СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПАРАБЕНОВ (ЭФИРОВ 4-ГИДРОКСИБЕНЗОЙНОЙ КИСЛОТЫ) В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ, КОСМЕТИКЕ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ Российский патент 2014 года по МПК G01N30/00 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в химической, косметической, фармацевтической и других отраслях промышленности при анализе парабенов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Постоянно растущие потребности человечества обуславливают увеличение темпов создания и потребления пищевых продуктов, фармацевтических препаратов, изделий косметической промышленности. Это обуславливает необходимость использования в подобном производстве широкого круга химических добавок, обеспечивающих их длительную сохранность. Одними из таких добавок являются парабены. Основное преимущество парабенов в сравнении с иными консервирующими агентами, такими как бензойная, салициловая, сорбиновая кислоты - независимость степени консервирующего действия от величины pH продукта, в котором они используются. Характерной особенностью пищевых продуктов, фармацевтических препаратов, косметики является их тесный контакт с различными тканями и органами человеческого организма (желудочно-кишечными трактом, кожей, кровью и т.д.), который облегчает проникновение в организм нежелательных химических соединений. Данные исследований показывают, что парабены могут оказывать цитотоксический и канцерогенный эффект на ткани организма человека (Sony M.G., Carabin I.G., Burdock G.A. Safety assessment of esters of 4-hydroxibenzoic acid (parabens). Food and Chem. Toxicol., 2005, vol.43, P.985-1015).

Изобретение позволяет проводить идентификацию и количественный анализ парабенов при использовании спектрофотометрического или (и) диодно-матричного детекторов. Способ включает процедуры подготовки образцов и условия хроматографического разделения и детектирования. Исходный образец пищевого продукта, косметического изделия, фармацевтического препарата или БАДа предварительно подготавливают согласно одной из процедур пробоподготовки (процедуры 1-4) и затем подвергают хроматографическому разделению на жидкостном хроматографе.

Известен способ определения парабенов в сое методом капиллярной газовой хроматографии CN 102323367 (A) - 2012-01-18, включающий в себя взвешивание образца, добавление раствора внутреннего стандарта в образец, подкисление, экстракцию эфиром, обезвоживание и газохроматографический анализ. Недостатками указанного способа является узкий круг объектов (образцы сои), для которого применим данный подход.

Canosa с соавторами предложили способ газохроматографического анализа парабенов с применением масс-селективного детектора (Canosa P., Rodriguez I., Rubi E., and Cela R.. Determination of Parabens and Triclosan in Indoor Dust Using Matrix Solid-Phase Dispersion and Gas Chromatography with Tandem Mass Spectrometry, Anal. Chem., vol.79, 2007, P.1675-1681). Наряду с высокой чувствительностью и селективностью способ требует проведения процедуры получения производных (дериватизации) с N-метил-N-(трет-бутилдиметилсилил)трифторацетамидом, в связи с чем возникает необходимость контроля полноты получения производных. Более того использование дериватизирующих агентов и масс-спектрометрического детектора существенно увеличивают себестоимость анализа, что осложняет его внедрение в производственную практику.

Известен способ определения парабенов методом ВЭЖХ, предложенный Borremans M. с соавторами (Borremans M., Loco J. Van., Roos P., Goeyens L. Validation of HPLC Analysis of 2-Phenoxyethanol, 1-Phenoxypropan-2-ol, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl and Benzyl 4-Hydroxybenzoate (Parabens) in Cosmetic Products, with Emphasis on Decision Limit and Detection Capability. Chromatographia, 2004, vol.49, P.47-53). Способ предлагает определение парабенов в косметической продукции с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии после экстракции водно-этанольным раствором и ультразвуковым воздействием. Недостатками такого подхода являются невозможность определения метилпарабена при наличии в составе образца сорбиновой кислоты, а также довольно узкий круг объектов анализа (косметические изделия).

Предложенный Куликовым с соавторами (Kulikov A.U., Verushkin A.G. Simultaneous Determination of Paracetamol, Caffeine, Guaifenesin and Preservatives in Syrups by Micellar LC. Chromatographia, 2008, vol.67, P.347-355), выбранный в качестве прототипа метод ион-парной (мицеллярной) ВЭЖХ дает возможность определения только метил- и пропилпарабена, в то время как анализ этилпарабена не описывается.

Данное изобретение позволяет в одном анализе проводить качественное и количественное определение четырех интересуемых соединений: метилого, этилового, пропилового и бутилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты (парабенов) при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенно-фазовом сорбенте с использованием спектрофотометрического или (и) диодно-матричного детекторов в образцах пищевых продуктов, косметических изделий, фармацевтических препаратов и биологически активных добавок с предварительной пробоподготовкой.

Предложенный способ отличают: отсутствие необходимости в получении производных, сравнительно быстрая пробоподготовка и хроматографический анализ, относительно низкая себестоимость анализа, идентичность условий хроматографического анализа для всех типов исследуемой продукции, что уменьшает время подготовки системы между анализами, возможность применения дополнительных критериев для идентификации парабенов (сигнальные отношения или (и) электронные спектры).

