СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ КАК ПЕРЕНОСЧИКА РНК ЧЕРЕЗ БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/68 A61K47/44 A61K31/7105 

Изобретение относится к области биохимии и фундаментальной медицины, в частности к средствам, облегчающим первичный скрининг потенциальных лекарственных препаратов, и может быть использовано, например, для подбора эффективных переносчиков РНК через биологические мембраны.

Прогресс в области молекулярной биологии и биотехнологии в последние десятилетия позволил медицине вплотную приблизиться к лечению наследственных болезней путем управления экспрессией генов с помощью чужеродной РНК. Осталась нерешенной проблема направленной доставки этой РНК внутрь клеток через биологические мембраны. Предлагают использовать с этой целью наночастицы алмазов и окислов некоторых металлов, аполипопротеин А-1 и др. Выбрать лучшее из предложенного трудно, поскольку для регистрации трансмембранного переноса авторы используют качественные и полуколичественные методы. В частности, известен и широко применяется флуоресцентный метод, основанный на присоединении флуоресцирующего красителя к РНК, инкубации этого комплекса в присутствии переносчика с суспензией клеток и последующего наблюдения свечения в клетках с помощью микроскопа [см., напр. 1]. Результат анализа качественный.

Целью настоящего изобретения является создание простого, но полноценного количественного метода для оценки эффективности переносчиков РНК через биологические мембраны.

Цель достигается тем, что в качестве модели для такой оценки используются сочные мешочки спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus со спектрофотометрическим определением РНК в клетках и окружающем растворе.

Пример осуществления предлагаемого способа

Препарат Виталанг-1, представляющий собой чистую высокополимерную дрожжевую РНК с теоретической весовой экстинкцией 20,0 ОЕ₂₆₀/мг, выделяли по методу [2].

Препарат Виталанг-2 с весовой экстинкцией 17,8 ОЕ₂₆₀/мг выделяли по методу [3]. Препарат содержит в своем составе 10,8% олеиновой кислоты.

Для определения способности препаратов Виталанг-1 и Виталанг-2 проникать через биологические мембраны в 3 одинаковых стеклянных флакончика на 6 мл с завинчивающимися пробками помещали по 7 продолговатых сочных мешочков спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus и заливали их:

1-й - 4,8 мл водного раствора Виталанга-1 (27,3 ОЕ₂₆₀/мл),

2-й - 4,8 мл водного раствора Виталанга-2 (27,1 ОЕ₂₆₀/мл),

3-й - 4,8 мл дистиллированной воды.

Через 22 ч инкубации при комнатной температуре замеряли оптическую плотность растворов в 1-ом и 2-ом флакончиках против 3-го. Получилось: в 1-ом - 26,4 ОЕ₂₆₀/мл, во 2-ом - 22,9 ОЕ₂₆₀/мл.

Т.е. клетки поглотили Виталанга-2 в 4,7 раза больше, чем Виталанга-1. Далее растворы из флакончиков сливали и промывали каждый 5-ю порциями по 5 мл дистиллированной воды. Замерив оптическую плотность 5-й порции из 1-го и 2-го флакончика против 3-го, получили:

в 1-ом - 0,024 ОЕ₂₆₀/мл,

во 2-ом - 0,019 ОЕ₂₆₀/мл.

Сочные мешочки во всех 3-х флакончиках измельчали стеклянной палочкой, из полученных суспензий отбирали по 100 мкл раствора и, разбавив его в 50 раз дистиллированной водой, замеряли оптическую плотность растворов из 1-го и 2-го флакончика против 3-го. Получилось:

в 1-ом - 0,065 ОЕ₂₆₀/мл,

во 2-ом - 0,318 ОЕ₂₆₀/мл.

Т.е. Виталанг-2 проникает через биологические мембраны минимум в 4,9 раза эффективнее Виталанга-1, при этом спектры поглощения извлеченной из сочных мешочков РНК идентичны таковым для исходных соединений.

Таким образом, предложенный метод позволяет количественно оценить способность переносчика (в нашем случае олеиновой кислоты) транспортировать РНК через биологические мембраны. Для более точной количественной оценки эффективности переносчика нетрудно снять и соответствующие кинетические кривые.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).

Источники информации

1. Зубжицкий Ю.Н. Метод люминесцентной микроскопии в микробиологии, вирусологии и иммунологии, Л., 1964.

2. Патент RU 2392328 С2, 10.10.2009.

3. Патент RU 2403288 С1, 10.11.2010.

Изобретение относится к области биохимии. Проводят количественную оценку эффективности олеиновой кислоты как переносчика РНК через биологические мембраны. В качестве биологической мембраны используют клетки сочных мешочков спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus. В качестве переносчика РНК используют олеиновую кислоту, содержащуюся в препарате Виталанг-2 в количестве 10,8% и составляющую комплекс с РНК. Для сравнения используют препарат Виталанг-1, содержащий чистую РНК. Клетки помело заливают раздельно водными растворами препаратов Виталанг-1, Виталанг-2 и дистиллированной водой в количестве по 4,8 мл в каждом флакончике. Инкубируют в течение 22 ч при комнатной температуре. С помощью спектрофотометра измеряют оптическую плотность растворов против дистиллированной воды, определяя содержание РНК в клетках помело и окружающем растворе. В результате сравнения полученных значений оптической плотности растворов делают вывод о том, что Виталанг-2 проникает через биологические мембраны в 4,7-4,9 раза эффективнее Виталанга-1. Устанавливают, что спектры поглощения извлеченной из сочных мешочков РНК идентичны таковым для исходных соединений. Изобретение позволяет оценить эффективность олеиновой кислоты, используемой в качестве переносчика РНК через биологические мембраны. 1 пр.

Способ количественной оценки эффективности олеиновой кислоты как переносчика РНК через биологические мембраны, представляющие собой клетки сочных мешочков спелой пульпы плода медового помело из рода Citrus, характеризующийся тем, что в качестве переносчика РНК используют олеиновую кислоту, содержащуюся в препарате Виталанг-2 в количестве 10,8 %, для чего указанные клетки заливают раздельно водными растворами препаратов Виталанг-1, Виталанг-2 и дистиллированной водой в равных количествах, инкубируют в течение 22 ч при комнатной температуре, с помощью спектрофотометра измеряют оптическую плотность РНК в указанных клетках и окружающем растворе с последующей оценкой эффективности.