обеспечивает тестирование мутагенов, вызывающих повреждения азотистых оснований ДНК.

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae для тестирования мутагенов окружающей среды, имеющий генотип МАТα ade2-248 leu2-3,112 ura3-160.188 apn1Δ hmo1Δ, обеспечивающий чувствительность к химическим генотоксикантам окружающей среды, повреждающим азотистые основания ДНК, обладающий неспособностью мутаций apn1Δ и hmo1Δ ревертировать к дикому типу.