ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ АДЕНОВИРУС ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО Российский патент 2014 года по МПК C12N7/01 A61K39/235 C12N15/861 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к области онкологии, а именно к виротерапии.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящее время лечение рака основывается, главным образом, на химиотерапии, лучевой терапии и хирургии. Несмотря на высокую степень успеха при лечении рака на ранних стадиях, наиболее продвинутые случаи рака являются неизлечимыми, поскольку они не могут быть удалены хирургическим путем или потому что дозы вводимых радио- или химиотерапевтических веществ ограничены в силу их токсичности по отношению к нормальным клеткам. Для смягчения этой ситуации были разработаны биотехнологические подходы с целью повышения эффективности и избирательности лечения онкологических заболеваний. Среди них генная терапия и виротерапии используют вирусы в терапевтических целях против рака. В генной терапии вирус модифицируют для предотвращения его репликации и для применения в качестве средства доставки или в целях использования в качестве вектора для терапевтического генетического материала. Наоборот, в виротерапии используют вирус, который реплицируется и размножается избирательно в опухолевых клетках. При виротерапии опухолевые клетки погибают вследствие цитопатического эффекта, вызываемого репликацией вируса внутри них, а не за счет терапевтического гена. Преимущественная репликация в опухолевой клетке называется онкотропизмом, а лизис опухоли называется онколизом. В строгом смысле, вирусы, которые избирательно реплицируются в опухолях, называются онколитическими, хотя в более широком смысле слово «онколитический» можно применять к любому репликационно-компетентному вирусу, способному лизировать клетки опухоли, даже без избирательности. В этом описании термин «онколитический» используется в обоих смыслах.

Виротерапия рака предшествует генной терапии. Первые исследования по лечению опухолей вирусами относятся к началу прошлого века. В 1912 De Pace добился регрессий опухолей после введения вируса бешенства в цервикальные карциномы. С тех пор в опухоли для их лечения вводили многие виды вирусов. Существуют вирусы, которые отображают природный онкотропизм, такие как автономный парвовирус, вирус везикулярного стоматита и реовирус. Другими вирусами для избирательной репликации в опухолях можно манипулировать генетически. Например, вирус простого герпеса (ВПГ) становится онкотропным в результате элиминации гена рибонуклеотидредуктазы, не являющейся необходимой ферментативной активностью в активно размножающихся клетках, таких как клетки опухоли. При этом аденовирус, вследствие его низкой патогенности и высокой способности инфицировать клетки опухоли, является вирусом, чаще используемом в виротерапии и в генной терапии рака.

Пятьдесят один серотип аденовируса человека был идентифицирован и систематизирован в 6 различных групп от A до F.

Аденовирус человека типа 5 (Ad5), который принадлежит к группе C, представляет собой вирус, образованный белковым икосаэдрическим капсидом, в который упакована линейная ДНК длиной 36 тысяч пар нуклеотидов. У взрослых инфекция Ad5 обычно протекает бессимптомно, а у детей она вызывает насморк и конъюнктивит. Обычно Ad5 поражает эпителиальные клетки, которые в ходе естественной инфекции представляют собой клетки эпителия бронхов. Он попадает в клетку путем взаимодействия волокна, вирусного белка, который вытягивается как антенна из двенадцати вершин капсида, с клеточным белком, участвующим в межклеточной адгезии, который называется аденовирусным рецептором Коксаки (CAR). При попадании вирусной ДНК внутрь ядра начинается упорядоченная транскрипция ранних генов (с E1 по E4) вируса. Первые экспрессируемые вирусные гены представляют собой гены ранней области 1А (Е1А). Е1А связывается с клеточным белком Rb для высвобождения E2F, который активирует транскрипцию других вирусных генов, таких как E2, E3 и E4, и клеточных генов, которые активируют клеточный цикл. С другой стороны, Е1В связывается с р53 для активации клеточного цикла и предотвращения апоптоза инфицированных клеток. E2 кодирует белки, участвующие в репликации вируса; E3 кодирует белки, которые подавляют противовирусный иммунный ответ; E4 кодирует белки, участвующие в транспорте вирусной РНК. Экспрессия ранних генов приводит к репликации вирусной ДНК, и после того, как ДНК реплицировалась, активизируется главный поздний промотор и запускает транскрипцию матричной РНК, которая после дифференциального сплайсинга образует все РНК, кодирующие структурные белки, которые формируют капсид.

