СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ВЫРАБОТКИ ЭРИТРОПОЭТИНА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК in vitro Российский патент 2016 года по МПК A61K35/12 C12N5/71 C12N9/99 C07K14/505 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки эритропоэтина in vitro.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и достигаемому результату (прототипом) является способ стимуляции выработки эритропоэтина с помощью конкавалина-А (Кон-А), который добавляют в необходимой концентрации в культуру ткани и инкубируют при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [1].

Недостатком данного способа является незначительная стимуляция выработки гемопоэтина под действием данного митогена.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача решается тем, что к неадгезирующей фракции костного мозга, которую культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, добавляют ингибитор протеинкиназы р38 в концентрации 300 мкМ, определяющий функциональную активность гемопоэтических клеток.

Новым в предлагаемом изобретении является применение ингибитора протеинкиназы р38 в качестве стимулятора продукции эритропоэтина.

На сегодняшний день среди разнообразных фармакологических средств, используемых в качестве гемостимуляторов, наиболее значимой группой, являются препараты на основе эндогенных стимуляторов кроветворения (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), которые, связываясь со специфическими рецепторами, запускают многочисленные сигнальные механизмы, участвующие в реализации ключевых функций клетки - дифференцировки, пролиферации, старения, опухолевой трансформации. Особого внимания заслуживают препараты рекомбинантного эритропоэтина, гемостимулирующие эффекты которых сопоставимы с активностью природного эритропоэтина [2]. Учитывая перспективность разработки лекарственных препаратов с таргетным действием для модуляции выработки эндогенных гемопоэтинов путем активации/ингибирования внутриклеточного сигналинга, исследование синтеза и специфических биологических свойств данного гемопоэтина в системе in vitro ляжет в основу методологии создания данной группы фармсредств.

Известно, что наряду с классическими STAT-путями, в проведении сигналов от ростовых факторов в клетку могут быть задействованы MAP- и PI3K/Akt-сигнальные каскады [3, 4, 5]. Следует отметить, что данные пути также играют важную роль и в контроле продукции гемопоэтинов клетками кроветворного микроокружения [6, 7]. Однако работ, результаты которых позволили бы вскрыть конкретную роль данных сигнальных путей (их активация либо ингибирование) в продукции эритропоэтина в изучаемой нами литературе, не найдено. Таким образом, исследования, направленные на изучение путей контроля уровня гемопоэтинов, являются, несомненно, актуальными и помогут в разработке новых препаратов для стимуляции кроветворения.

Факт применения ингибитора протеинкиназы р38 с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки эритропоэтина in vitro, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Взвесь клеток костного мозга мышей (5×10⁶ клеток/мл) разделяют на адгезирующую и неадгезирующую фракции. Полученные неприлипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 300 мкМ ингибитора протеинкиназы р38, в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации собирают кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут и хранят не более месяца при -26°С.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах-самцах линии C57B I/6JY в количестве 2 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга (сертификат имеется).

Пример 1

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности для выделения неадгезирующей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты, которые инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 300 мкМ ингибитора протеинкиназы р38 («Calbiochem», США), при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности. По окончании инкубации собирали кондиционные среды и определяли в них уровень эритропоэтина методом ИФА, с помощью набора фирмы «R&D systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

При этом контролем и группой сравнения служили кондиционные среды от неприлипающих клеток костного мозга без добавления ингибитора и с добавлением конкавалина-А соответственно, полученных по способу прототипу: аналогичным описанному выше путем.

В ходе эксперимента показано, что добавление ингибитора протеинкиназы р38 в культуру неприлипающих миелокариоцитов значительно повышало уровень эритропоэтина в кондиционных средах по сравнению с таковым в супернатантах, полученных при культивировании неадгезирующих миелокариоцитов без ингибитора и с добавлением конкавалина-А (табл.1).

Таблица 1 Уровень эритропоэтина (ЭП, mU/mL) в кондиционных средах от неприлипающих миелокариоцитов мышей линии CBA/CaLac культивированных без ингибитора (1), с добавлением конкавалина-А (2) либо ингибитора протеинкиназы р38 (3), (Х±m) Группы ЭП 1 12,69±0,45 2 14,25±0,53* 3 26,33±0,83*#

* - отмечена достоверность различий с показателями в 1-й группе при р<0,05;

# - отмечена достоверность различий с показателями во 2-й группе при р<0,05.

Таким образом, инкубация неприлипающей фракции гемопоэзиндуцирующего микроокружения с ингибитором протеинкиназы р38 приводит к стимуляции выработки эритропоэтина in vitro.

Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет эффективно стимулировать выработку эритропоэтина неадгезирующими миелокариоцитами in vitro.

Цитируемая литература

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии, Томск, 1992, с. 64-65.

2. Дыгай A.M., Жданов В.В., Удут У.В. Фармакологическая регуляция эритропоэза, Москва, 2009, с. 58-71.

3. Fischer О.М., Hart S., Gschwind A., Ullrich A. EGFR signal transactivation in cancer cells. // Biochemical Society Transactions, 2003, 31, p. 1203-1208.

4. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, p. 630-635.

5. Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Tournier C. et al. A mammalian scaffold complex that selectively mediates MAP kinase activation // Science. 1998, 281, p. 1671-1674.

6. Дыгай A.M., Жданов В.В., Мирошниченко Л.А. и др. // Бюл. экс-пер. биол. 2014. №9. С. 282-286.

7. Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. // Бюл. экспер. биол. №1. С. 39-49.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, а именно к способу стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro. Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro, заключается в том, что неприлипающую фракцию миелоцитов культивируют CO₂-инкубаторе в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, добавляют ингибитор протеинкиназы р38 в концентрации 300 мкМ, при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет эффективно стимулировать выработку эритропоэтина неадгезирующими миелокариоцитами in vitro. 1 табл., 1 пр.

Способ стимуляции выработки эритропоэтина клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что неприлипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, с добавлением стимулятора, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют ингибитор протеинкиназы р38 в концентрации 300 мкМ.