ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный - 10,0 г; натрия хлорид - 5,0 г; кровь - 10 г; агар-агар - 15,0-20,0 г; рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°С (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб.-2008.-С.64-65.-С.-269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая, г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи - 260,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,2; активированный уголь - 2,0; L-цистеина гидрохлорид - 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов - 2,5; агар микробиологический - 8,5; дистиллированная вода до 1 л (Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011 г. Бюл. №5).

Недостатком данной среды является многоступенчатость и сложность получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной и простой в приготовлении питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл через 36 ч.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат легкого свиньи; 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный), а также уголь активный, L-цистеина гидрохлорид; дистиллированную воду, агар микробиологический с добавлением в среду в качестве стимулятора роста ферментативного гидролизата желтка куриного яйца при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат легкого свиньи   с содержанием аминного азота 0,10-0,14% 240,0-280,0 Ферментативный гидролизат желтка куриного яйца 3,0-7,0 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,7-1,1 Калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 2,0-2,4 Уголь активный 1,0-3,0 L-цистеина гидрохлорид 0,2-0,6 Агар микробиологический 6,5-10,5 Дистиллированная вода до 1 л

Легкое свиньи ТУ-8-5344-113607. Биологическая ценность легкого свиньи, относящегося к субпродуктам II категории, состоит в наличии в среднем 13,6% белка, минеральных веществ (солей натрия, калия, кальция, фосфора) и высоком содержании железа; общее их количество достигает 1%, 0,5-1,4% золы. Легкое содержит также витамины, микроэлементы, экстрактивные вещества. Из белковых веществ в легком свиньи при ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серин, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин (И.В.Петрухин. Корма и кормовые добавки. Москва. Росагропромиздат. 1989. С.-104-108).

Биологическая ценность желтка куриного яйца состоит в наличии в среднем 50% воды, белка 16,2%, аминокислот, макроэлементов в мг на 100 г: калия - 129; кальция - 129; магния - 15; серы - 170; хлора - 146,8; фосфора - 542; натрия - 51, микроэлементов в мкг на 100 г: железа - 6700; йода - 23; кобальта - 23; марганца - 37; меди - 139; молибдена - 11,8; хрома - 7,8; цинка - 3105. Содержание витаминов мг в кг: витамина А - 0,35; каротина - 0,06; витамина B₁ - 1,6; витамина D - 4,70; витамина Е - 2,0; пантотеновой кислоты - 1,3; витамина В₅ - 3,0; В₆ - 0,14; ниацина - 0,19; рибофлавина - 0,44; фолацина - 7,0; холина - 251,7. Коэффициент пересчета незаменимых аминокислот в г/кг составляет 6558, из них: валина - 937; изолейцина - 907; лейцина - 1381; лизина - 1156; метионина - 415; треонина - 830; триптофана - 236 и фенилаланина - 696. Коэффициент пересчета заменимых аминокислот составляет 9331, в том числе: аланина - 854; аргинина - 1156; аспарагиновой кислоты - 1339; гистидина - 383; глицина -514; глютаминовой кислоты - 2051; пролина - 695; серина - 1365; тирозина - 699; цистина - 275. Микроэлементов мг в кг: цинка - 14,0; марганца - 0,8; меди - 0,8; кобальта - 0,07. Органических веществ: протеина - 93% (белка); жира - 94% (М.Ф.Нестерин, И.М.Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с).

L-цистеин гидрохлорид - аминокислота (Panreac 15 В512/ Партия Lot 0000054464), которая ускоряет рост легионелл.

Соляную кислоту ГОСТ - 3118-77 (чда, хч) используют для установления рН. Массовая доля основного вещества, % 35-38.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15110173. Дата изготовления: апрель 2012 г.

Уголь активный древесный порошкообразный, марки ОУ-А. Тонкодисперсный порошок, черного цвета. Без посторонних включений, соответствует ГОСТу 4453-74. Абсорбирует на себя отработанные продукты обмена легионелл.

Легионеллы являются факультативными внутриклеточными паразитами, поэтому растут в желточном мешке куриных эмбрионов, в культуре клеток животных и человека (фибробласты легкого). (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник для студентов медицинских вузов /Под редакцией А.А.Воробьева. - 2-е изд., испр. и доп. - М.:ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. - С.-400).

Включение в состав среды калий фосфатного буфера 0,01 М (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1 замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. -М., 1989). (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб.-2008. - С.37-38).

При приготовлении питательной среды допускается применение только дистиллированной воды без применения растворов, содержащих ионы натрия, ввиду их губительного действия.

В отличие от прототипа сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых культур уже через 36 ч.

Приготовление ферментативного гидролизата легкого свиньи.

