СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ РАЗВИТИЯ И УМЕНЬШЕНИЯ ВЫРАЖЕННОСТИ АЛКОГОЛЬНОЙ МОТИВАЦИИ Российский патент 2014 года по МПК A61K38/22 A61K38/38 A61P25/32 

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии, и может быть использовано для угнетения алкогольной мотивации в комплексном лечении хронического алкоголизма, а также в экспериментальной фармакологии для разработки средств направленной коррекции алкогольной зависимости и соматических осложнений алкоголизма у человека.

Алкоголизм является не только социальной, но и сложной медико-биологической проблемой. Развитие алкоголизма и его органных осложнений имеет гетерохимическую природу и связано с нарушением функций опиоидной, дофаминергической и др. систем, а также алко-гольметаболизирующих процессов. В то же время нейрохимические механизмы формирования начальной стадии алкоголизма - алкогольной зависимости, и в первую очередь, становления мотивации к многократному повторному приему этанола - остаются недостаточно выясненными. При этом следует подчеркнуть, что в большинстве исследований основное внимание уделяется выяснению и разработке способов направленной коррекции (см., например, Spanagel R. Alcoholism: A Systems Approach from Molecular Physiology to Addictive Behavior // Physiol. Rev. 2009. V.89. P.649-705) нарушений, обусловленных прямым и косвенным длительным воздействием алкоголя за счет его физико-химических и фармакодинамических влияний на различные нейромедиаторные и нейропептидные системы, обеспечивающих нарушения взаимоотношений мозговых систем подкрепления, отвергания и реагирования организма на стресс.Можно констатировать, что многие применяемые в настоящее время схемы лечения хронического алкоголизма (см., например, там же), являются часто эмпирическими и малоэффективными.

Известно, что ренин-ангиотензиновая система (РАС) играет ведущую роль в регуляции адаптационно-трофических процессов, участвуя в поддержания жизненно-важных физиологических констант организма (артериальное давление, электролитный состав крови, осмотическое давление и др.). Ее отдельные компоненты также вовлечены в опосредование мотивационных и эмоционально-окрашенных состояний, предопределяющие инициацию и субъективную оценку реализации целостных поведенческих актов (см., в частности, Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).

Поскольку алкоголь потребляется, как правило, в виде жидкости, в составе водных растворов, злоупотребление в его приеме сочетается со стойкими нарушениями в механизмах поддержания водно-солевого баланса, а также перестройкой гомеостатических механизмов контроля кардиоваскулярных функций, сопровождающейся дисрегуляцией артериального давления и гемодинамики (Судаков К.В., Котов А.В., Келешева Л.Ф., Мещеряков А.Ф., Азаров А.В. Нейрофизиологические основы формирования алкогольной мотивации в эксперименте // Вопросы наркологии. 1990. №3. С.7-14).

Имеются убедительные сведения, что потребление алкоголя может модулироваться активностью РАС (там же). Однако анализ имеющихся литературных данных показал, что экспериментальные факты о взаимосвязи активности РАС и потребления алкоголя являются несистематизированными, разнородными и противоречивыми. Они касаются, как правило, либо различных особенностей изменения активности РАС в условиях однократного или токсического действия этанола (Cain M.L., Hester R.L., Izevbigie Е.В. Ethanol abrogates Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell growth // Med. Sci. Monit. 2006. V.12. N5. P.BR162-168), либо влияния модуляции активности РАС на метаболические изменения, развивающиеся при длительном, принудительном потреблении алкоголя (Kazim Н., Vazquez М., Ansari R.A., Malafa М.Р., Lalla J. Chronic alcohol-induced oxidative endothelial injury relates to angiotensin II levels in the rat // Mol. Cell. Biochem. 2007. DOI 10.1007/s11010-007-9583-6). Данные о систематических и целенаправленных исследованиях механизмов специфического участия РАС в процессах становления алкогольной мотивации в научной литературе не обнаружены.

