ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г; кровь 10,0 г; агар-агар 15,0-20,0 г рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°C (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 64-65; С. - 269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеина гидрохлорид 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 2,5; агар микробиологический 8,5; дистиллированная вода до 1 л (Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011 г. Бюл. №5).

По питательной ценности предлагаемая среда равноценна аналогу, а по ростовым качествам несколько превосходит аналог.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат кильки; 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный), а также активированный уголь; L-цистеин гидрохлорид; агар микробиологический; дистиллированную воду с добавлением в среду в качестве стимулирующей добавки железа сернокислого закисного 7-водного при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат кильки   (с содержанием аминного азота 0,10-0,14%) 280,0-320,0 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,63-1,03 Калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 0,96-1,36 Железо сернокислое закисное 7-водное 0,18-0,22 Активированный уголь 1,0-3,0 L-цистеин гидрохлорид 0,2-0,6 Агар микробиологический 8,0-12,0 Дистиллированная вода до 1 л.

Килька ТУ-8-5344-113607. Биологическая ценность кильки состоит в следующем - содержание влаги 67%, белка 13,4%; минеральные вещества кильки: зола 1,6%, состоящая из солей мг на 100 г: калия 206; кальция 25; магния 23; фосфора 311; из микроэлементов наибольшее количество в мкг: железа 1400; кобальта 30; марганца 116; меди 240; никеля 8. В кильке содержатся также витамины: А - 0,06; С - 1,1; В₆ - 0,50; В₂ - 0,12; ниоцина - 3,70; B₁ - 0,02; фолацина - 13,0. Из белковых веществ в кильке при ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты мг на 100 г продукта: незаменимые: лизин 1090; метионин 410; триптофан 160; валин 660; лейцин 1300; изолейцин 570; треонин 610; фенилаланин 560; заменимые аминокислоты: пролин 480; аланин 790; аргинин 830; аспарагиновая кислота 1200; глицин 710; тирозин 500; гистидин 330; глютаминовая кислота 1260; цистин 170; серин 570 (М.Ф.Нестерин, И.М.Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. Пищевая промышленность». 1979. С. - 133-145).

Железо сернокислое закисное 7-водное ГОСТ 4148-78. Железо (II) сульфат. Показатели качества: хч, чда, ч. Массовая доля основного вещества ≥99,0% (Химические реактивы и высокочистые вещества. Каталог. / О.А.Гольдина, Ю.С.Кузнецова, Т.Г.Иванова и др. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Химия, 1990. С. - 212). В ходе многочисленных экспериментов первых исследователей по культивированию легионелл было обнаружено, что важнейшими факторами роста легионелл являются как аминокислоты, так и ионы железа (Легионеллезная инфекция / Н.Д.Темежникова, И.С.Тартаковский. Москва. «Медицина», 2007. - С.42; 120).

Включение в состав среды 0,01 М калий фосфатного буфера (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны. Кроме того, HPO₄ компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов, - М., 1989).

Ферментативный гидролизат кильки является качественной основой питательной среды ввиду присутствия в нем 13,4% белка, а это значит, что основа содержит большое количество аминокислот, железа, макро- и микроэлементов, которые играют огромную роль в жизнедеятельности любых микроорганизмов.

При приготовлении питательной среды используют только дистиллированную воду, без применения растворов, содержащих ионы натрия, в виду их губительного действия на легионеллы.

Сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых культур достаточного количества колоний через 24 ч при посеве 100 м.к.

В отличие от прототипа, предлагаемая среда экономична, выгодна и обеспечивает оптимальные условия для размножения легионелл за 24 ч.