Технический результат достигается за счет того, что в способе хроматографического анализа парабенов (эфиров 4-гидроксибензойной кислоты) в продуктах питания, косметике, фармацевтических препаратах и биологически активных добавках производится проведение пробоподготовки исследуемого образца, применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенно-фазовом сорбенте с использованием спектрофотометрического детектора или (и) диодно-матричного детектора, расчете концентрации парабенов, по полученной величине сигналов согласно изобретению для пищевых продуктов пробоподготовка включает в себя взвешивание, экстракцию водно-органической смесью растворителей, количественный перенос навески в мерную посуду, осаждение мешающих соединений, фильтрацию, разбавление полученного фильтрата; количественный расчет концентрации парабенов проводится методом внешнего стандарта, учитывая линейный диапазон зависимости выходного сигнала от концентрации или массы стандартных растворов.

При анализе образцов косметики и фармацевтических препаратов на жировой основе пробоподготовка включает в себя взвешивание образца, экстракцию этилацетатом, очистку на колонке с силикагелем, упаривание растворителя под вакуумом, растворение сухого остатка в подвижной фазе.

При анализе твердых фармацевтических препаратов, субстанций и твердых и сыпучих биологически активных добавок пробоподготовка включает в себя взвешивание образца, экстракцию этилацетатом, фильтрование, обезвоживание фильтрата, упаривание растворителя под вакуумом, растворение сухого остатка в подвижной фазе.

При анализе жидких и суспензионных фармацевтических препаратов и жидких биологически активных добавок пробоподготовка включает в себя разведение образца и фильтрование.

На фигурах приведены результаты применения способа к различным типам исследуемого объекта:

Фиг.1. Хроматограмма фармацевтического препарата «Маалокс».

Фиг.2. Хроматограмма косметического крема Proteskin.

На фиг.1 обозначены 1-метилпарабен, 2-пропилпарабен. На фиг.2 обозначен 1-метилпарабен.

Способ осуществляется следующим образом. Перед проведением хроматографического разделения проводят подготовку образцов согласно нижеприведенным процедурам.

Процедура 1. Для образцов пищевых продуктов применяется следующая процедура подготовки образцов.

Взвешивание продукта. 2 г продукта с точностью до третьего знака, экстракция 50 см³ водно-ацетонитрильной смеси (50:50 об.%), количественный перенос навески в мерную посуду вместимостью 100 см³, осаждение мешающих соединений растворами Карреза, доведение водой до метки, фильтрация, десятикратное разбавление полученного фильтрата. Конечный фильтрат пропускают через мембранный фильтр.

Процедура 2. Для образцов косметики и фармацевтических препаратов на жировой основе.

Взвешивание продукта. 2 г продукта с точностью до третьего знака, гомогенизация, троекратная экстракция 25 см³ этилацетата, очистка на колонке с содержанием 10 г силикагеля, упаривание растворителя под вакуумом, растворение сухого остатка в 2 см³ подвижной фазы, дополнительная очистка от гидрофобных соединений двойной экстракцией гексаном по 1 см³.

Процедура 3. Для твердых фармацевтических препаратов, субстанций и твердых и сыпучих биологически активных добавок.

Размельчение образца в ступке, взвешивание продукта. 2 г продукта с точностью до третьего знака, экстракция 15 см³ этилацетата трижды, обезвоживание экстракта, фильтрование, упаривание органического растворителя под вакуумом, растворение сухого остатка в 4 см³ подвижной фазы, разбавление до предполагаемой концентрации, входящей в калибровочный диапазон.

Процедура 4. Для жидких и суспензионных фармацевтических препаратов и жидких биологически активных добавок.

Разведение 1-5 г образца до предполагаемой концентрации, попадающей в калибровочный диапазон, фильтрование разбавленного образца для удаления взвешенных частиц через мембранный фильтр.

Подготовленный образец подвергают хроматографическому разделению в следующих условиях:

Предколонка: 2,1×10 мм 120, C18, 5 мкм, 120 Å;

Колонка: 2,1×150 мм, C18, 3 мкм, 120 Å;

Подвижная фаза: Ацетонитрил (25 об.%) - вода (75 об.%), режим элюирования градиентный (таблица 1).

Таблица 1 Условия градиентного элюирования Время, мин Ацетонитрил, об.% Вода, об.% 0 25 75 16 25 75 16 40 60 30 40 60 30 25 75 45 25 75

Скорость подачи элюента: 0,2 см³/мин;

Температура термостата колонок: 30,0°C;

Вводимый объем: 10 мкл - косметика, фармацевтические препараты, 50 мкл - пищевые продукты;

Детектирование: абсорбция при λ₁=254 нм, контроль при λ₂=230 нм.

Допускается применение иных условий хроматографического анализа, не ухудшающих разрешения сигналов аналитов.