Известно также, что хроническая алкоголизация сопровождается не только нарушениями регуляции базисных физиологических реакций, но и деструктивными процессами в тканях организма. Изменение содержания продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов, изменение активности протеаз, факторов свертывания крови и др. являются маркерами повреждения тканей при патологических состояниях, в том числе и при алкоголизме. К таким же маркерам относят и содержание в крови факторов антиоксидантной защиты (SH-группы белков, нитраты/нитриты, активность каталазы и др.) (Deng Xin-Sheng, Deitrich R.A. Ethanol Metabolism and Effects: Nitric Oxide and its Interaction // Current Clinical Pharmacology, 2007, 2, 145-153). Считают, что с этим связано токсическое действие алкоголя и его метаболитов на органы и ткани организма, а также развитие неспецифического иммунодефицита и аутоиммунных процессов, по отношению к антигенам мозга, печени, сердца и др. органов (Crews F.T., Nixon K. Mechanisms of Neurodegeneration and Regeneration in Alcoholism // Alcohol & Alcoholism V.44, No.2, pp.115-127, 2009), развивающихся в результате неспецифической модификации белков этими реактогенными соединениями. При этом аутоантитела такого рода рассматривают лишь в качестве маркеров хронического действия этанола. Обнаружено также, что при алкоголизации у животных и человека развивается неспецифическое иммунодефицитное состояние по иммуноцитологическим показателям (там же).

Следует отметить, что повышение уровня свободнорадикальных соединений является также признаком активации РАС, причем эти соединения являются одним из ключевых звеньев в механизмах сигнальной трансдукции, запускающихся при взаимодействии основного пептида PAC - ангиотензина-II (A-II) со специфическими рецепторами (Prasad K. Oxyradicals as a mechanism of angiotensin-induced hypertension // Intern. J. Angiology. 2004. V.13. P.13-59). Напротив, система оксида азота (NO) подавляет образование свободнорадикальных соединений и модулирует деятельность иммунной системы, играя роль физиологического антагониста этих процессов (там же).

Однако, в области изучения алкоголизма и при оценке эффектов этанола в экспериментальных исследованиях, учет динамики таких факторов проводится лишь в единичных случаях. В этой связи задачей, решаемой при создании заявленного способа, является проведение комплексных исследований динамики показателей, отражающих образование свободнорадикальных соединений и состояние систем антиоксидантной защиты, в корреляции с поведенческими и иммунологическими данными на разных стадиях становления и реализации алкогольной зависимости особи - человека и на животных в модельных экспериментах. Результат, который может быть получен при решении такой задачи, состоит в изменении уровня регуляторных пептидов (РП) для модуляции активности РАС в организме.

Для достижения поставленного результата, предлагается способ предупреждения развития и/или уменьшения выраженности алкогольной мотивации, заключающийся в иммунизации особи путем введения ей конъюгата ангиотензина с бычьим сывороточным альбумином (БСА), при этом в качестве ангиотензина предпочтительно использовать ангиотензин-I (A-I).

Способ иллюстрируется рис.1, на котором представлена схема среднесуточного потребления воды и этанола в условиях свободного выбора у крыс, подвергнутых активной иммунизации БПК ангиотензина-I до и после алкоголизации (в процентах к суммарному объему потребляемой жидкости).

Возможность достижения поставленного результата, по мнению авторов, обусловлена следующим.

Известно, что ангиотензиноген (Анг) под воздействием ренина преобразуется в ангиотензин-I (A-I), который характеризуется слабовыраженным сродством к специфическим ангиотензиновым рецепторам и не проявляет отчетливой физиологической активности. A-I под действием ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) превращается в основной эффекторный пептид PAC - А-II, который, в свою очередь, под действием различных амино- и карбоксипептидаз подвергается дальнейшему процессингу с образованием более коротких пептидов: ангиотензина-III (А-III), ангиотензина-IV (A-IV) и ангиотензин-II_1-7 (A-II_1-7). Наиболее изучены физиологическая активность и мембранные рецепторы A-II (ATI или АТ2). A-III сходен по физиологическому действию с A-II, взаимодействует с этими же рецепторами. В отличие от него, пептиды A-IV и A-II_1-7 имеют собственные специфические рецепторы и физиологическую активность (Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).

