ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред для культивирования легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный - 10,0 г; натрия хлорид - 5,0 г; кровь - 10, г; агар-агар - 15,0-20,0 г; pH 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°C (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С.64-65; С. - 269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность. Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая, г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи - 260,0; калий фосфорнокислый 1 - замещенный - 0,9; калий фосфорнокислый 2 - замещенный 3 - водный - 2,2; активированный уголь - 2,0; L-цистеина гидрохлорид - 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов - 2,5; агар микробиологический - 8,5; дистиллированная вода до 1 л (Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011 г. Бюл. №5).

Недостатком данной среды является многоступенчатость и сложность получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной и простой в приготовлении питательной среды растительного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл через 48 ч.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат сои бобов; 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1 - замещенный; калий фосфорнокислый 2 - замещенный - 3 - водный), а также уголь активный, L-цистеина гидрохлорид; дистиллированную воду, агар микробиологический с добавлением в среду в качестве стимулятора роста ферментативного гидролизата желтка куриного яйца при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат сои бобов 60,0-140,0 Ферментативный гидролизат желтка куриного яйца 10,0-30,0 Калий фосфорнокислый 1 - замещенный 0,7-1,1 Калий фосфорнокислый 2 - замещенный   3 - водный 1,2-3,2 Уголь активный древесный 1,0-3,0 L-цистеина гидрохлорид 0,2-0,6 Агар микробиологический 6,5-10,5 Дистиллированная вода до 1 л

В качестве сырья используют сою, плоды которой - бобы содержат в среднем 40% белка, кроме того, соя богата микроэлементами и витаминами. Как известно (Y.P. Yupta, 1987) соевые белки характеризуются повышенным содержанием глютаминовой и аспарагиновой кислот, поставляющих макроэргические связи. Соевые белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот как лизин, лейцин, аргинин. Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е.И. Чазов, X.С. Морган, /США/ 1989).

Приготовление ферментативного гидролизата желтка куриного яйца

Биологическая ценность желтка куриного яйца состоит в наличии в среднем 50% воды, белка 16,2%, аминокислот, макроэлементов в мг на 100 г: калия - 129; кальция - 129; магния - 15; серы - 170; хлора - 146,8; фосфора - 542; натрия - 51, микроэлементов в мкг на 100 г: железа - 6700; йода - 23; кобальта - 23; марганца - 37; меди - 139; молибдена - 11,8; хрома - 7,8; цинка - 3105. Содержание витаминов мг в кг: витамина А - 0,35; каротина - 0,06; витамина B₁ - 1,6; витамина Д - 4,70; витамина Е - 2,0; пантотеновой кислоты - 1,3; витамина B₅ - 3,0; В₆ - 0,14; ниацина - 0,19; рибофлавина - 0,44; фолацина - 7,0; холина - 251,7. Коэффициент пересчета незаменимых аминокислот в г/кг составляет 6558 из них: валина - 937; изолейцина - 907; лейцина - 1381; лизина - 1156; метионина - 415; треонина - 830; триптофана - 236 и фенилаланина - 696. Коэффициент пересчета заменимых аминокислот составляет 9331 в том числе: аланина - 854; аргинина - 1156; аспарагиновой кислоты - 1339; гистидина - 383; глицина - 514; глютаминовой кислоты - 2051; пролина - 695; серина - 1365; тирозина - 699; цистина - 275. Микроэлементов мг в кг: цинка - 14,0; марганца - 0,8; меди - 0,8; кобальта - 0,07. Органических веществ: протеина - 93% (белка); жира - 94%. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.).

L-цистеин гидрохлорид - аминокислота (Panreac 15 В512/ Партия Lot 0000054464), которая ускоряет рост легионелл.

Соляная кислота ГОСТ - 3118-77 (чда, хч) используют для установления pH. Массовая доля основного вещества, % 35-38.

Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15110173. Дата изготовления: апрель 2012 г.

Уголь активный древесный порошкообразный, марки ОУ-А. Тонкодисперсный порошок, черного цвета. Без посторонних включений, соответствует ГОСТу 4453-74. Абсорбирует на себя отработанные продукты обмена легионелл.

Легионеллы являются факультативными внутриклеточными паразитами, поэтому растут в желточном мешке куриных эмбрионов, в культуре клеток животных и человека (фибробласты легкого). (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник для студентов медицинских вузов / Под редакцией А.А. Воробьева. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. - С. - 400).

Включение в состав среды калий фосфатного буфера 0,01 М (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1 замещенный; калий фосфорнокислый 2 - замещенный - 3 - водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне pH, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов - М., 1989). (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. - 2008. - С.37-38).

При приготовлении питательной среды допускается применение только дистиллированной воды без применения растворов, содержащих ионы натрия, в виду их губительного действия.