На выходе из колонки каждую фракцию детектируют, измеряя величину абсорбции излученного света согласно закону Бугера-Ламберта-Бера. Идентификацию парабенов проводят по временам удерживания. В качестве дополнительного критерия идентификации возможно использование сигнальных отношений высот или площадей пиков, полученных на разных длинах волн или (и) электронных спектров интересуемых соединений. Величину сигнальных отношений определяют по формуле:

$$R=\frac{A_{\lambda 1}}{A_{\lambda 2}}$$ ,

где A_λ1 - величина сигнала, измеренного при длине волны излучения λ1;

A_λ2 - величина сигнала, измеренного при длине волны излучения λ2.

Количественный расчет концентраций парабенов (C, мг/кг) проводится методом внешнего стандарта, учитывая линейный диапазон зависимости выходного сигнала от концентрации или массы стандартных растворов.

Расчет 1. При анализе пищевых продуктов (процедура 1) пользуются следующей формулой:

$$C=\frac{A\ast K\ast V_1\ast V_2}{m}$$ ,

где A - величина получаемого сигнала (площадь пика или высота);

K - калибровочный коэффициент, найденный по калибровочному графику;

V₁ - объем мерной колбы, в которую переносят навеску, см³;

V₂ - объем мерной колбы для конечного разбавления, см³;

m - масса навески образца, г.

Расчет 2. При анализе образцов косметики, фармацевтических препаратов на жировой основе, а также твердых фармацевтических препаратов, субстанций и биологически активных добавок (процедура 2-3), используют следующую формулу:

$$C=\frac{A\ast K\ast V_1\ast V_2}{m}$$ ,

где A - величина получаемого сигнала (площадь пика или высота);

K - калибровочный коэффициент, найденный по калибровочному графику;

V₁ - объем подвижной фазы, в котором растворен осадок после упаривания, см³;

V₂ - объем мерной колбы для конечного разбавления, см³;

m - масса навески образца, г.

Расчет 3. Для жидких и суспензионных фармацевтических препаратов (процедура 4) вычисления концентрации парабенов проводят по следующей формуле:

$$C=\frac{A\ast K\ast V_1}{m}$$ ,

где A - величина получаемого сигнала (площадь пика или высота);

K - калибровочный коэффициент, найденный по калибровочному графику;

V₁ - объем мерной колбы для конечного разбавления, см³;

m - масса образца, взятого для разбавления, г.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в химической, косметической, фармацевтической и других отраслях промышленности при анализе парабенов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Изобретение позволяет проводить идентификацию и количественный анализ парабенов при использовании спектрофотометрического или (и) диодно-матричного детекторов. Способ включает процедуры подготовки образцов и условия хроматографического разделения и детектирования. Исходный образец пищевого продукта, косметического изделия, фармацевтического препарата или БАДа предварительно подготавливают согласно одной из процедур пробоподготовки. Затем подготовленный образец подвергают разделению на хроматографической колонке. На выходе каждую фракцию детектируют, измеряя величину абсорбции излученного света согласно закону Бугера-Ламберта-Бера. Идентификацию парабенов проводят по временам удерживания. В качестве дополнительного критерия идентификации возможно использование сигнальных отношений высот или площадей пиков, полученных на разных длинах волн или (и) электронных спектров интересуемых соединений. Количественный расчет концентраций парабенов проводится методом внешнего стандарта, учитывая линейный диапазон зависимости выходного сигнала от концентрации или массы парабенов в стандартных растворах. Техническим результатом является отсутствие необходимости в получении производных, сравнительно быстрая пробоподготовка и хроматографический анализ, относительно низкая себестоимость анализа, идентичность условий хроматографического анализа для всех типов исследуемой продукции, что уменьшает время подготовки системы между анализами, возможность применения дополнительных критериев для идентификации парабенов (сигнальные отношения или (и) электронные спектры). 2 ил.

Способ хроматографического анализа парабенов (эфиров 4-гидроксибензойной кислоты) в продуктах питания, косметике, фармацевтических препаратах и биологически активных добавках, заключающийся в проведении пробоподготовки исследуемого образца, применении метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенно-фазовом сорбенте с использованием спектрофотометрического детектора, расчете концентрации парабенов по полученной величине сигналов, отличающийся тем, что пробоподготовка включает взвешивание образца и экстракцию, при этом для пищевых продуктов экстракцию проводят водно-органической смесью растворителей, а пробоподготовка дополнительно включает перенос навески в мерную посуду, осаждение мешающих соединений, фильтрацию, разбавление полученного фильтрата; количественный расчет концентрации парабенов проводится методом внешнего стандарта, учитывая линейный диапазон зависимости выходного сигнала от концентрации или массы стандартных растворов, при анализе парабенов в образцах косметики и фармацевтических препаратах на жировой основе экстракцию осуществляют этилацетатом, а пробоподготовка дополнительно включает очистку на колонке с силикагелем, упаривание растворителя под вакуумом, растворение сухого остатка в подвижной фазе, при анализе парабенов в твердых фармацевтических препаратах, субстанциях и твердых и сыпучих биологически активных добавках экстракцию осуществляют этилацетатом, а пробоподготовка дополнительно включает фильтрование, обезвоживание фильтрата, упаривание растворителя под вакуумом, растворение сухого остатка в подвижной фазе.