Экспериментальный опыт иммунизации интактных животных конъюгатами некоторых РП (Анг, A-I, А-II, А-III, бета-эндорфин и др.) свидетельствует о возможности достижения эффекта долгосрочного и существенного увеличения содержания указанных эндогенных РП в организме на фоне отчетливого специфического иммунного ответа, а также характерных для данных пептидов проявлений их физиологического действия (по поведенческим и биохимическим показателям). Ранее показано, что процедура иммунизации конъюгатом белка-предшественника всех ангиотензинов - Анг до и после окончании алкоголизации приводит к разнонаправленным эффектам в произвольном потреблении этанола у опытных животных, соответственно подавляя или активируя проявления искусственно выработанной алкогольной зависимости. Эти эффекты сопряжены с фазными изменениям в образовании свободнорадикальных соединений и в процессах антиоксидантной защиты. Выявлены также однонаправленные сдвигов показателей гуморального и клеточного иммунитета в динамике активной иммунизации животных конъюгатом Анг, осуществляемой до и после алкоголизации крыс (Котов А.В., Толпыго С.М., Певцова Е.И. с соавторами Ангиотензиноген в механизмах становления и реализации алкогольной зависимости // Нейрохимия. 2006. Т.23, №2. С.143-155). Увеличение содержания Анг приводит к генерализованной активации РАС и увеличению образования всех ангиотензинов - продуктов его процессинга. Напротив, A-I обладает наименее выраженной физиологической активностью, по сравнению с другими пептидами РАС. Известно, что в A-I при действии АПФ, превращается в А-II, а под действием структурного гомолога АПФ-АПФ2 превращается в А-II_1-7, который является функциональным антагонистом А-II. Данный альтернативный путь расщепления A-I является преобладающим в условиях значительного увеличения его концентрации (Kurdi М., De Mello W., Booz G.W. Working outside the system: an update on the unconventional behavior of the renin-angiotensin system components // International J. Biol. Chem. Cell Biol. 2005. V.37. 1357-1367). Это позволяет сделать вывод, что в условиях иммунизации животных БПК A-I и вызванного таким способом длительного повышения уровня A-I в организме можно выявить его собственную, вероятно, компенсаторную роль в нейрохимических механизмах искусственно выработанной алкогольной зависимости у животных.

Пример. Влияние конъюгата ангиотензина-I (A-I) с бычьим сывороточным альбумином (БСА) на процессы формирования и реализации алкогольной мотивации у крыс с искусственно выработанной алкогольной зависимостью.

В первой серии эксперименты были выполнены на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). Крысы были предварительно иммунизированы конъюгатом A-I с БСА, а затем через 2 недели после иммунизации, также как контрольные животные, были подвергнуты принудительной хронической алкоголизации путем замены воды на 20% раствор этилового спирта в течение 3 месяцев и помещены в условия свободного выбора между водой и 20% раствором этанола.

Во второй серии опыты проводили на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). В этой серии животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА после предшествующей хронической алкоголизации в течение 3 месяцев через 2 недели содержания в условиях свободного выбора между водой и 20% раствором этанола. В условиях свободного выбора у всех крыс оценивали суточное количество воды и алкоголя, произвольно потребляемого каждым животным в течение 4 месяцев.

Животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, п/к, пятикратно с интервалом 14 дней, в дозе 300 мкг/кг A-I, химически связанного с БСА. Контрольным крысам по такой же схеме инъецировали физиологический раствор.

Конъюгат A-I с БСА синтезировали с использованием карбодиимидного метода. При использовании бифункционального связывающего соединения (1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил)-карбодиимид) химически соединяли молекулы пептида A-I (фирмы «Ameri-can Peptide Company Inc.», USA) с молекулами БСА (фирмы «Sigma», USA), образуя тем самым конъюгаты ангиотензина-I с белком. Степень связывания пептида с белком-носителем определяли с применением хроматографического анализа по изменению аминокислотного состава кислотных гидролизатов конъюгата и белка-носителя, обработанных связующим соединением. Наряду с этим оценивали включение в состав конъюгата меченого по I¹²⁵ пептида. Полученный данным способом конъюгат содержал 10-12 молекул пептида на 1 молекулу белка.

