СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ С РЕАКЦИЯМИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА В ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ Российский патент 2013 года по МПК A61K35/00 A61P37/00 

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности, в частности к препаратам на основе дрожжевой РНК, влияющих либо на гуморальный (Th2), либо на клеточный (Th1) иммунный ответ.

По традиционным представлениям иммуноактивные соединения разделяются на иммуностимуляторы и иммунодепрессоры. Однако современные знания о патогенезе многих заболеваний, связанных с нарушением межклональных взаимоотношений за счет расстройства Th1/Th2 регуляторных влияний и баланса соответствующих цитокинов, выдвигают требования к поиску препаратов, проявляющих при первичном скрининге in vivo на интактных животных, разнонаправленное влияние на интегральные показатели - антителообразование и реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) или оказывающие влияние либо только на Th2, либо только на Th1 иммунитет.

В клинической практике для лечения заболеваний с реакциями ГЗТ в патогенетическом процессе (туберкулез, проказа, шистосомоз, саркоидоз и болезнь Крона) особенно ценны препараты, стимулирующие Th2 и одновременно подавляющие Th1 иммунный ответ.

Однако лечебных препаратов с такими свойствами практически нет.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного препарата для лечения заболеваний с реакциями ГЗТ в патогенетическом процессе с использованием доступных и недорогих компонентов.

Цель достигается тем, что в качестве такого препарата используется легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный комплекс высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеиновой кислотой при следующем соотношении компонентов: высокополимерная РНК - 80-90%, олеиновая кислота - 10-20% (предлагаемое рыночное название - Виталанг-2).

Пример осуществления предлагаемого способа

Животные

В работе использовали здоровых половозрелых животных - мышей гибридов CBF1 обоего пола, 10-12 недельного возраста, массой тела 22-23 г, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [1]. Все исследования проводили в одно и то же время суток (утром).

Препарат Виталанг-2

Виталанг-2 получали по способу [2], стерилизовали по методу [3], растворяли в день проведения эксперимента в воде для инъекций, встряхивая суспензию 15-30 мин до полного растворения РНК.

Оценку иммуноактивных свойств Виталанга-2 проводили в соответствии с методическими материалами [4] и методическими рекомендациями [5].

Выделение органов, тканей и клеток выполняли по стандартным методикам [6].

Гуморальный иммунный ответ на эритроциты барана (ЭБ) (число IgM- и IgG-антителообразующих клеток (АОК) в селезенке) оценивали на пике ответа, свойственного данному генотипу, по количеству локальных зон гемолиза после внутривенного введения 2·10⁸ ЭБ [7-9]. Все процедуры с клетками проводили на льду.

Для определения числа IgM-AOK инкубационную смесь, состоящую из клеток селезенки, ЭБ и комплемента, помещали в стеклянные камеры и инкубировали 1,5 ч при 37°C. Виталанг-2 в различных дозах в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). В день последнего введения препарата животных иммунизировали внутривенно ЭБ в дозе (4·10⁸/мл). Количество IgM-AOK в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом [9]. Результаты выражали в абсолютном количестве IgM-AOK в селезенке.

Для определения числа IgG-AOK добавляли антисыворотку против IgG мыши и инкубировали в термостате 2 ч. Зоны гемолиза подсчитывали под бинокулярной лупой (увеличение - ×42). Виталанг-2 в различных дозах в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). В день последнего введения препарата проводили первичную иммунизацию 0,1% ЭБ в объеме 0,5 мл внутривенно. Количество IgG-AOK в селезенке (первичный иммунный ответ) определяли на 9-е сутки после иммунизации. Для определения количества IgG-AOK в селезенке (вторичный иммунный ответ) через 30 дней после первичной иммунизации проводили вторичную иммунизацию 2% ЭБ внутривенно. Количество IgG-AOK определяли в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сутки после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза [9]. Клетки селезенки инкубировали 2 ч при 39°C в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисывороткой против мышиного IgG (разведение в 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитывали под увеличением - ×42. Результаты выражали в абсолютном количестве IgG-AOK в селезенке.

Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции ГЗТ: измеряли величину отека лапки после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным; сенсибилизирующая доза - 2,5·10⁷ ЭБ/мышь внутрибрюшинно, разрешающая доза - 5·10⁸ ЭБ/мышь под подошвенный апоневроз задней лапки на 4 сут, контроль - контралатеральная лапка, в которую вводили среду в том же объеме. Виталанг-2 в различных дозах в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). Для оценки влияния препарата на сенсибилизацию в день последнего введения Виталанга-2 мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл, на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапки (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контралатеральную лапку вводили растворитель в том же объеме. Для оценки влияния препарата на эффекторную фазу Виталанг-2 вводили в день проведения сенсибилизации и далее в течение 4-х дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ [10]. Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах.

Статистическую обработку данных по числу АОК, имеющему распределение, отличное от нормального, проводили по непараметрическому критерию U Манна-Уитни [11].

