ОБОГАЩЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г; кровь 10,0 г; агар-агар 15,0-20,0 г, рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°C (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 64-65; С. 269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая, г/л: ферментативный гидролизат легкого свиньи 260,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеина гидрохлорид 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 2,5; агар микробиологический 8,5; дистиллированная вода до 1 л (Патент РФ №2412240. Опубл. 20.02.2011. Бюл. №5).

Недостатком данной среды является относительно высокая себестоимость.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота; 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный), а также активированный уголь; L-цистеин гидрохлорид; дистиллированную воду; агар микробиологический, с добавлением в среду в качестве стимулирующей добавки - железа сернокислого закисного 7-водного при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат эритромассы крупного   рогатого скота (0,10-0,14% аминного азота) 170,0-210,0 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,63-1,03 Калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 0,96-1,36 Железо сернокислое закисное 7-водное 0,18-0,22 Активированный уголь 1,0-3,0 L-цистеин гидрохлорид 0,2-0,6 Агар микробиологический 8,0-12,0 Дистиллированная вода до 1 л

Биологическая ценность эритромассы крупного рогатого скота состоит в наличии в среднем 95% протеина и макроэлементов, мг/кг: калия 0,12%, магния 0,04%; серы 0,02%; хлора 0,15%; фтора 0,8; железо находится в крови в виде органического соединения в молекуле гемоглобина, содержание его в крови равно 50-60 мг%, содержание витаминов, мг/кг: каротина 2,0; витамина B₁ 1,6; витамина В₂ 8,0; пантотеновой кислоты 55; витамина В₅ 3,0; содержание аминокислот, г/кг: аргинина 8,0; гистидина 3,0; лейцина 11,0; изолейцина 9,0; фенилаланина 7,0; треонина 6,0; валина 10,0; микроэлементов, мг/кг: цинка 14,0; марганца 0,8; меди 0,8; кобальта 0,07 (И.В.Петрухин. Корма и кормовые добавки. М.: Росагропромиздат, 1989. С. 39-44; 48).

Железо сернокислое закисное 7-водное ГОСТ 4148-78. Железо (II) сульфат. Показатели качества: хч, чда, ч. Массовая доля основного вещества ≥99,0% (Химические реактивы и высокочистые вещества. Каталог. / О.А.Гольдина, Ю.С.Кузнецова, Т.Г.Иванова и др. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Химия, 1990. С. 212). В ходе многочисленных экспериментов первых исследователей по культивированию легионелл было обнаружено, что важнейшими факторами роста легионелл являются как аминокислоты, так и ионы железа (Легионеллезная инфекция / Н.Д.Темежникова, И.С.Тартаковский. М.: Медицина, 2007. - С.42; 120).

Включение в состав среды 0,01 М калий фосфатного буфера (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1 замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны. Кроме того, HPO₄ компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, нуклеотидов (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов. - М., 1989).

Ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота является основой питательной среды ввиду присутствия в нем 95% протеина, а это значит содержание большого количества витаминов, макро- и микроэлементов, железа, а также аминокислот, которые играют огромную роль в жизнедеятельности любых микроорганизмов.

При приготовлении питательной среды используют только дистиллированную воду, без применения растворов, содержащих ионы натрия, в виду их губительного действия на легионеллы.

Сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых культур сплошного роста через 24 ч при посеве 100 м.к.

В отличие от прототипа предлагаемая среда обеспечивает оптимальные условия для размножения легионелл за 24 ч, а получение гидролизата осуществляется за 4,5 ч.

Приготовление ферментативного гидролизата эритроцитарной массы крупного рогатого скота.

Размороженную эритроцитарную массу крупного рогатого скота в количестве 250,0 мл вливают в 3-литровый стеклянный баллон, заливают питьевой водой 1,750 л, подщелачивают 20% раствором гидроокиси калия до рН 8,2 в количестве 13 мл по фенолфталеину, затем добавляют коммерческий фермент панкреатин в количестве 12,0 г активностью 45 ед. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 50±2°C. Содержимое баллона в течение первых суток перемешивают через 20±1 мин по 5 мин, в последующие 4,5 ч через 1,5-2,0 ч по 5 мин. В течение первого часа через каждые 15 мин измеряют рН, при изменении рН в кислую сторону обязательно корректируют рН 40% раствором гидроокиси калия до значения 8,0-8,2. После первого часа значение рН не измеряют. Через 4 ч ведут забор пробы в количестве 10 мл на определение аминного азота и по достижении аминного азота до 260±40 мг% гидролиз прекращают. В результате гидролиз идет в течение 4,5 ч с момента загрузки панкреатина. Ввиду резкого падения рН до 5 ед - добавляют 30 мл 20% гидроокиси калия до рН 8,2 по фенолфталеину. После этого гидролиз останавливают и отстаивают в течение 2х суток. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°C.

