ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10 г; натрия хлорид 5,0 г; кровь 10 г; агар-агар 15,0-20,0 г, pH 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°C (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С.64-65; С.269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая г/л: экстракт дрожжей - 10,0 г; уголь активированный - 2,0 г; ACES буфер (амино-2-оксиэтил-аминоэтан сульфоновая кислота) - 10,0 г; a-кетоглуторат - 1,0 г; L-цистеин - 0,4 г; железа пирофосфат - 0,25 г; агар-агар 15,0 г; дистиллированная вода до 1 л; pH 6,9±0,2. (М.С.Поляк, В.И.Сухаревич, М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С.268-270).

Недостатком данной среды является дороговизна не производимого в РФ препарата железа пирофосфата растворимого.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат легкого свиньи; 0,01 М калийфосфатный буфер (состав калийфосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1 - замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный); а также активированный уголь; L-цистеин гидрохлорид; дистиллированную воду; агар микробиологический с добавлением в среду стимулятора ферментативного гидролизата арахиса при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9 Калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2 Активированный уголь 2,0 L-цистеин гидрохлорид 0,35 Ферментативный гидролизат арахиса 10,0 Агар микробиологический 10,0 Дистиллированная вода до 1 л.

Легкое свиньи ТУ-8-5344-113607. Биологическая ценность легкого свиньи, относящейся к субпродуктам II категории, состоит в наличии в среднем 13,6% белка, минеральные вещества легкого, состоящего из солей натрия, калия, кальция, фосфора и высокого содержания железа; общее их количество достигает 1%, 0,5-1,4% золы. Легкое содержит также витамины, микроэлементы экстрактивные вещества. Из белковых веществ в легком свиньи при ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты: лизин, метионин, триптофан, цистин, цистеин, треонин, серин, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин. (И.В.Петрухин. Корма и кормовые добавки. Москва: Росагропромиздат.1989. С.-104-108).

Включение в состав среды 0,01 М калийфосфатного буфера (состав калийфосфатного буфера: калий фосфорно-кислый 1 замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный); обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне pH, они малотоксичны. Кроме того, HPO₄ - компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов - М., 1989).

Ферментативный гидролизат арахиса является стимулятором питательной среды ввиду присутствия в нем L-цистеина. Определение L-цистеина и в том числе других аминокислот - лизина солянокислого, аргинина, глутамина, аспарагина, фенилаланина, валина, илейцина, содержащихся в арахисе, осуществляют с помощью метода тонкослойной фроматографии на пластинках силуфол. (А.П.Корешков Основы аналитической химии. Физико-химические (инструментальные) методы анализа. Изд. «Химия». 1970. - 472 с.)

При приготовлении питательной среды используют только дистиллированную воду, без применения растворов, содержащих ионы натрия, ввиду их губительного действия на легионеллы.

Сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых культур через 48 ч.

Легионеллы являются факультативными внутриклеточными паразитами, поэтому растут в желточном мешке куриных эмбрионов, в культуре клеток животных и человека (фибробласты легкого). (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник для студентов медицинских вузов / Под редакцией А.А.Воробьева. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. - С.400).

В отличие от прототипа предлагаемая среда экономична, выгодна и обеспечивает оптимальные условия для размножения легионелл за 48 ч.

Приготовление ферментативного гидролизата легкого свиньи

Легкое свиньи в количестве 1 кг режут на кусочки размером 2×2 см, ссыпают в эмалированную кастрюлю, заливают водопроводной водой в количестве 1,5 л, варят в течение 10 мин, остужают до 46°C. Отвар сливают в 3 л стеклянный баллон. Остывшие кусочки легкого пропускают через мясорубку, затем помещают в баллон с отваром. Фермент панкреатин в количестве 9,5 г/л (или поджелудочную железу крупного рогатого скота, дважды пропущенную через мясорубку из расчета 150 г/кг) помещают в баллон с фаршем легкого и отваром его. Доводят pH до 8,2±0,1 с помощью калия гидроокиси по фенолфталеину. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 37±1°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие через 1,5-2,0 ч по 5 мин. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,5%-0,6%. После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°C.