Существует два важных для рассмотрения аспекта применительно к разработке онколитических аденовирусов: избирательность и активность. Для того чтобы добиться избирательности в отношении опухолевых клеток, были использованы три стратегии: элиминация вирусных функций, необходимых для репликации в нормальных клетках, но не являющихся необходимыми в опухолевых клетках; контроль вирусных генов, которые запускают репликацию с помощью промоторов, избирательно действующих в опухолях; и модификация капсидных белков вируса, имеющих значение при инфицировании клетки-хозяина. С такими генетическими модификациями можно достичь значительного уровня избирательности, с эффективностью репликации в опухолевых клетках, в 10000 раз превышающей эффективность репликации в нормальных клетках. В отношении онколитической активности, для ее увеличения было описано несколько генетических модификаций. Эти изменения включают: a) увеличение высвобождения вирусов, например, путем элиминации E1B19K, суперэкспрессии E3-11.6K (ADP) или локализации белка E3/19K в плазматической мембране; и b) встраивание терапевтического гена в геном онколитического аденовируса для образования «заряженного онколитического аденовируса». В этом случае терапевтический ген мог бы опосредовать гибель неинфицированных опухолевых клеток путем активации пролекарства с наблюдательным действием (то есть можно сказать, что уничтожает неинфицированные соседние клетки), активацию иммунной системы в отношении опухоли, индукцию апоптоза, подавление ангиогенеза или элиминацию внеклеточного матрикса, среди прочего. В этих случаях способ и время экспрессии терапевтического гена будут иметь решающее значение для конечного результата терапевтического подхода.

В последнее десятилетие пациентам с карциномами головы и шеи, яичника, толстой и прямой кишки, поджелудочной железы и со злокачественной гепатомой, среди прочих, вводили различные онколитические аденовирусы. Профиль безопасности этих аденовирусов в клинических исследованиях был весьма многообещающим. Обнаруженные побочные эффекты, такие как симптомы гриппа и повышение уровней трансаминаз, хорошо переносились даже после системного введения высоких доз вируса (см. D. Ко et al., «Development of transcriptionally regulated oncolytic 25 adenoviruses», Oncogene 2005, vol. 24, pp. 7763-74; и T. Reid et al., «adenoviral Intravascular agents in cancer patients: lessons from clinical trials», Cancer Gene Therapy 2002, vol. 9, pp. 979-86). Хотя введение рекомбинантного аденовируса индуцировало частичное подавление роста опухоли, полная эрадикация опухолей не была достигнута, и через короткий промежуток времени опухоли снова быстро росли. Такие результаты, вероятно, имели место потому, что введенный аденовирус распределялся лишь по небольшой части опухоли, производя ограниченный противоопухолевый ответ, поскольку неинфицированные клетки продолжали быстро расти. В недавней работе было отмечено, что репликация онколитических аденовирусов в ксенотрансплантатных опухолях человека продолжалась в течение от 35 до 100 дней после системного введения, хотя эта репликация не приводила к полной эрадикации опухоли (см. H. Sauthoff et al., «intratumoural spread of wild-type adenovirus is limited to after local injection of human xenograft tumours: virus persists and spreads systemically at late time points», Human Gene Therapy 2003, vol. 14, pp. 425-33). Такая низкая противоопухолевая эффективность имеет место отчасти потому, что соединительная ткань и внеклеточный матрикс (ECM) в опухоли препятствуют распространению аденовируса внутри опухоли.