У всех животных на 10-12 день после 2-й и 5-й иммунизации, а также через 1 и 3 месяца после начала алкоголизации отбирали пробы крови для определения титров антител к A-I, биохимических показателей и иммуноклеточного статуса. Определения уровня антител к A-I проводили в сыворотке крови крыс с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием микропланшет Costar (фирмы Corning Inc, США), сенсибилизированных Анг или БСА, и последующего связывания исследуемой антисыворотки конъюгатами иммуноглобулинов G против Ig G крысы с пероксидазой хрена. Конечное определение проводили с субстратной смесью, содержащей орто-фенилендиамин и перекись водорода, при сканировании на автоматическом микрофотометре «Multiscan ЕХ» (фирма Lab system, Швейцария) при длине волны 492 нм.

В ходе проведения экспериментов учитывали токсическое действие алкоголя на центральную нервную систему и внутренние органы по ряду биохимических показателей в сыворотке крови крыс. При этом оценивали свободнорадикальное перекисное окисление липидов (ПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА), ферментативную (каталаза) и неферментативную (сульфгидрильные группы - SH-группы) антиокислительную активность, а также содержание триглицеридов. Одновременно определяли активность органоспецифических ферментов, как маркеров повреждения тканей, - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ).

Уровень МДА в плазме крови определяли по методу Gorog P. et al., SH-групп - по методу Wayner D.D. М. et al., активность каталазы по методу Королюк М.А. с соавт. Активность АЛТ, ACT, γ-ГТ и содержание триглицеридов оценивали с использованием стандартных диагностических наборов фирмы Diasys (Германия).

Исследовались следующие показатели иммуноклеточного статуса: общее количество лейкоцитов, процентное и абсолютное количество лимфоцитов, T-лимфоцитов и их субпопуляций - T-хелперов/индукторов и Т-эффекторов/супрессоров, DN-клеток или Т-лимфоцитов с двойной отрицательной меткой, не несущих ни Т-хелперных, ни Т-супрессорных маркеров, В-лимфоцитов, NK-клеток (или естественных киллерных клеток) и клеток фагоцитарной системы: микрофагов - нейтрофилов и эозинофилов, и макрофагов - моноцитов, а также иммунорегуляторный индекс (отношение Т-хелперы/Т-супрессоры). В клетках крови: в фагоцитах, Т-лимфоцитах и тромбоцитах - проводили окрашивание на гистохимический маркер NO-синтазы - НАДФН-диафоразу. Определяли также уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови.

В результате исследования установлено, что активная иммунизация крыс конъюгатом А-I до и после их принудительной алкоголизации оказывает подавляющее действие на проявления алкогольной зависимости. Животные демонстрируют длительные (в течение 4-5 месяцев) однонаправленные эффекты в произвольном потреблении этанола в условиях свободного выбора между водой и раствором этанола, проявлявшиеся в виде уменьшения потребления алкоголя и увеличения приема воды по сравнению с контролем (Рис.1). Суммарный объем потребляемой жидкости при этом достоверно не изменялся. Данное воздействие не вызывало и значимых изменений артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС).

У всех животных после активной иммунизации конъюгатом A-I с БСА регистрировали большие значения титров специфических антител к A-I, причем уровень антител у крыс с предварительно сформированной алкогольной мотивацией был выше, чем у животных, иммунизированных конъюгатом A-I до алкоголизации. Следует отметить, что у неиммунизированных крыс, подвергнутых хронической алкоголизации, в отличие от интактных, не алкоголизированных животных, также были выявлены антитела к A-I, но с относительно небольшими величинами титров (Табл.1).

Установлено, что иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА до их принудительной алкоголизации сопровождается сдвигами иммуноклеточного статуса, характерными для нормального хода развития иммунологических реакций на конъюгат белок-гаптен и предупреждает такие сдвиги иммуноклеточного статуса, как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, нейтрофилию и эозинофилию в ходе последующей длительной алкоголизации (Табл.2А).

