СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА БЕЛКА ОМР Т ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОТИВОХОЛЕРНОГО ИММУНИТЕТА У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2018 года по МПК A61K39/00 C12P21/00 G01N33/53 C12R1/63 

Предлагаемое изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к специфической профилактике инфекционных болезней, касающейся получения препаратов для создания специфического серотипового иммунитета к холере у экспериментальных животных на основе белка внешней мембраны OmpT холерного вибриона.

Известно, что белки наружных мембран бактерий в качестве компонентов вакцинных препаратов имеют значительные преимущества по сравнению с липополисахаридом, так как они не токсичны и являются видоспецифическими антигенами, то есть препараты, созданные на их основе, могут защищать от инфекций, вызываемых всеми видами данного микроорганизма. В связи с этим создание вакцин на основе белков перспективно и для защиты от родственных инфекций [1].

Доказано, что антигены, ответственные за формирование противохолерного антибактериального иммунитета, локализованы, главным образом, в наружных мембранах возбудителя, поэтому исследования по совершенствованию средств иммунопрофилактики и иммунодиагностики холеры тесно связаны с поверхностными структурами холерного вибриона [2]. OmpT является одним из восьми белков наружных мембран холерного вибриона. В составе мембранных пузырьков поверхностные белки, в том числе и OmpT, могут принимать участие в транспорте различных токсинов, ферментов, ДНК в клетки хозяина во время колонизации кишечника [3], что предполагает их важную роль в индукции иммунного ответа макроорганизма.

Известен способ производства вакцины для профилактики холеры (см. патент RU №2080121, кл. A61K 39/00), заключающийся в том, что к специфическим компонентам холерной химической вакцины (анатоксину и О-антиген Инаба), полученной из штамма 569 В серовара Инаба, добавляют О-антиген серовараОгава, обеспечивая создание иммунитета также к штаммам серовараОгава.

Недостатком описанного способа является то, что для создания серотипового иммунитета необходимо получать два препарата О-антигена из сероваров Огава и Инаба.

За прототип выбран препарат с иммуномодулирующими свойствами (см. патент RU №2102988, кл. A61K 35/00, A61K 35/26), содержащий гибридный белок Т-ФНО-Т, который выделяют из микроорганизма, в последний введена рекомбинантная плазмида pThy325, кодирующая синтез белка, при стабилизирующих добавках.

Однако этот препарат, обладая выраженным действием на В- и Т-звенья иммунной системы, стимулируя развитие адекватного напряженного иммунного ответа при вакцинации от бактериальных и вирусных инфекций животных, не создает специфический иммунитет, а только повышает неспецифическую резистентность организма.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке нового эффективного препарата для моделирования иммунитета у экспериментальных животных к разным биоварами и сероварам 01 серогруппы возбудителя холеры.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения препарата белка OmpT для моделирования противохолерного иммунитета у экспериментальных животных включает следующие стадии:

а) клетки авирулентного штамма V. cholerae eltor 18950 выращивают на агаре Мартена (pH 7,4) в течение 24 часов при 37°C;

б) смывают клетки физиологическим раствором и осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин при 4°C, с последующим механическим разрушением на УЗ-дезинтеграторе в режиме 10 циклов по 20 сек на холоде с 1-минутным интервалом;

в) обрабатывают полученный клеточный лизат ДНК-азой и РНК-азой из расчета 100 мкг фермента на 1 мл лизата в течение 20 мин при 37°C, а неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4°C;

г) подвергают выделенный супернатант ультрацентрифугированию при 26000 об/мин в течение часа при 4°C для получения общего пула мембранных белков;

д) растворяют полученный осадок с мембранными белками в 2 мл 1% Тритона Х-100 в физиологическом растворе при комнатной температуре в течение суток, после этого белки отделяют ультрацентрифугированием при 26000 об/мин в течение часа и отбирают надосадочную жидкость;

е) определяют в надосадочной жидкости количество белка по методу Досона;

ж) выделяют белок OmpT из надосадочной жидкости, содержащей мембранные белки, предварительно отдиализированной против 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6) с 0,1% Тритоном Х-100, нанося ее на колонку (15×1 см) с DE-52 целлюлозой, уравновешенной 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6) с 0,1% Тритоном X-100, из расчета 1 мг белка на 1 г целлюлозы;

з) белки, сорбировавшиеся на целлюлозе, элюируют ступенчатым градиентом NaCl от 0 до 0,5 М в том же буфере, причем объем каждого градиента составляют из расчета 30 мл, а фракции собирают в объеме 10 мл, затем разливают в пластиковые пробирки Eppendorf по 1 мл и хранят полученный препарат при -20°C.