Эта проблема эффективного распространения онколитических аденовирусов в массе опухоли также была описана для других противоопухолевых средств, таких как доксорубицин, таксол, винкристин или метотрексат. Многие исследования свидетельствуют о роли ЕСМ в устойчивости опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам (см. BP Toole et al., «Hyaluronan: a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells», Seminars in Cancer Biology 2008, vol. 18, pp. 244-50). Опухолевые и стромальные клетки продуцируют и образуют матрикс из коллагена, протеогликанов и других молекул, который затрудняет транспорт макромолекул внутри опухоли. Гиалуроновая кислота (НА) является одним из основных компонентов ECM, вовлеченных в устойчивость опухолевых клеток к терапевтическим препаратам. НА сверхэкспрессируется в самых различных злокачественных тканях, и во многих случаях уровень НА является фактором прогноза прогрессирования опухоли. Взаимодействие НА с рецепторами CD44 и RHAMM увеличивает выживаемость опухоли и инвазию. Кроме того, НА может индуцировать опухолевые метастазы, вызывая клеточную адгезию и миграцию, и защиту от иммунной системы.

С другой стороны, ингибирование взаимодействия между гиалуроновой кислотой и опухолевыми клетками возвращает устойчивость ко многим препаратам. Различные исследования показали, что гиалуронидазы (ферменты, вызывающие деградацию НА) усиливают действие различных химиотерапий у пациентов с меланомой, саркомой Капоши, опухолями головы и шеи, метастазами печени и карциномой толстой кишки. Механизм действия гиалуронидаз до сих пор неизвестен, но, как правило, это связано с уменьшением барьеров клеточной адгезии, уменьшением внутритканевого давления и улучшением проникновения противоопухолевого препарата в опухоль, а не с его ингибирующим эффектом на сигнальный путь, связанный с клеточной выживаемостью.

В последнее время было описано, что совместное введение гиалуронидазы и онколитических аденовирусов при помощи внутриопухолевой инъекции уменьшает прогрессирование опухоли (см. S. Ganesh et al., «Intratumoural coadministration of hyaluronidaseenzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency inmestastasic tumour models», Clin Cancer Res 2008, vol. 14, pp. 3933-41). В этих исследованиях онколитические аденовирусы вводят четырьмя внутриопухолевыми инъекциями и гиалуронидазу вводят внутриопухолево во все другие дни в течение всего лечения. Этот режим введения имеет небольшое применение у пациентов, поскольку большинство опухолей являются недоступными для внутриопухолевого инъецирования. Лечение, предложенное Ганеш с соавторами, может не принести пользы пациентам с рассредоточенным заболеванием (метастазами).

Несмотря на эти усилия, в настоящее время по-прежнему необходим поиск новых терапевтических подходов, эффективных при лечении рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения обнаружили, что аденовирус, который реплицируется и содержит ген гиалуронидазы в своем геноме, распределяется более эффективно в опухолевой массе. Экспрессия гиалуронидазы онколитическим аденовирусом приводит в деградации гиалуроновой кислоты, которая является частью внеклеточного матрикса опухоли. Деградация гиалуроновой кислоты приводит к снижению внутритканевого давления в опухоли и меньшей устойчивости опухоли к распространению аденовируса, и следовательно, улучшению распространения вируса от клетки к клетке в опухолевом образовании. Это улучшенное распространение воплощается в усилении онколитического эффекта. Авторы обнаружили, что при внутривенном инъецировании онколитического аденовируса по изобретению достигается регрессия объема опухоли. Таким образом, онколитический аденовирус по настоящему изобретению является пригодным для лечения рака. Кроме того, экспрессия гена гиалуронидазы не влияет ни на вирусную репликацию, ни на цитотоксичность онколитического аденовируса.

Как упоминалось ранее, было описано, что внутриопухолевое совместное введение онколитического аденовируса и растворимой гиалуронидазы повышает противоопухолевую эффективность онколитического аденовируса. Тем не менее до этого изобретения ген гиалуронидазы не вводили в какой-либо онколитический аденовирус для лечения рака.