В отличие от прототипа, сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых культур уже за 2-е суток.

Приготовление ферментативного гидролизата сои бобов.

Питательную среду на ферментативной основе сои бобов для культивирования легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из сои бобов, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 110,0 мл; ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 20,0 мл калий фосфорнокислый 1 - замещенный - 0,9; калий фосфорнокислый 2 - замещенный 3 - водный - 2,2; уголь активный древесный - 2,0; агар микробиологический - 0,9; дистиллированную воду до - 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, pH корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до 6,9±0,1 в количестве 5 мл. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. После расплавления в кипящей водяной бане в остуженный до 56°C агар добавляют стерильного раствора L-цистеина гидрохлорида в количестве 0,4 г в 10 мл дистиллированной воды, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Приготовление ферментативного гидролизата желтка куриного яйца.

Желтки куриного яйца в количестве 30 штук, что составляет 550 мл, вливают в 3-литровый стеклянный баллон, заливают подогретой до 42±1°C питьевой водой до 1,5 л, подщелачивают 20% раствором гидроокиси калия в количестве 13 мл до pH 8,2 по фенолфталеину, затем добавляют коммерческие ферменты: трипсин в количестве - 31,0 г и панкреатин - 10,0 г. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 42°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие - через 1,5-2,0 ч по 5 мин. Ежедневно ведется измерение pH среды и нарастания аминного азота. Через двое суток, в виду резкого падения pH до 5 ед, добавляют - 30 мл 20% гидроокиси калия до pH 8,2 по фенолфталеину. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,7%-0,8%. После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают в течение 2-х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°C.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза» (Москва, 2006) с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophila АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophila ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара pH 6,8 при температуре 37°C 24 ч. Из суточных культур готовили 1 млрд. взвесь м.к. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А. Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 100 м.к. Из данных разведении взвесей культур высевали по - 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного агара. Посевы инкубировали при 37°C в течение 5 суток при ежедневном просмотре. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчетов выросших колоний.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из сои бобов, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,100% - 60,0 мл; ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 10,0 мл; калий фосфорнокислый 1 - замещенный - 0,7; калий фосфорнокислый 2 - замещенный 3 - водный - 1,2; угол активный - 1,0; L-цистеина гидрохлорида - 0,2; агар микробиологический - 7,0; дистиллированную воду до - 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект был меньше чем 50%, плоско-выпуклых, серовато-желтоватых колоний диаметром 1,0-2,0 мм через 48 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из сои бобов, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,120% - 110,0 мл;

ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 20,0 мл; калий фосфорнокислый 1 - замещенный - 0,9; калий фосфорнокислый 2 - замещенный 3 - водный - 2,0; уголь активный древесный - 2,0; L-цистеина гидрохлорида - 0,4; агар микробиологический - 9,0; дистиллированную воду до - 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект превышает 50%, плоско-выпуклых, желтовато-серых колоний диаметром 1,0-2,0 мм через 48 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из сои бобов, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,140% - 140,0 мл; ферментативный гидролизат желтка куриного яйца - 30,0 мл; калий фосфорнокислый 1 - замещенный - 1,1; калий фосфорнокислый 2 - замещенный 3 - водный - 3,2; уголь активный древесный - 3,0; L-цистеина гидрохлорида - 0,6; агар микробиологический - 11,0; дистиллированную воду до - 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект наблюдался менее 50%, плоско-выпуклых, желтовато-серых колоний диаметром 1,0-2,0 мм через 48 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на ферментативной основе сои бобов (пример 2).

Предлагаемая среда растительного происхождения обеспечивает рост легионелл. Рентабельность производства составляет 27,3%.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к питательной среде для культивирования легионелл. Питательная среда для культивирования легионелл, в состав которой входит: ферментативный гидролизат сои бобов, калий фосфорнокислый 1 - замещенный, калий фосфорнокислый 2 - замещенный - 3 - водный, L-цистеина гидрохлорид, уголь активный древесный, агар микробиологический и ферментативный гидролизат желтка куриного яйца, вода дистиллированная, взятые в определенном соотношении. Вышеописанная питательная среда позволяет сократить сроки выращивания легионелл. 3 пр.

Питательная среда для культивирования легионелл, содержащая, г/л:
Ферментативный гидролизат соевых бобов 60,0-140,0 Ферментативный гидролизат желтка куриного яйца 10,0-30,0 Калий фосфорнокислый 1 - замещенный 0,7-1,1 Калий фосфорнокислый 2 - замещенный   3 - водный 1,2-3,2 Уголь активный древесный 1,0-3,0 L-цистеина гидрохлорид 0,2-0,6 Агар микробиологический 7,0-11,0 Дистиллированная вода до 1 л