Также установлено, что в ходе хронического потребления этанола наблюдаются вторичное иммунодефицитное состояние, охватывающее многие популяции иммунокомпетентных клеток. Последующая иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА уменьшает выраженность нарушений иммуноклеточного статуса, развившихся в ходе их длительной принудительной алкоголизации (Табл.2Б).

При иммунизации крыс конъюгатом A-I с БСА до алкоголизации выявлен также сдвиг баланса активности разных форм NO-синтазы в пользу iNOS фагоцитов, участвующей в элиминации апоптотических Т-лимфоцитов и в уменьшении риска развития аутоиммунных осложнений (Табл.3A). При иммунизации конъюгатом A-I после хронической принудительной алкоголизации отмечено уменьшение изменений иммуноклеточного статуса, таких как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, В-лимфоцитов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, выявляемых у контрольных крыс при длительном потреблении этанола. При этом показано смещение баланса NO-содержащих продуктов NOS-катализа в пользу оксида азота (Табл.3Б).

Результаты исследований указывают на избирательное вовлечение иммунных механизмов с участием пептидных компонентов ренин-ангиотензиновой системы (РАС) в процессы формирования и реализации алкогольной зависимости у животных.

На фоне иммунизации конъюгатом A-I с БСА не наблюдали достоверных изменений активности АЛТ, ACT и ГТГ. В ходе иммунизации отмечено умеренное возрастание активности каталазы по сравнению с фоновым периодом и с контролем. При этом содержание SH-групп достоверно снижается по сравнению с фоном и соответствующим контролем, что отражает некоторое истощение запасов антиокислительных факторов. Последующая (после иммунизации) алкоголизация в течение 3 месяцев не приводила к изменению активности органоспецифических ферментов и содержания триглицеридов, уменьшала активность каталазы, увеличивала содержания SH-групп, и несколько снижала содержание МДА, что свидетельствует об усилении процессов, как ПОЛ, так и антиоксидантной защиты. Указанное, по-видимому, обусловлено развивающейся при предварительной иммунизации A-I с БСА активацией компенсаторных биохимических процессов, и обеспечивает уменьшение повреждающего действия этанола в ходе последующей принудительной алкоголизации (Табл.4А).

Предварительная алкоголизация животных инициировала значимое повышение активности АЛТ и ГГТ, содержания триглицеридов, МДА, снижение содержания SH-групп и активности каталазы, что является характерным для алкогольной интоксикации и указывает на поражение тканей печени и сердца и нарушения липидного обмена на фоне активации ПОЛ и истощения антиоксидантной защиты. Последующая активная иммунизация конъюгатом A-I с БСА усиливала изменения ПОЛ (по уровню МДА), ослабляла изменения активности ферментов-маркеров повреждения тканей (АЛТ и ГТТ), препятствовала истощению факторов антиоксидантной защиты, главным за счет повышения активности каталазы (Табл.4Б).

Таблица 1. Средние значения титров антител к ангиотензину-I у крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА до и после алкоголизации (M±SD) Условия иммунизации Период эксперимента Опыт Контроль до воздействия 1:180±80 1:190±60 до алкоголизации (группа I) после 2-й иммунизации 1:6400±3500*** 1:250±80 после 4-й иммунизации 1:14550±5790*** 1:290±80 после 1 мес. алкоголизации 1:8730±3230*** 1:470±120* после 3 мес. алкоголизации 1:4360±1610*** 1:740±210** после алкоголизации (группа II) после 1 мес. алкоголизации 1:390±90 1:370±80 после 3 мес. алкоголизации 1:530±100* 1:670±150* после 2-й иммунизации 1:14930±6870*** 1:690±140* после 4-й иммунизации 1:18670±7450*** 1:760±200** * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 по сравнению с исходными значениями до воздействия.