Как описывается в примерах, внутриопухолевое in vivo-введение онколитического аденовируса по изобретению улучшает противоопухолевый эффект по сравнению с контрольным аденовирусом без встроенной гиалуронидазы (см. ФИГ.7). Следует отметить, что когда онколитический аденовирус по изобретению вводится внутривенно (см. ФИГ.8 и ФИГ.9) и, по сравнению с результатами, представленными на Фигуре 2 оригинала Ganesh et al., гораздо большее подавление роста опухоли наблюдается в случае аденовируса по настоящему изобретению. Это означает, что лечение по изобретению является более эффективным. Опухоли мышей с инъекцией онколитического аденовируса на изобретение (ICOVIR17) демонстрируют обширные некротические области, области с менее жизнеспособными клетками и крупные и многочисленные центры репликации вируса, по сравнению с опухолями с инъекцией аденовирусного контроля, ICOVIR15.

Кроме того, введенные дозы аденовируса по изобретению являются меньшими: у Ganesh et al. (выше) вводится четыре внутриопухолевых инъекции по 1×10¹⁰ вирусных частиц, тогда как в настоящем изобретении вводится одна внутривенная доза с 2×10⁹ вирусных частиц. Это означает уменьшение дозы в 20 раз и то преимущество, что доза является однократной. В своем подходе, Ganesh et al. вводят гиалуронидазу внутриопухолево через день на протяжении всего эксперимента. Кроме того, аденовирус также вводят внутриопухолево в начале лечения. Такое внутриопухолевое введение вируса и гиалуронидазы вряд ли применимо в клинике, поскольку большинство опухолей являются недоступными для внутриопухолевого введения. Предположительно, совместное введение раствора с гиалуронидазой и аденовирусом не делалось системным способом, поскольку вероятность того, что оба компонента вместе достигнут рассредоточенные по организму клетки опухоли, является низкой.

Настоящее изобретение делает возможным экспрессию гиалуронидазы в участке и в момент времени, когда происходит репликация вируса. Такая экспрессия гиалуронидазы улучшает распространение вируса по опухолевой массе и увеличивает ее противоопухолевую активность. Целесообразно вводить адаптированные дозы, нетоксичные для животных, с большой эффективностью для лечения.

В настоящем изобретении, онколитические аденовирусы достигают опухолевые клетки-мишени. Оказавшись внутри, вирус реплицируется, экспрессируются его капсидные белки и, в то же время, экспрессируется гиалуронидаза, кодируемая геномом аденовируса. Эта гиалуронидаза была модифицирована для высвобождения во внеклеточную среду, которая окружает клетки. Во внеклеточной среде гиалуронидаза разрушает матрикс и помогает аденовирусам, которые реплицировались при инфицировании соседних опухолевых клеток.

Таким образом, аспект изобретения относится к онколитическому аденовирусу, который содержит встроенную в его геном последовательность, кодирующую фермент гиалуронидазу.

В рамках изобретения, термин «онколитический аденовирус» означает аденовирус, который способен реплицироваться или который является компетентным для репликации в опухолевой клетке. В этом описании онколитический аденовирус и реплицирующийся аденовирус являются синонимами. Они отличаются от нереплицирующегося аденовируса, поскольку этот последний неспособен реплицироваться в клетке-мишени. Нереплицирующимися являются аденовирусы, используемые в генной терапии в качестве переносчиков генов к клеткам-мишеням, поскольку целью является экспрессия терапевтического гена в интактных клетках, а не лизис клетки. Вместо этого терапевтическое действие онколитических аденовирусов основано на способности реплицироваться и лизировать клетку-мишень, в частности опухолевую клетку, которую следует элиминировать.

Еще один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит терапевтически эффективное количество онколитического аденовируса совместно с фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями.

Еще один аспект изобретения относится к онколитическому аденовирусу по изобретению для его применения в качестве лекарственного средства.

Еще один аспект изобретения относится к онколитическому аденовирусу по изобретению для лечения рака или предопухолевой формы рака у млекопитающего, включая человека.