Питательную среду на ферментативной основе эритромассы крупного рогатого скота для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 190,0 мл, другие ингредиенты в соотношении, г/л: калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,83; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,16; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; агар микробиологический - 10,0; дистиллированную воду - до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) в количестве 1,0 мл до рН 6,9±0,5. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 1 атм в течение 15 мин. В расплавленный на водяной бане и остуженный до 56°C агар добавляют L-цистеина гидрохлорида 0,4 г, простерилизованного автоклавированием при 112°C в течение 30 мин, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Соляную кислоту ГОСТ-3118-77 (чда, хч) используют для установления рН. Массовая доля основного вещества, % 35-38.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза», (Москва, 2007), с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophilla АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophilla ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара контрольной среды СЭЛ рН 6,8 при температуре 36°C 24 ч. Из суточных культур готовили в стерильном 0,01 М калий фосфатном буфере 1 млрд. взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85П (рН 6,8) ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в калий фосфатном буфере в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 1000 (10^-6). Из данных разведений взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного испытуемого агара, и на контрольные среды СЭЛ и агар Хоттингера (отрицательный контроль - на нем нет роста в любые сроки наблюдения). Посевы инкубировали при 36±1°C в течение 5 суток. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчета выросших колоний.

Контрольная среда СЭЛ (Питательная среда для культивирования и выделения возбудителя легионеллеза элективная) - состав, г/л: питательная основа животного происхождения - ферментолизат селезенки жидкий крупного рогатого скота в расчете на сухое вещество - 7,0; активированный уголь ОУ-А 4,0; агар микробиологический 17,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6; калий фосфорнокислый двузамещенный трехводный 3,4; рН среды 7,1 (Производитель ФГУЗ Рост НИПЧИ Роспотребнадзора. 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117).

Контрольный агар Хоттингера. Промышленный регламент №1707-05 на производство питательного агара для культивирования микроорганизмов, готового к применению (агара Хоттингера). Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05571 от 20 августа 2009 г. Срок действия не ограничен.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,10% - 170,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,63; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 0,96; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,18; активированный уголь - 1,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,2; агар микробиологический - 8,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов вырастало 100 плосковыпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 48 ч для обеих штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний диаметром 1,0 мм, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 190,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 0,83; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1.16; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,2; активированный уголь - 2,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,4; агар микробиологический - 10,0; дистиллированная вода - до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов наблюдался сплошной рост в виде голубовато-серого налета через 24 ч для обеих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве 100 колоний диаметром 1,2 мм соответственно, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14% - 210,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 1,03; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный - 1,36; железо сернокислое закисное 7-водное - 0,22; активированный уголь - 3,0; L-цистеин гидрохлорид - 0,6; агар микробиологический - 12,0; дистиллированная вода до 1 л.

При таком соотношении ингредиентов вырастало 92 плосковыпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,0 мм через 48 ч для обеих тест-штаммов, взятых в опыт, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч в количестве менее 50% колоний, а на агаре Хоттингера рост отсутствовал.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на основе ферментативного гидролизата эритромассы крупного рогатого скота (пример 2).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для жизнедеятельности легионелл. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат эритромассы крупного рогатого скота с содержанием 0,10-0,14% аминного азота, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, железо сернокислое закисное 7-водное, L-цистеина гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания легионелл. 3 пр.

Обогащенная питательная среда для выращивания легионелл, включающая питательную основу, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, активированный уголь, L-цистеин гидрохлорид, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат эритромасы крупного рогатого скота, а в качестве стимулирующей добавки - железо сернокислое закисное 7-водное, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Ферментативный гидролизат   эритромассы крупного рогатого скота   (с содержанием 0,10-0,14% аминного азота) 170,0-210,0 Калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,63-1,03 Калий фосфорнокислый 2-замещенный   3-водный 0,96-1,36 Железо сернокислое закисное 7-водное 0,18-0,22 Активированный уголь 1,0-3,0 L-цистеин гидрохлорид 0,2-0,6 Агар микробиологический 8,0-12,0 Дистиллированная вода До 1 л