Легкое свиньи в количестве 1 кг режут на кусочки размером 2х2 см, ссыпают в эмалированную кастрюлю, заливают водопроводной водой в количестве 1,5 л, варят в течение 10 мин, остужают до 46°С. Отвар сливают в 3 л стеклянный баллон. Остывшие кусочки легкого пропускают через мясорубку, затем помещают в баллон с отваром. Фермент панкреатин в количестве 9,5 г/л (или поджелудочную железу крупного рогатого скота, дважды пропущенную через мясорубку в количестве 150 г/кг) помещают в баллон с фаршем легкого и отваром его. Доводят рН до 8,2±0,1 с помощью калия гидроокиси по фенолфталеину. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 37±1°С. Содержимое баллона в течение суток перемешивают, через каждые 20±1 мин по 5 мин, а в последующие сутки через 1,5±0,2 ч по 5 мин. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,5%-0,6% (через 5 суток). После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°С.

Приготовление ферментативного гидролизата желтка куриного яйца

Желтки куриного яйца в количестве 30 штук, что составляет 550 мл, вливают в 3-х литровый стеклянный баллон, заливают подогретой до 42+1°С питьевой водой до 1,5 л, подщелачивают 20% раствором гидроокиси калия в количестве 13 мл до рН 8,2 по фенолфталеину, затем добавляют коммерческие ферменты: трипсин в количестве - 31,0 г и панкреатин - 10,0 г. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 42°С. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие - через 1,5-2,0 ч по 5 мин. Ежедневно ведется измерение рН среды и нарастания аминного азота. Через двое суток ввиду резкого падения рН до 5 ед. добавляют 30 мл 20% гидроокиси калия до рН 8,2 по фенолфталеину. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,7%-0,8%. После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают в течение 2-х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°С.

Питательную среду на ферментативной основе легкого свиньи для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 260,0 мл; ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 5,0 г/л; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,9 г/л; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,2 г/л; уголь активный - 2,0 г/л; агар микробиологический - 8,5 г/л; дистиллированную воду до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, затем добавляют 0,4 г L-цистеина гидрохлорида, растворенного в 10 мл дистиллированной воды, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до 6,9±0,5 в количестве 2,2 мл. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±10,0 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин. После расплавления в кипящей водяной бане и остуженный до 56°С агар разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 мин и используют для посева.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза» (Москва, 2006) с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophila АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophila ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара рН 6,8 при температуре 37°С 24 ч. Из суточных культур готовили 1 млрд взвесь м.к. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 100 м.к. Из данных разведений взвесей культур высевали по - 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного агара. Посевы инкубировали при 37°С в течение 5 суток при ежедневном просмотре. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчетов выросших колоний.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,100% - 240,0 мл; ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 3,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,7; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,0; угол активный - 1,0; L-цистеина гидрохлорида - 0,2; агар микробиологический - 6,5; дистиллированную воду до - 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект был меньше 50%, через 36 ч выросших колоний от посева тест-штаммов в количестве 2 (плоско-выпуклых, синевато-сероватых диаметром 1,0-1,1 мм), тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 260,0 мл; ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 5,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,2; угол активный - 2,0; L-цистеина гидрохлорида - 0,4; агар микробиологический - 8,5; дистиллированную воду до - 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект превышает 50%, выросших колоний от посева тест-штаммов - в количестве 7 (плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,2-1,5 мм) через 36 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14%-280,0 мл; ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 7,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 1,1; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,4; уголь активный - 3,0; L-цистеина гидрохлорида - 0,6; агар микробиологический - 10,5; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект наблюдался меньше 50%, выросших колоний от посева тест-штаммов - в количестве 3 (плоско-выпуклых, синевато-сероватых диаметром 1,0-1,1 мм) через 36 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на ферментативной основе легкого свиньи (пример 2).

Предлагаемая среда качественная, простая в приготовлении, в основу берется ферментативный гидролизат легкого свиньи, а в качестве стимулятора роста легионелл - ферментативный гидролизат желтка куриного яйца. Рентабельность производства составляет 29%.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение питательной среды, создающей оптимальные условия для выращивания легионелл, содержащей: ферментативный гидролизат легкого свиньи, ферментативный гидролизат желтка куриного яйца, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, L-цистеина гидрохлорид, уголь активный, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении ингредиентов. Изобретение позволяет получить качественную, простую в приготовлении питательную среду, сократить сроки выращивания легионелл.

Питательная среда для выращивания легионелл, содержащая, г/л:
Ферментативный гидролизат легкого свиньи   с содержанием аминного азота 0,10-0,14% 240,0-280,0 Ферментативный гидролизат желтка куриного яйца 3,0-7,0 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,7-1,1 Калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 2,0-2,4 Уголь активный 1,0-3,0 L-цистеина гидрохлорид 0,2-0,6 Агар микробиологический 6,5-10,5 Дистиллированная вода до 1 л