Приготовление ферментативного гидролизата кильки

Кильку размороженную в количестве 0,6 кг пропускают дважды через мясорубку, затем помещают в 3-метровый л баллон, добавляют воду дистиллированную в количестве 1,8 л, доводят рН до 8,2±0,1 с помощью калия гидроокиси по фенолфталеину, затем добавляют коммерческий фермент панкреатин в количестве 12,0 г. активностью 45 ед, добавляют в качестве консерванта хлороформ в количестве 1% к объему. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 37±1°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие сутки через 1,5-2,0 ч по 5 мин. В течение первого часа через каждые 15 мин измеряют рН, при изменении рН в кислую сторону обязательно корректируют рН 40% раствором гидроокиси калия до значения 8,0-8,2. В последующие 2-е суток ведут перемешивание через 1,5-2,0 ч по 5 мин. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,3-0,4%. После этого гидролиз останавливают и гидролизат отстаивают в течение 2-х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°С.

Питательную среду на ферментативной основе кильки для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из кильки, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 300,0 мл, другие ингредиенты в соотношении, г/л: калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,83; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,16; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; агар микробиологический - 10,0; дистиллированную воду до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) в количестве 3 мл до рН 6,9±0,1. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный в кипящей водяной бане и остуженный до 56°C агар добавляют простирилизованный в 10 мл дистиллированной воде L-цистеин гидрохлорид в количестве 0,4 г, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Соляную кислоту ГОСТ-3118-77 (чда, хч) используют для установления рН. Массовая доля основного вещества, % 35-38.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», (Москва, 2007), с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophila АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophila ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара контрольной среды СЭЛ рН 6,8 при температуре 37°C 24 ч. Из суточных культур готовили 1 млрд. взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А.Тарасевича, затем серийными десятикратными разведениями в 0,01 М буферном растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 (10^-6). Из данных разведении взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного испытуемого агара, на среду СЭЛ и агар Хоттингера (отрицательный контроль). Посевы инкубировали при 35±0,5°C в течение 5 суток. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчета выросших колоний.

Контрольная среда СЭЛ (Питательная среда для культивирования и выделения возбудителя легионеллеза элективная) - состав г/л: питательная основа животного происхождения - ферментолизат селезенки жидкий крупного рогатого скота в расчете на сухое вещество - 7,0; активированный уголь ОУ-А 4,0; агар микробиологический 17,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,4; рН среды 7,1 (Производитель ФГУЗ Рост НИПЧИ Роспотребнадзора. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117).

Контрольный агар Хоттингера. Промышленный регламент №1707-05 на производство питательного агара для культивирования микроорганизмов, готового к применению (агара Хоттингера). Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05571 от 20 августа 2009 г. Срок действия не ограничен.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из кильки, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,10% - 280,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,63; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 0,96; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,18; активированный уголь - 1,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,2; агар микробиологический - 8,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов вырастало в среднем 100 плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,5 мм через 24 ч для обоих штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 45 колоний диаметром 1,0-1,3 мм соответственно, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из кильки, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 300,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,83; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,16; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,4; агар микробиологический - 10,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов вырастало 300 плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0-1,5 мм через 24 ч для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 80 колоний диаметром 1,0-1,3 мм соответственно, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из кильки, разбавленный дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14% - 320,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 1,03; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,36; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,22; активированный уголь - 3,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,6; агар микробиологический - 12,0; дистиллированная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов вырастало 89 плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0-1,5 мм через 24 ч для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 42 колонии диаметром 1,2 мм, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на основе ферментативного гидролизата кильки (пример 2).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для жизнедеятельности легионелл. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат кильки с содержанием аминного азота 0,10-0,14%, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, железо сернокислое закисное 7-водное, активированный уголь, L-цистеина гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить выход биомассы и сократить сроки выращивания легионелл. 3 пр.

Питательная среда для выращивания легионелл, включающая питательную основу, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве основы содержит ферментативный гидролизат кильки с добавлением в среду в качестве стимулирующей добавки железа сернокислого закисного 7-водного при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
ферментативный гидролизат кильки   (0,10-0,14% аминного азота) 280,0-320,0 калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,63-1,03 калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 0,96-1,36 железо сернокислое закисное 7-водное 0,18-0,22 активированный уголь 1,0-3,0 L-цистеин гидрохлорид 0,2-0,6 агар микробиологический 8,0-12,0 дистиллированная вода до 1 л