Таблица 2А. Иммуноцитологические показатели (M±SD) у крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа) Иммунологический показатель Единица измерения До воздействия После 3 мес. алкоголизации опыт контроль опыт контроль лейкоциты тыс./мкл 15,76±1,09 14,67±1,35 13,12±0,77 13,01±1,23 лимфоциты суммарные % 79,71±2,26 80,44±2,47 62,09±3,39* 64,75±2,96*** тыс./мкл 12,01±0,98 11,62±0,82 8,01±0,41* 8,44±0,93*/** T-лимфоциты % 81,00±2,65 81,22±2,35 83,73±2,09 85,17±1,75* тыс./мкл 10,10±0,81 9,35±0,52 6,73±0,40* 7,22±0,85* T-хелперы % 41,0±3,44 42,83±3,53 39,10±3,67 35,75±3,77 тыс./мкл 6,60±0,86 5,46±0,93 3,17±0,85* 3,87±0,78* Т-супрессоры % 27,5±1,45 27,0±2,67 24,0±1,27 31,75±3,90^∧ тыс./мкл 3,70±0,44 2,51±0,86 1,51±0,17* 2,70±0,77 л Tx/Tc усл. ед. 1,37±0,67 1,47±0,88 1,21±0,51 1,21±0,25 DN-клетки % 16,07±0,54 18,33±0,57 8,55±1,27* 15,56±2,30^∧ тыс./мкл 2,58±0,86 2,67±0,71 0,54±0,33* 1,31±0,89^∧ В-лимфоциты % 5,71±0,71 6,89±1,38 3,91±0,77 2,50±0,50*/** тыс./мкл 0,71±0,10 0,83±0,20 0,31±0,06* 0,19±0,03** NK-клетки % 5,14±0,85 4,56±0,91 5,73±1,24 3,75±0,73 тыс./мкл 0,67±0,14 0,58±0,15 0,46±0,10 0,30±0,05 нейтрофилы % 13,57±2,09 12,78±1,48 28,09±3,30 25,08±3,02** тыс./мкл 2,12±0,35 1,99±0,45 3,81±0,6 3,28±0,45** эозинофилы % 0,43±0,20 1,0±0,33 3,73±0,93* 3,33±0,92** тыс./мкл 0,07±0,03 0,15±0,05 0,52±0,15 0,42±0,11*/** моноциты % 6,29±1,53 5,78±1,35 6,09±1,03 6,83±0,97 тыс./мкл 0,99±0,27 0,89±0,23 0,79±0,13 0,87±0,12 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних); ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями).

Таблица 2Б. Иммунопатологические показатели (M±SD) у крыс в процессе принудительной алкоголизации и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа) Иммунологический показатель Единица измерения До воздействия После 3 мес. алкоголизации После 5-ой иммунизации опыт контроль опыт контроль опыт контроль лейкоциты тыс./мкл 17,3±0,91 16,66±1,77 11,52±0,8** 11,16±1,02** 10,57±0,7 10,74±0,78 лимфоциты суммарные % 75,86±1,29 75,29±3,50 70,83±2,72 67,09±4,58 57,92±3,24* 62,90±3,90 тыс./мкл 13,11±0,67 12,34±1,14 8,08±0,54** 7,19±0,66** 6,14±0,53** 6,70±0,60 Т-лимфоциты % 76,43±3,22 83,14±2,77 84,58±1,87 82,91±2,15 82,58±1,67 82,30±1,80 тыс./мкл 10,05±0,76 10,18±0,80 6,86±0,52** 5,89±0,48*** 5,06±0,42*/** 5,56±0,55 Т-хелперы % 39,0±9,37 38,4±5,29 29,5±4,98 23,0±3,29 38,38±2,89* 39,0±9,45* тыс./мкл 3,97±0,92 4,27±0,88 2,38±0,49* 2,40±0,58* 2,49±0,20 2,60±0,61 Т-супрессоры % 23,25±3,12 23,50±3,18 20,3±2,88 29,0±4,94 29,45±2,50 20,6±3,95 тыс./мкл 3,21±0,25 2,88±0,35 1,34±0,37* 1,94±0,49 1,87±0,25 1,30±0,39 Тх/Тс усл. ед. 1,19±0,29 1,81±0,38 1,40±0,75 1,0±0,23 1,43±0,17 1,91±0,85 DN-клетки % 20,0±3,25 19,5±3,84 32,0±5,78* 27,0±0,23* 13,87±3,42* 24,0±2,8^∧ тыс./мкл 3,00±0,97 3,56±0,92 3,01±0,92 2,72±0,94 0,96±0,29** 2,05±0,29^∧ B-лимфоциты % 6,86±1,29 4,57±0,75 2,50±0,41** 3,18±0,79 2,93±0,54 1,70±0,21^∧ тыс./мкл 0,91±0,18 0,56±0,11 0,21±0,04** 0,25±0,07** 0,20±0,05 0,11±0,01 NK-клетки % 5,57±1,32 5,43±1,79 6,0±1,42 4,91±1,25 5,83±0,91 6,20±0,69 тыс./мкл 0,73±0,18 0,71±0,26 0,46±0,10 0,38±0,11 0,35±0,06 0,40±0,04 нейтрофилы % 13,29±1,50 15,86±3,54 19,67±1,97** 20,64±3,63 29,25±2,03** 25,9±3,22 тыс./мкл 2,28±0,24 2,88±0,76 2,31±0,29 2,47±0,72 3,06±0,26** 2,85±0,46 эозинофилы % 1,14±0,70 0,29±0,18 2,25±0,69 2,82±0,48*** 6,08±0,99** 3,0±0,44 тыс./мкл 0,21±0,13 0,14±0,03 0,26±0,07 0,3±0,04* 0,64±0,11** 0,31±0,06^∧∧ моноциты % 9,71±0,77 7,57±1,57 7,33±1,31 9,45±1,69 6,75±1,23 8,3±1,5 тыс./мкл 1,7±0,18 1,29±0,27 0,89±0,2**/*** 1,16±0,29 0,73±0,14 0,88±0,16 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних); ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями).