Еще один аспект изобретения относится к применению онколитического аденовируса для получения лекарственного средства для лечения рака или предопухолевой формы рака у млекопитающего, включая человека. Лечение основывается на репликации этих онколитических аденовирусов в опухолях. Альтернативно, этот аспект изобретения можно сформулировать как способ лечения у млекопитающего, включая человека, рака или предопухолевой формы рака, который включает введение указанному млекопитающему эффективного количества онколитического аденовируса.

Еще один аспект изобретения относится к челночному вектору, способному рекомбинировать с геномом аденовируса, для конструирования онколитического аденовируса по изобретению. Этот вектор содержит инвертированные концевые повторяющиеся последовательности аденовируса («инвертированные концевые повторы», ITR), последовательность, которая способствует экспрессии последовательности, кодирующей фермент гиалуронидазу, последовательность, которая кодирует фермент, и последовательность полиаденилирования.

В частном варианте осуществления онколитический аденовирус по изобретению является аденовирусом человека, означая, что инфицируются люди. В частности, аденовирус человека выбирают из группы, состоящей из серотипов 1-51 аденовируса человека и их производных. Под «производным» понимается рекомбинантный аденовирусный гибрид двух или нескольких аденовирусов различных серотипов, например, аденовируса серотипа 5 с волокном аденовируса серотипа 3. В частном варианте осуществления изобретения онколитический аденовирус человека относится к серотипу 5.

Гиалуронидазы представляют собой семейство ферментов, которые разлагают гиалуроновую кислоту. У человека существует 6 генов, кодирующих гиалуронидазы с различными свойствами и локализациями. Изоформы Hyal1 и Hyal2 присутствуют в большинстве тканей. Hyal1 является преобладающей формой в плазме человека. Hyal3 присутствует в костном мозге и семенниках, однако ее функция недостаточно хорошо изучена. Гиалуронидаза PH20 высоко экспрессируется в семенниках и участвует в процессе оплодотворения ооцита сперматозоидом. Гиалуронидаза PH20 заякорена в плазматической мембране и во внутренней акросомальной мембране сперматозоида и придает сперматозоиду способность проникать через внеклеточный матрикс скопления (богатого гиалуроновой кислотой), чтобы достичь прозрачной зоны ооцита. Во время акросомальной реакции часть гиалуронидаз, заякоренных в мембране сперматозоида, ферментативно процессируется с образованием растворимой формы белка, который высвобождается из акросомальной мембраны. Кроме того, гиалуронидаза была идентифицирована как фактор распространения яда змей, пауков, скорпионов и ос.

В частном варианте осуществления фермент гиалуронидаза представляет собой тестикулярную гиалуронидазу млекопитающего, конкретнее, тестикулярную гиалуронидазу человека. Тестикулярная гиалуронидаза человека (GenBank GenelD: 6677) также известна как SPAM1 или молекула 1 адгезии спермы, и как PH-20. Мембранный белок PH20 является единственным ферментом семейства гиалуронидаз млекопитающих с активностью при нейтральный pH. Кодирующий его ген образует два транскрипционных варианта: вариант 1, более длинный, который кодирует изоформу 1 белка (инвентарный номер GenBank NP_003108.2) и вариант 2, который использует сигнал альтернативного сплайсинга с 3'-конца кодирующей области, по сравнению с вариантом 1, приводящий к изоформе 2 с укороченным C-концом (инвентарный номер GenBank NP_694859.1).

В частном варианте осуществления изобретения последовательность фермента делетируют по последовательности, соответствующей карбокси-концу мембран-связывающего домена, для продуцирования растворимого фермента (см. ФИГ.2). Делеция этого карбоксиконцевого домена приводит к секреции гиалуронидазы во внеклеточную среду. Таким образом, был получен онколитический аденовирус, который экспрессирует секретируемую гиалуронидазу с ферментативной активностью при нейтральном pH. В частном варианте осуществления последовательность, встроенная в геном аденовируса, представляет собой последовательность, которая кодирует SEQ ID NO: 1. В еще одном частном варианте осуществления встроенная последовательность представляет собой SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления последовательность фермента встроена в онколитический аденовирус после нуклеотидной последовательности волокна аденовируса.