Результаты исследований

В табл.1 представлены данные о влиянии препарата Виталанг-2, введенного в индуктивную фазу первичного гуморального иммунного ответа, на количество IgM-AOK в селезенке мышей. Как видно из таблицы, введение Виталанга-2 в индуктивную фазу первичного гуморального иммунного ответа достоверно увеличивает в селезенке количество АОК, синтезирующих IgM антитела. В табл.2 представлены данные о влиянии препарата Виталанг-2, введенного в индуктивную фазу первичного и вторичного гуморального иммунного ответа, на количество IgG-AOK в селезенке мышей. Как видно из таблицы, введение Виталанга-2 в индуктивную фазу иммунного ответа (перед первичной иммунизацией) достоверно стимулирует вторичный гуморальный иммунный ответ.

В табл.3 представлены данные о влиянии препарата Виталанг-2, введенного в индуктивную и эффекторные фазы развития реакции ГЗТ, на выраженность клеточного иммунного ответа. Как видно из таблицы, Виталанг-2 оказывает иммунодепрессивное действие на выраженность клеточного иммунного ответа (дозозависимое подавление эффекторной фазы реакции ГЗТ и выраженное подавление фазы сенсибилизации в дозе 100 и 200 мг/кг).

Оценивая полученные результаты, следует отметить, что препарат Виталанг-2 оказывает разнонаправленное влияние на гуморальный и клеточный иммунный ответ: стимулирует антителообразование (Th2 ответ) и подавляет Th1 ответ. Перспективно проведение испытаний данного препарата для лечения заболеваний с реакциями ГЗТ в патогенетическом процессе (туберкулез, проказа, шистосомоз, саркоидоз и болезнь Крона). Терапевтическая доза - 50 мг/кг массы тела животного или человека.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).

Источники информации

1. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Страсбург, 1986.

2. Патент RU 2403288 C1, 10.11.2010.

3. Патент RU 2397988 C1, 27.08.2010.

4. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств. М., 1984.

5. Методические рекомендации по оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств. М., 1992.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П.; Под ред. Новицкого В.В. Методы культуры ткани в гематологии - Томск: Издательство Томского университета, 1992. - 272 с.

7. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. // Science. - 1963. - Vol.140. - P.405.

8. Sterzl J., Riha I. Detection of cells producing 7S antibodies by the plaque technique. // Nature. - 1965. - V.208. - P.858-859.

9. Cunningham A.J., Szenberg A. Further improvements in the plaque technique for detecting single antibody-forming cells. // Immunol. - 1968. - V.14. - P.599-600.

10. Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto T., Nomoto K., Takeya T. Effect of stimulation and blocade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad rection to SRBC in mice. // Immunology. - 1979. - Vol.8. - P.577-583.

11. Гублер E.B. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л., 1978. с.68-91.

Таблица 1 Влияние препарата Виталанг-2 на первичный (IgM-АОК) гуморальный иммунный ответ на Т-зависимый антиген у мышей CBF1 (n=5 в каждой группе) Группы Число IgM-АОК /селезенку Контроль 13703 Виталанг-2: 10 мг/кг 14134 50 мг/кг 35723* 100 мг/кг 28989* 200 мг/кг 29762* *p<0,05 относительно контроля

Таблица 2 Влияние препарата Виталанг-2 на количество IgG-AOK при первичном и вторичном гуморальном иммунном ответе у мышей CBF1 (n=5 в каждой группе) Группы Число IgG-АОК (первичный ответ)/селезенку Число IgG-АОК (вторичный ответ)/селезенку Контроль 1924 863535 Виталанг-2: 0,5 мг/кг 1471 813651 50 мг/кг 1237 903383 100 мг/кг 1731 1038565* 200 мг/кг 1934 927254 *p<0,05 относительно контроля

Таблица 3 Влияние препарата Виталанг-2 на клеточный иммунный ответ (реакцию ГЗТ) у мышей CBF1 (n=5 в каждой группе) Группы Введение препарата до сенсибилизации (%) Введение препарата после сенсибилизации (%) Контроль 34,4 44.3 Виталанг-2: 10 мг/кг 31,8 -8% 37,8 -15% 50 мг/кг 37,7 +9% 38,2 -14% 100 мг/кг 25,2 -27% 29,8 -33% 200 мг/кг 23,1 -33% 26,7 -40%

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности. Средство для лечения заболеваний с реакциями гиперчувствительности замедленного типа в патогенетическом процессе представляет собой легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный комплекс высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеиновой кислотой при следующем соотношении компонентов: высокополимерная РНК - 80-90%, олеиновая кислота - 10-20%. Предлагаемое рыночное название - Виталанг-2. Средство оказывает разнонаправленное влияние на гуморальный и клеточный иммунный ответ: стимулирует антителообразование (Th2 ответ) и подавляет Th1 ответ. Перспективно для апробирования при лечении заболеваний с реакциями ГЗТ в патогенетическом процессе (туберкулез, проказа, шистосомоз, саркоидоз и болезнь Крона). Терапевтическая доза - 50 мг/кг массы тела животного или человека. Изобретение обеспечивает создание эффективного препарата для лечения заболеваний с реакциями гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в патогенетическом процессе с использованием доступных и недорогих компонентов. 1 пр., 3 табл.

Средство для лечения заболеваний с реакциями гиперчувствительности замедленного типа в патогенетическом процессе - легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный комплекс высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеиновой кислотой при следующем соотношении компонентов: высокополимерная РНК - 80-90%, олеиновая кислота - 10-20%.