Ферментативный гидролизат арахиса готовят следующим образом:

семена арахиса в количестве 0,5 кг тщательно промывают в проточной питьевой воде (предварительно поместив их в марлю). Промытые семена арахиса измельчают в мясорубке, перекладывают в стеклянную емкость и добавляют 1,5 л питьевой воды в соотношении (1:3), подогретой до температуры 45±1°C. Доводят pH до 8,2±0,3 с помощью калия гидроокиси в количестве 3,0±0,1 г/л по фенолфталеину. Затем загружают 0,27 кг дважды пропущенную через мясорубку поджелудочную железу крупного рогатого скота. К объему содержимого баллона добавляют 1% хлороформа. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой с пергаментом, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 45±1°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 15±1 мин по 5 мин, а в последующие через 2,0 ч по 5 мин. Динамику ферментативного процесса контролируют по нарастанию аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,4%-0,5%. Показатель сухого остатка равен 7%. На 9-10 сутки увеличение данного показателя прекращается, термокамеру отключают, гидролизат отстаивают в течение 2 суток. Затем фильтруют через фильтровальное полотно. Фильтрат добавляют 1% хлороформа, пробкуют резиновой пробкой, хранят при температуре от 2 до 8°C в холодовой камере. Используют по мере необходимости.

Питательную среду на ферментативной основе легкого свиньи для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 260,0 мл, другие ингредиенты в соотношении, г/л: калий фосфорнокислый 1 замещенный - 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,2; активированный уголь - 2,0; агар микробиологический - 8,5; дистиллированную воду до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, pH корректируют раствором соляной кислоты (1:1) в количестве 5 мл до pH 6,8±0,1. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный в кипящей водяной бане и остуженный до 56°C агар добавляют L-цистеин гидрохлорид 0,35 г, ферментативный гидролизат арахиса 10,0 мл, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза» (Москва, 2007), с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophilla АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophilla ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара контрольной среды СЭЛ pH 6,8 при температуре 37°C 24 ч. Из суточных культур готовили 1 млрд взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А. Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 (10^-6) и 100 м.к. (10^-7). Из данных разведении взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного испытуемого агара, на среду СЭЛ и агар Хоттингера. Посевы инкубировали при 37°C в течение 5 суток. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчета выросших колоний.

Контрольная среда СЭЛ (Питательная среда для культивирования и выделения возбудителя легионеллеза элективная) - состав г/л: питательная основа животного происхождения - ферментолизат селезенки жидкий крупного рогатого скота в расчете на сухое вещество - 7,0; активированный уголь ОУ-А 4,0; агар микробиологический 17,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,4; pH среды 7,1 (Производитель ФГУЗ Рост НИПЧИ Роспотребнадзора. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117).

Контрольный агар Хоттингера. Промышленный регламент №1707-05 на производство питательного агара для культивирования микроорганизмов, готового к применению (агара Хоттингера). Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05571 от 20 августа 2009 г. Срок действия не ограничен.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,100 мг% - 240,0 мл; калий фосфорнокислый 1 - замещенный - 0,7; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,0; активированный уголь - 1,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,25; ферментативный гидролизат арахиса - 8,0; агар микробиологический - 8,0; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов вырастало в среднем 22 и 2 плосковыпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,5 мм через 48 ч для обоих штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 19 и 2 соответственно, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,120 мг% - 260,0 мл; калий фосфорнокислый 1- замещенный - 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,2; активированный уголь - 2,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,35; ферментативный гидролизат арахиса - 10, агар микробиологический - 10,0; дистиллированная вода - до 1 л. При таком соотношении ингредиентов вырастало 86 и 8 плосковыпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,5 мм через 48 ч для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 60 и 6 соответственно, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,140 мг% - 280,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 1,1; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 2,4; активированный - 3,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,45; ферментативный гидролизат арахиса - 12,0; агар микробиологический - 12,0; дистиллированная вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов вырастало 15 и 5 плосковыпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,5 мм через 48 ч для обоих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 11 и 1, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на основе ферментативного гидролизата легкого свиньи (пример 2).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении питательных сред, которые создают оптимальные условия для жизнедеятельности легионелл. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат легкого свиньи, ферментативный гидролизат арахиса, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду. Изобретение позволяет сократить срок выявления легионелл.

Питательная среда для культивирования легионелл, содержащая питательную основу, калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный; активированный уголь; L-цистеин гидрохлорид; агар микробиологический; дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит в качестве стимулятора ферментативный гидролизат арахиса, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат легкого свиньи при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0 калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9 калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 2,2 активированный уголь 2,0 L-цистеин гидрохлорид 0,35 ферментативный гидролизат арахиса 10,0 агар микробиологический 10,0 дистиллированная вода до 1 л