При этом фракции препарата анализируют на наличие ферментативной активности для идентификации белка, используя протаминсульфат.

Кроме того, активные фракции концентрируют в системе Амикон, затем вычисляют концентрацию белка по оптической плотности раствора, используя формулу Р. Досона.

При этом полученный препарат проверяют на гомогенность, для этого молекулярный вес и чистоту белка оценивают SDS электрофорезом в 10% ПААГ с маркерами молекулярных весов (40 кДа).

Способ осуществляется поэтапно по следующей технологии:

а) Первоначально клетки авирулентного штамма Vibrio cholerae eltor, Inaba 18950, взятого из коллекции Ростовского-на-Дону противочумного института, выращивают на агаре Мартена (pH 7,4) в течение 24 часов при 37°C.

б) После этого клетки смывают физиологическим раствором и осаждают центрифугированием, используя центрифугу «BeckmanJ2-21» Б (США) (ротор J2-YA-20) при 10000 об/мин в течение 20 мин при 4°C. Затем клетки механически разрушают на ультрозвуковом дезинтеграторе модели «Bandelin2 SONOPULSEHD 3200 (Германия) (стержень КЕ-76), проведя 10 циклов по 20 секунд на холоде с 1-минутным интервалом.

в) Полученный клеточный лизат обрабатывают ДНК-азой и РНК-азой (Serva) из расчета 100 мкг фермента на 1 мл лизата в течение 20 мин при 37°C, а неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при 8000 об/мин («Beckman J2-21», (США), ротор J2-YA-20) в течение 10 мин при 4°C.

г) Выделенный супернатант подвергают ультрацентрифугированию («Beckman L5-50B», (США)) при 26000 об/мин в течение часа при 4°C в роторе Sorvall АН627 для получения общего пула мембранных белков.

д) Полученный осадок с мембранными белками растворяют в 2 мл 1% Тритона Х-100 (Хеликон) в физиологическом растворе при комнатной температуре в течение суток, после этого ультрацентрифугируют при 26000 об/мин в течение час и отбирают надосадочную жидкость.

е) Надосадочную жидкость исследуют флуориметрическим методом по 2 длинам волн (метод Досона) на количественное присутствие белка с целью определения эффективности дальнейшего ее использования для выделения и очистки белка OmpT.

ж) Для выделения белка OmpT надосадочную жидкость предварительно диализуют против 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6) с 0,1% Тритоном Х-100. Затем для хроматографирования наносят на колонку с целлюлозой DE-52 (15×1 см) («Whatman», Англия), уравновешенной 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6) с 0,1% Тритоном Х-100, из расчета 1 мг белка на 1 г целлюлозы.

з) Сорбировавшиеся на целлюлозе белки элюируют ступенчатым градиентом NaCl в 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6) с 0,1% Тритоном Х-100. Ступени градиента: 0,05 М, 0,06 М, 0,07 М, 0,08 М, 0,09 М, 0,1 М, 0,5 М, причем объем каждого градиента составил 30 мл, а выделенные фракции собирают в объеме 10 мл. При этом полученные фракции анализируют на наличие протаминлитической активности [4] для идентификации белка, используя в качестве субстрата протаминсульфат.

Кроме того, активные фракции концентрируют в системе Амикон (Нидерланды) (камера 10 РА, мембрана РМ 30) и вычисляют концентрацию белка по оптической плотности раствора, используя формулу Р. Досон и др. (1991) [5].

Одним из важных заключительных этапов способа является проверка полученного препарата на гомогенность, заключающаяся в том, что молекулярный вес и чистоту белка оценивают с помощью в SDS электрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) с маркерами молекулярных весов в аппарате MightySmallSE 250 (США). Молекулярный вес исследуемого белка составляет 40 кДа.