Таблица 3A. Система оксида азота (M±SD) у крыс после иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа) Показатель Ед. измерения Период эксперимента Опыт Контроль активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазы в фагоцитах цитохимический индекс до воздействия 0,05±0,01 0,09±0,03 после 3 месяцев алкоголизации 0,28±0,03### 0,22±0,02# в Т-лимфоцитах до воздействия 0,25±0,04 0,23±0,03 после 3 месяцев алкоголизации 0,50±0,06 0,54±0,04 в тромбоцитах до воздействия 0,06±0,01 0,04±0,01 после 3 месяцев алкоголизации 0,12±0,02 0,14±0,03 уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме мкМ/л до воздействия 16,58±1,53 19,33±1,74 после 3 месяцев алкоголизаиии 25,25±2,55 33,06±4,02 # - р<0.05, # - р<0.01, ### - р<0.001 - значимость различий по сравнению с предыдущим периодом в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних). Таблица 3Б. Система оксида азота (M±SD) у крыс в процессе алкоголизции и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа) Показатель Ед. измерения Период эксперимента Опыт Контроль активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазы в фагоцитах в Т-лимфоцитах в тромбоцитах цитохимический индекс до воздействия 0,09±0,03 0,04±0,01 5-кратная иммунизация после алкоголизации 0,14±0,02 0,13±0,02 до воздействия 0,30±0,04 0,24±0,03 5-кратная иммунизация после алкоголизации 0,44±0,04 0,38±0,03* до воздействия 0,07±0,02 0,0±0,01 5-кратная иммунизация после алкоголизации 0,22±0,03 0,18±0,02* уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме мкМ/л до воздействия 9,22±0,83 12,06±2,21 5-кратная иммунизация после алкоголизации 29,69±4,66 28,44±3,46 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 -значимость различий по сравнению с исходным уровнем показателя в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).

