ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/00 C12R1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г; кровь 10,0 г; агар-агар 15,0-20,0 г рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°C (М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ - СПб. - 2008. - С. 64-65, с. 269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая, г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеина гидрохлорид 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 2,5; агар микробиологический 8,5; дистиллированная вода до 1 л. (Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011 г. Бюл. №5.)

Недостатком данной среды является относительно высокая себестоимость.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат желтка куриного яйца, 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный), а также активированный уголь; L-цистеин гидрохлорид; агар микробиологический, дистиллированную воду при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат желтка куриного яйца   (с содержанием аминного азота 0,10-0,14%) 132,0-192,0 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,7-1,1 Калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 2,0-2,4 Активированный уголь 1,0-3,0 L-цистеин гидрохлорид 0,25-0,55 Агар микробиологический 7,5-11,5 Дистиллированная вода до 1 л.

Биологическая ценность желтка куриного яйца состоит в наличии в среднем 50% воды, белка 16,2%, аминокислот, макроэлементов в мг/на 100 г: зола 1,7%; калия 129; кальция 129; магния 15; серы 170; хлора 146,8; фосфора 542; натрия 51, микроэлементов в мкг: железа 6700; йода 23; кобальта 23; марганца 37; меди 139; молибдена 11,8; хрома 7,8; цинка 3105. Содержание витаминов мг в кг: витамина А 0,35; каротина 0,06; витамина B₁ 1,6; витамина Д 4,70; витамина Е 2,0; пантотеновой кислоты 1,3; витамина B₅ 3,0; В₆ 0,14; ниацина 0,19; рибофлавина 0,44; фолацина 7,0; холина 251,7. Коэффициент пересчета незаменимых аминокислот в г/кг составляет 6558, из них - валина 937; изолейцина 907; лейцина 1381; лизина 1156; метионина 415; треонина 830; триптофана 236 и фенилаланина 696. Коэффициент пересчета заменимых аминокислот составляет 9331, в том числе: аланина 854; аргинина 1156; аспарагиновой кислоты 1339; гистидина 383; глицина 514; глютаминовой кислоты 2051; пролина 695; серина 1365; тирозина 699; цистина 275. Микроэлементов мг в кг: цинка 14,0; марганца 0,8; меди 0,8; кобальта 0,07. Органические вещества: протеина 93% (белка); жира 94%. (М.Ф.Нестерин, И.М.Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с.)

Легионеллы являются факультативными внутриклеточными паразитами, поэтому растут в желточном мешке куриных эмбрионов, в культуре клеток животных и человека (фибробласты легкого). (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник для студентов медицинских вузов / Под редакцией А.А.Воробьева. - 2-е изд., испр. И доп. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. - С. - 400.)

Включение в состав среды 0,01 М калий фосфатного буфера (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны. Кроме того, HPO₄ является компонентом нуклеиновых кислот, фосфолипидов и нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1989).

При приготовлении питательной среды используют только дистиллированную воду без применения растворов, содержащих ионы натрия, ввиду их губительного действия, обеспечивают получение чистых культур сплошного роста через 24 ч при посеве 100 м.к.

В отличие от прототипа предлагаемая среда обеспечивает оптимальные условия для размножения легионелл за 24 ч.

Приготовление ферментативного гидролизата желтка куриного яйца

Желток куриного яйца в количестве 30 штук, что составляет 550 мл, вливают в 3-литровый стеклянный баллон, заливают подогретой до 42+1°C питьевой водой до 1,5 л, подщелачивают 20% раствором гидроокиси калия до рН 8,2 в количестве 13 мл по фенолфталеину, затем добавляют коммерческие ферменты: трипсин в количестве 31,0 г и панкреатин 10,0 г. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 42°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие через 1,5-2,0 ч по 5 мин. Ежедневно ведется измерение рН среды и нарастания аминного азота. Через двое суток ввиду резкого падения рН до 5 ед. добавили 30 мл 20% гидроокиси калия до рН 8,2 по фенолфталеину. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,7%-0,8%. После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают в течение 2-х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°C.

Питательную среду на ферментативной основе желтка куриного яйца для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 162,0 мл, другие ингредиенты в соотношении, г/л: калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; агар микробиологический 9,5; дистиллированную воду - до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты в разведении (1:1) в количестве 1,0 мл до рН 6,8±0,1. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный на водяной бане и остуженный до 56°C агар добавляют 0,4 г L-цистеина гидрохлорида простерилизованного автоклавированием при 112°C в течение 30 мин, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Соляную кислоту ГОСТ-3118-77 (чда, хч) используют для установления рН. Массовая доля основного вещества, %, 35-38.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», (Москва, 2007), с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophilla АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophilla ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара контрольной среды СЭЛ рН 6,8 при температуре 36°C 24 ч. Из суточных культур готовили в стерильном 0,01 М калий фосфатном буфере 1 млрд взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85П (рН 6,8) ГИСК им. Л.А.Тарасевича, затем серийными десятикратными разведениями в калий фосфатном буфере в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 (10^-6). Из данных разведении взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного испытуемого агара и на контрольные среды: СЭЛ и агар Хоттингера (отрицательный контроль - на нем нет роста в любые сроки наблюдения). Посевы инкубировали при 36±1°C в течение 5 суток. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчета выросших колоний.

Контрольная среда СЭЛ (Питательная среда для культивирования и выделения возбудителя легионеллеза элективная) - состав, г/л: питательная основа животного происхождения - ферментолизат селезенки жидкий крупного рогатого скота в расчете на сухое вещество - 7,0; активированный уголь ОУ-А 4,0; агар микробиологический 17,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,4; рН среды 7,1. (Производитель ФГУЗ Рост НИПЧИ Роспотребнадзора. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117.)

Контрольный агар Хоттингера. Промышленный регламент №1707-05 на производство питательного агара для культивирования микроорганизмов, готового к применению (агара Хоттингера). Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05571 от 20 августа 2009 г. Срок действия не ограничен.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,10%, 132,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,7; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,0; активированный уголь 1,0; L-цистеин гидрохлорид 0,25; агар микробиологический 7,5; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов вырастало более 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 24 ч для обоих штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 162,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеин гидрохлорид 0,4; агар микробиологический 9,5; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов наблюдали сплошной рост в виде голубовато-серого налета для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве более 50% колоний диаметром 1,2 мм от посева, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из желтка куриного яйца, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14% 192,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 1,1; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,4; активированный уголь 3,0; L-цистеин гидрохлорид 0,55; агар микробиологический 11,5; дистиллированную воду - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов вырастало более 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 24 ч для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на основе ферментативного гидролизата желтка куриного яйца (пример 2).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для жизнедеятельности легионелл. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат желтка куриного яйца с содержанием 0,10-0,14% аминного азота, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеина гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания легионелл. 3 пр.

Питательная среда плотная для выращивания легионелл, включающая питательную основу, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат желтка куриного яйца при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
ферментативный гидролизат желтка куриного яйца   (с содержанием аминного азота 0,10-0,14%) 132,0-192,0 калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,7-1,1 калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 2,0-2,4 активированный уголь 1,0-3,0 L-цистеин гидрохлорид 0,25-0,55 агар микробиологический 7,5-11,5 дистиллированная вода до 1 л