Препарат OmpT белка разливают в пластиковые пробирки Eppendorf и хранят при -20°C.

Протективную активность белка OmpT изучали в тесте активной защиты белых мышей (10-12 г) и на модели изолированной петли тонкого кишечника взрослых кроликов.

Эффективность предложенного способа подтверждается следующими примерами:

Пример 1.

Определение защитного действия OmpT в тесте активной защиты белых мышей, зараженных различными биоварами и сероварами возбудителя холеры.

Три группы беспородных белых мышей (по 20 штук) иммунизировали двукратно (с интервалом в семь дней) внутрибрюшинно препаратом белка в дозах 2,5, 5, 10 мкг. Контролем были животные, которым в тех же дозах вводили физиологический раствор. Через 21 день иммунизированных (опытных) животных и контрольных мышей заражали внутрибрюшинно вирулентной культурой V. cholerae: первую группу - штаммом V. cholerae eltor, Ogawa 18368 в дозе 100 LD50; вторую группу - штаммом V. cholerae eltor, Inaba 5879 в дозе 100 LD50; третью группу - штаммом V. cholerae cholerae, Inaba 569 B в дозе 100 LD50. О защитном действии препарата судили по наличию выживших на третьи сутки после заражения животным. 100% гибель контрольных (интактных) мышей в течение суток подтверждала наличие холерной инфекции.

Результаты свидетельствуют о том, что двукратное внутрибрюшинное введение OmpT в дозах 2,5 и 5 мкг защищала от инфекции от 80% до 90% экспериментальных животных при 100% гибели контрольной группы белых мышей. Иммунизация 10 мкг препарата обеспечивала выживаемость от 45% до 50% животных (см. таблицу).

Приведенные в примере данные свидетельствуют о том, что иммунизация белком OmpT предотвращает развитие холеры у зараженных разными биоварами и сероварами возбудителя этого заболевания белых мышей, что говорит о возможности использования этого препарата для моделирования серотипового иммунитета у экспериментальных животных.

Пример 2.

Определение защитного действия белка на модели изолированной петли тонкого кишечника взрослых кроликов, зараженных разными биоварами и сероварами возбудителя холеры

Три группы (по 4 штуки) взрослых кроликов (1-1,5 кг) иммунизировали подкожно двукратно (с интервалом в семь дней) препаратом OmpT в дозе 150 мкг. Контролем были кролики, которым в тех же дозах вводили физиологический раствор. Через 21 день у иммунизированных (опытных) и контрольных животных, после 24-часового голодания, перевязывали петли тонкого кишечника. Первой группе в одну лигированную петлю вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия (контрольная петля), в другую (опытная петля) - 10⁹ клеток 24-часовой культуры V. cholerae eltor Inaba5879, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора. Второй группе животных также в контрольную петлю вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия, в опытную - 10⁹ клеток 24-часовой культуры V. cholerae eltor, Ogawa 18368, выращенной в пептонной воде и суспендированной в 1 мл пептонного раствора. Третью группу животных инфицировали в опытную петлю микробными клетками V. cholerae cholerae Inaba 569 В, в дозе 10⁹/мл. Через 18 часов животных забивали воздушной эмболией и вскрывали. О защитном эффекте препарата белка судили по наличию выраженности патологоанатомической картины в опытных перевязанных петлях тонкого кишечника животных из опытной и контрольной групп: наличию жидкости в опытных петлях (холерогенный эффект) и отека слизистой и подслизистой оболочек, кровоизлияний (энтеропатогенный эффект).

Проведенная оценка результатов показала, что у всех контрольных животных в зараженной опытной петле наблюдался ярко выраженный холерогенный и энтеропатогенный эффекты. У иммунизированных белком OmpT кроликов, инфицированных вышеперечисленными холерными штаммами, принадлежащими к одному серотипу, но разным биоварами и сероварам, патоморфологических изменений в опытных петлях не выявлялось.

Таким образом, приведенные в примерах данные свидетельствуют о том, что иммунизация экспериментальных животных белком внешней мембраны OmpT, выделенным из штамма V.cholerae eltor 18950 предотвращает развитие экспериментальной холеры, вызванной разными биоварами и сероварами возбудителя холеры O1 серогруппы, что говорит о наличии перекрестного иммунитета, смоделированного предложенным препаратом. Эти результаты могут быть полезны при разработке новых иммунобиологических вакцинных препаратов для специфической профилактики холеры.