Таблица 4A. Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и γ-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа) Период эксперимента Группы SH-группы, мкмоль/л МДА, мкмоль/л Триглицериды, ммоль/л Каталаза, м кат/л АЛТ, ед./л ACT, ед./л γ-ГТ, ед./л до воздействия опыт 134,8±13,2 30,6±1,9 0,99±0,25 97,7±10,2 113,6±4,94 207,4±17,8 2,66±0,83 контроль 130,0±9,9 32,9±2,1 0,84±0,076 117,7±6,3 134,3±7,6 202,3±12,3 2,05±0,6 после 2-ой иммунизации опыт 108,9±9,4 32,6±1,3 0,91±0,0079 118,4±4,2^∧∧ 139,1±6,18** 218,5±14,6 1,48±0,87 контроль 133,5±8,3 34,5±1,8 1,22±0,094** 96,8±5,5 136,8±5,75 222,8±7,9 1,49±0,49 после 5-ой иммунизации опыт 101,0±8,6*/^∧∧∧ 34,0±2,5 1,20±0,11 94,5±5,5 109,8±5,87 189,7±5,77 2,94±0,76 контроль 132,6±8,0 35,4±1,9 1,45±0,13 94,6±8,8* 107,8±7,9 181,2±8,7 1,86±0,4 после 1 месяца алкоголизации опыт 141,3±9,7 25,7±1,1* 1,18±0,17 109,0±5,3 97,4±6,03 161,0±10,3* 4,48±1,58 контроль 169,4±13,9* 27,6±1,1* 1,51±0,2* 86,7±10,2* 100,0±5,0** 153,2±6,96** 2,6±0,56 после 3 месяцев алкоголизации опыт 187,1±10,4**/^∧ 27,2±0,9 1,0±0,15 78,5±5,1 118,6±4,68 149,5±7,27** 3,0±1,06 контроль 155,6±10,6 28,0±1,1* 0,93±0,17 78,7±10,4* 115,7±5,08 169,0±8,14** 5,38±1,93 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом). ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями).

Таблица 4Б Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и γ-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА после алкоголизации (II группа) Период эксперимента Группы SH-группы, мкмоль/л МДА, мкмоль/л Триглицериды, ммоль/л Каталаза, м кат/л АЛТ, ед./л ACT, ед./л γ-ГТ, ед./л до воздействия опыт 171,5±2,0 15,0±0,7 1,25±0,09 98,4±7,9 135,6±4,6 191,7±10,3 2,23±0,8 контроль 160,1±14,5 16,0±0,7 0,99±0,12 100,3±4,9 122,9±5,52 204,3±11,6 1,56±0,48 после 1 месяца алкоголизации опыт 129,3±1,1*/^∧∧ 33,9±1,7*** 1,31±0,22 89,9±5,3 119,4±3,4** 174,7±13,3 6,9±1,22** контроль 159,7±8,5 34,6±1,7*** 1,41±0,21 97,3±7,7 130,5±6,14 194,9±5,3 3,41±0,75 после 3 месяцев алкоголизации опыт 141,3±9,3 28,6±1,4*** 1,88±0,23 114,0±3,5^∧∧∧ 105±6,4*** 166,4±8,58 4,90±1,3 контроль 157,9±11,8 25,0±1,5*** 1,37±0,22 66,1±7,3*** 106,1±5,35* 175,4±9,4 1,74±0,5 после 2-ой иммунизации опыт 89,4±5,7***/^∧ 28,2±1,1*** 1,30±0,14 85,5±8,1 115,9±7,5 184,8±15,6 4,81±1,4 контроль 114,1±5,9** 31,3±1,3*** 1,43±0,22 67,4±8,1*** 119,1±10,0 173,2±7,85 1,8+0,57 после 5-ой иммунизации опыт 138,5±10,4*/^∧ 36,7±1,4*** 1,27±0,12 72,8±4,4*/^∧ 95,7±6,4*** 166,9±13,3 7,0+1,6 контроль 175,5±9,4 36,4±1,4*** 1,18±0,19 89,0±2,3* 89,1±6,78*** 184,3±15,1 12,5±4,2 * - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом). ^∧ - р<0.05, ^∧∧ - р<0.01, ^∧∧∧ - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями).

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии, и может быть использовано для предупреждения развития и/или подавления алкогольной мотивации путем иммунизации животного. Для этого животному вводят конъюгат ангиотензина I с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в дозе 300 мкг/кг. Изобретение позволяет уменьшить токсическое повреждающее действие этанола и выраженность иммунологических нарушений при длительной алкоголизации. 1 ил., 7 табл., 1 пр.

Способ предупреждения развития и/или подавления алкогольной мотивации, заключающийся в иммунизации особи путем введения ей конъюгата ангиотензина I с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в дозе 300 мкг/кг.