В другом варианте осуществления экспрессия фермента контролируется промотором, активным в клетках животных. В частности, промотор выбирают из группы, состоящей из промотора цитомегаловируса, главного позднего промотора аденовируса, промотора SV40, промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса, промотора RSV, промотора EF1-альфа, промотора бета-актина, промотора IL-2 человека, промотора IL-4 человека, промотора IFN, промотора E2F и промотора GM-CSF человека. Промотор, который контролирует экспрессию фермента, может представлять собой натуральный промотор аденовируса, как имеет место в случае главного позднего промотора аденовируса (см. ФИГ.1(а), MLP, «главный поздний промотор»). Промотор также можно встраивать перед последовательностью, которая кодирует фермент. В предпочтительном варианте осуществления промотором является главный поздний промотор аденовируса.

Репликативный аденовирус по изобретению может иметь модификации в своей геномной последовательности, которые придают способность избирательной репликации в опухолевых клетках. В частном варианте осуществления это достигается встраиванием тканеспецифического промотора или опухолеспецифического промотора. Это промотор контролирует экспрессию одного или нескольких генов группы Е1а, E1b, E2 и E4. В частности, промотор выбирается из группы, состоящей из промотора E2F, теломеразного промотора hTERT, тирозиназного промотора, промотора специфического антигена предстательной железы (PSA), альфа-фетопротеин промотор, промотора COX-2, а также искусственных промоторов, образованных несколькими участками связывания транскрипционных факторов, такими как участки связывания фактора, индуцируемого гипоксией (HIF-1), транскрипционного фактора Ets, опухолевого цитотоксического фактора (tcf), транскрипционного фактора E2F или транскрипционного фактора Sp1. Предпочтительно, промотор контролирует экспрессию Е1а.

Еще одной модификацией для получения избирательной репликации в опухолях является элиминация функций Е1А, который блокирует ретинобластомный (RB) путь. Другие вирусные гены, которые взаимодействуют непосредственно с pRB, такие как E4 и E4orf6/7, представляют собой кандидатов на элиминирование для достижения избирательной репликации в опухолевых клетках. Как показано в примерах, онколитический аденовирус ICOVIR17 характеризуется одновременным содержанием гена гиалуронидазы, делецией А24, что влияет на взаимодействие Е1а с pRB, включением четырех E2F1-сайтов связывания и одного Sp1-сайта связывания в эндогенный промотор Е1а для контролирования экспрессии Е1а и, наконец, включением RGD-пептида в волокно аденовируса для повышения инфекционной активности вируса. ICOVIR17 представляет собой предпочтительный вариант осуществления изобретения.

Еще одной модификацией для получения избирательной репликации в опухолях является элиминация аденовирусных генов, кодирующих связанные с вирусом РНК (VA-RNA). Эти РНК блокируют противовирусную активность интерферона и, в случае делетирования, аденовирус становится чувствительным к ингибированию интерфероном. Поскольку опухолевые клетки характеризуются ограничением интерферонового пути, такие аденовирусы реплицируются в опухолях на нормальном уровне. Таким образом, в другом конкретном варианте осуществления избирательной репликации в опухолях достигается при помощи мутаций в одном или нескольких генах группы E1a, E1b, E4 и VA-RNA аденовируса. Предпочтительными являются мутации в Е1а.

Эти две стратегии для достижения избирательной репликации в опухолях не исключают друг друга.