Источники информации

1. Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А. и др. Антигенные свойства поринов наружной мембраны рода иерсиний // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1996. №6. С. 657-660.

2. Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Колесник Р.С. и др. Клеточные мембраны холерного вибриона как основа высокоиммуногенного вакцинного препарата против холеры // Бюллетень ВСНЦ ССО РАМН. - 2004. - №1. - С. 127-132.

3. Kuehn M.J., Kesty N.C. Bacterial outer membrane vesicles and the host pathogen interaction // Genes Dev. 2005; 19: 2645-2655.

4. Gilboe D.D. Williams J.N. Evaluation of the Sakagushi reaction for quantitative determination of arginine. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1956 - Vol. 91. - №4. - P. 535-536.

5. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. с. 464.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложен способ получения белка OmpT для моделирования противохолерного иммунитета у экспериментальных животных. Способ включает выращивание авирулентного штамма V.cholerae eltor 18950, смыв клеток с последующим осаждением, разрушением в УЗ-дезинтеграторе, обработку ДНК-азой и РНК-азой и центрифугирование. Супернатант ультрацентрифугируют, осадок мембранных белков растворяют в 1% Тритон Х-100, ультрацентрифугируют. Белок OmpT выделяют из надосадочной жидкости, предварительно отдиализированной против 20мМ Трис-НСl (pH 7,6), нанося на колонку с DE-52 целлюлозой. Белки, сорбирующиеся на целлюлозе, эллюируют градиентом NaCl. Способ обеспечивает получение эффективного препарата для моделирования иммунитета у экспериментальных животных. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 пр.

1. Способ получения препарата белка OmpT для моделирования противохолерного иммунитета у экспериментальных животных включает следующие стадии:

а) клетки авирулентного штамма V. Cholerae eltor 18950 выращивают на агаре Мартена (рН 7,4) в течение 24 часов при 37°C;

б) смывают клетки физиологическим раствором и осаждают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин при 4°C с последующим механическим разрушением на УЗ-дезинтеграторе в режиме 10 циклов по 20 сек на холоде с 1-минутным интервалом;

в) обрабатывают полученный клеточный лизат ДНК-азой и РНК-азой из расчета 100 мкг на 1 мл лизата в течение 20 мин при 37°C, а неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин при 4°C;

г) подвергают выделенный супернатант ультрацентрифугированию при 26000 об/мин в течение часа при 4°C для получения общего пула мембранных белков;

д) растворяют полученный осадок с мембранными белками в 2 мл 1% Тритона Х-100 в физиологическом растворе при комнатной температуре в течение суток, после этого белки отделяют ультрацентрифугированием при 26000 об/мин в течение часа и отбирают надосадочную жидкость;

е) определяют в надосадочной жидкости количество белка методом Досона;

ж) выделяют белок OmpT из надосадочной жидкости, содержащей мембранные белки, предварительно отдиализированной против 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6) с 0,1% Тритоном Х-100, нанося ее на колонку (15×1 см) с DE-52 целлюлозой, уравновешенной 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6) с 0,1% Тритоном X-100, из расчета 1 мг белка на 1 г целлюлозы;

з) белки, сорбировавшиеся на целлюлозе, элюируют ступенчатым градиентом NaCl от 0 до 0,5 М в том же буфере, причем объем каждого градиента составляют из расчета 30 мл, а фракции собирают в объеме 10 мл, затем разливают в пластиковые пробирки Eppendorf по 1 мл и хранят полученный препарат при -20°C.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фракции препарата анализируют на наличие ферментативной активности для идентификации белка, используя протаминсульфат.

3. Способ по п 1, отличающийся тем, что активные фракции концентрируют в системе Амикон, затем вычисляют концентрацию белка по оптической плотности раствора, используя формулу Р. Досона.

4. Способ по п 1, отличающийся тем, что полученный препарат проверяют на гомогенность, для этого молекулярный вес и чистоту белка оценивают SDS электрофорезом в 10% ПААГ с маркерами молекулярных весов (40 кДа).