СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА Российский патент 2014 года по МПК G01N33/50 C12Q1/14 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к определению адгезии золотистого стафилококка.

Известен способ выявления адгезивных энтеробактерий [1], в котором наличие факторов адгезии определяют в реакции D-маннозорезистентной гемагглютинации с эритроцитами человека II(А) группы крови, крупного рогатого скота, барана, морской свинки.

Недостатком способа является то, что он применим для изучения указанного свойства бактерий семейства Enterobacteriaceae, являющихся грамотрицательными микроорганизмами, осуществляющими адгезию посредством фимбрий белковой природы, и не учитывает специфику строения клеточной стенки грамположительных микроорганизмов, к которым относится и золотистый стафилококк, осуществляющий процесс адгезии посредством гемагглютинина [2].

Известен способ [3] по подготовке препаратов бактерий для изучения адгезивных свойств на эритроцитах млекопитающих, однако, способ не описывает особенности и специфику приготовления самих препаратов крови для постановки указанной реакции.

Известен развернутый и экспресс-способ определения адгезивных свойств микроорганизмов [4], в которых в качестве субстрата для адгезии используют эритроциты крови, так как они на своей поверхности содержат гликофорин - вещество, идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для адгезии микробов. В указанных способах субстратом адгезии являются формализованные эритроциты человека 0(I) группы крови Rh(+), предварительно дважды отмытые буферным раствором путем центрифугирования.

Недостатком названных способов является их очень низкая эффективность и воспроизводимость для патогенных грамположительных бактерий рода Staphylococcus, а именно Staphylococcus aureus (золотистого стафилококка). Так, например, способ 4 способ предполагает наличие и поиск донорской крови человека I(0) группы, что в лабораторных условиях не всегда возможно, кроме того, необходим подготовительный этап по отмыванию эритроцитов крови на центрифуге, что значительно увеличивает временные затраты и делает этот способ весьма трудоемким. Кроме того данный способ показывает низкую воспроизводимость результатов.

Известен способ определения адгезии стафилококков к гемопротеинам, заключающийся в том, что исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с иммобилизованными гемопротеинами (миоглобин, гемоглобин) в питательной среде 199 в течение 60±15 минут, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют адгезированные стафилококки [5].

Наиболее близким способом для определения адгезивных свойств золотистого стафилококка по назначению и совокупности существенных признаков является способ [5]. Однако этот способ требует значительных временных затрат, трудоемок в реализации, предполагает наличие как дополнительных питательных сред, так и дополнительного лабораторного оборудования. Кроме того, этот способ позволяет оценить адгезивные свойства стафилококков исключительно количественно, но никак не качественно.

Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа качественной экспресс диагностики для определения степени выраженности адгезивных свойств стафилококков, характеризующегося простотой, удобством, малыми временными затратами и высокой результативностью.

Технический результат достигается тем, что в способе определения адгезии золотистого стафилококка исследуемую чистую культуру микроорганизмов, разведенную по стандарту мутности 1 млрд/мл, суспендируют на предметном стекле с формализованными 50-ти %-ми отмытыми эритроцитами барана, полученный препарат окрашивают по Граму, определяют адгезию под световым микроскопом. Если исследуемые микроорганизмы обладают изучаемым свойством, они адгезируются на поверхности эритроцитов, образуя скопления.

Особенностью является то, что в качестве субстрата клеточной адгезии используют 50-ти % формализованные отмытые эритроциты животного, в частности, барана. Это позволяет воспроизвести клеточную адгезию золотистого стафилококка на высоком уровне.

Способ осуществляют следующим образом.

Чистую культуру золотистого стафилококка выращивают одни сутки на 2% мясопептонном агаре и разводят по стандарту мутности 1 млрд/мл. Формализованные 50-ти % отмытые эритроциты барана производства ОАО «Биомед» в ампулах по 5 мл из стандартного набора разводят до концентрации 100 млн/мл, на растворе буфера (0,1 М раствор фосфата натрия, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2-7,3). На предметное стекло наносят одну каплю буферного раствора, суспендируют по одной капле взвесей эритроцитов и золотистого стафилококка. Предметное стекло помещают во влажную камеру при 37°C, 30 мин. Препарат высушивают, окрашивают по Граму. Определяют адгезивные свойства золотистого стафилококка под световым микроскопом. Определяют средний показатель адгезии (СПА) - среднее количество микробов, адгезированных на одном эритроците, при подсчете не менее 25 эритроцитов. Адгезивность считают нулевой при СПА от 0 до 1,0, низкой при СПА от 1,01 до 2,0, средней от 2,1 до 4.0, высокой - свыше 4,0.

Использованные источники

1. Методические рекомендации по выявлению гемолитических, адгезивных и энтеротоксигенных энтеробактерий. Москва. 1987. 15 с.

2. Усвяцов Б.Я. и др. Взаимодействие бактерий и эритроцитов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2005. - №4. - С.89-95.

3. Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе. №13-7-2/4 от 16 февраля 1999 г.

4. Брилис В.И. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело. 1986. №4. С.210-212.

5. Патент на изобретение RU 2393229 С1. Способ определения адгезии Staphylococcus spp. к гемопротеинам. Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Мустафин И.Г.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии золотистого стафилококка. Для этого исследуют чистую культуру золотистого стафилококка в концентрации 1 млрд/мл. Определяют среднее количество микробов, адгезированных на одном эритроците при подсчете не менее 25 эритроцитов. При этом в качестве субстрата адгезии используют эритроциты барана в концентрации 100 млн/мл, которые предварительно отмывают 50-ти % формалина. Изобретение обеспечивает качественную и количественную экспресс-диагностику определения степени выраженности адгезивных свойств стафилококков.

Способ определения адгезии золотистого стафилококка, заключающийся в том, что исследуют чистую культуру золотистого стафилококка в концентрации 1 млрд/мл, определяют среднее количество микробов, адгезированных на одном эритроците, при подсчете не менее 25 эритроцитов, отличающийся тем, что в качестве субстрата адгезии используют эритроциты барана в концентрации 100 млн/мл, которые предварительно отмывают 50% формалином.