В другом варианте осуществления изобретения аденовирус включает модификации в своем капсиде, увеличивающие его инфицирующую способность или нацеленные на его рецептор, присутствующий в опухолевых клетках. В предпочтительном варианте осуществления аденовирусные капсидные белки модифицируют генетически так, чтобы включить лиганды, которые увеличивают инфицирующую способность или которые нацеливают вирус на рецептор в опухолевой клетке. Нацеленность аденовируса на опухоль можно достичь при помощи бифункциональных лигандов, которые связываются с вирусом, с одной стороны, и с рецепторами опухоли, с другой. С другой стороны, для повышения устойчивости аденовируса в крови и, следовательно, увеличения возможности достижения рассредоточенных опухолевых вкраплений капсид может быть покрыт полимерами, такими как полиэтиленгликоль. В предпочтительном варианте осуществления онколитический аденовирус имеет капсид, модифицированный для увеличения его инфицирующей способности или для улучшения его нацеленности на клетки-мишени при помощи замены гепаринсульфат-связывающего домена KKTK в волокне аденовируса доменом RGDK. В примерах поясняется конструирование аденовируса ICOVIR17RGDK с такими характеристиками.

В еще одном конкретном варианте осуществления аденовирус содержит последовательность, которая оптимизирует трансляцию в белок последовательности, кодирующей гиалуронидазу.

В еще одном конкретном варианте осуществления аденовирус содержит последовательность, которая активирует экспрессию последовательности, кодирующей гиалуронидазу. В частности, эта последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательности сплайсинга, которая обеспечивает процессинг РНК, последовательности IRES («внутренний участок рибосомного входа») и последовательности 2А пикорнавируса.

В еще одном конкретном варианте осуществления онколитический аденовирус содержит другие гены, встроенные в его геном, которые обычно используются в области генной терапии рака для увеличения цитотоксичности онколитических аденовирусов по отношению к клеткам опухоли. Некоторые из них представляют собой ген тимидинкиназы, ген цитозиндиаминазы, гены проапоптоза, гены, стимулирующие иммунитет, гены опухолевых супрессоров или гены, активирующие пролекарства.

Эти модификации в геноме аденовируса не исключают друг друга. Существует несколько способов манипулирования геномом аденовируса. В области генной терапии и виротерапии с применением аденовирусов известны способы конструирования генетически-модифицированных аденовирусов. Наиболее широко используемый способ основывается на конструировании сначала нужной генетической модификации в плазмиде, содержащей подлежащую модификации область аденовируса, а затем осуществление гомологичной рекомбинации в бактериях при помощи плазмиды, содержащей остальную часть вирусного генома.

Аденовирус, который содержит ген гиалуронидазы - предмет настоящего изобретения, размножается и амплифицируется в клеточных линиях, обычно используемых в области генной терапии и виротерапии, таких как клеточные линии HEK-293 и A549. Предпочтительным способом размножения является способ при помощи инфицирования клеточной линии, пермиссивной к репликации аденовируса. Клеточная линия легочной аденокарциномы A549 является примером линии с такими характеристиками. Размножение осуществляется, например, следующим образом: клетки A549 засевают в пластиковые планшеты для культивирования клеток тарелки и инфицируют из расчета 100 вирусных частиц на клетку. Два дня спустя наблюдается цитопатический эффект, отражающий продуцирование вируса, в виде кластеризации и округления клеток. Клетки собирают в пробирках. После центрифугирования при 1000g в течение 5 минут клеточный осадок замораживают и оттаивают три раза, чтобы разрушить клетки. Полученный клеточный экстракт центрифугируют при 1000g в течение 5 минут, супернатант с вирусом наслаивают на градиент хлорида цезия и центрифугируют в течение 1 часа при 35000g. Зону вируса, полученную из градиента, наслаивают на другой градиент хлорида цезия и снова центрифугируют в течение 16 часов при 35000g. Зону вируса собирают и диализируют против PBS-10% глицерина. Диализованный вирус разделяют на аликвоты и хранит при -80°C. Количественную оценку числа вирусных частиц и бляшкообразующих единиц осуществляют по стандартным протоколам. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) с глицерином до 5% является стандартным составом для хранения аденовируса. Тем не менее были описаны новые составы, которые повышают стабильность вирусов. Способы очистки аденовируса, содержащего ген гиалуронидазы, для его применения при лечении рака являются такими же, как описано для других аденовирусов и аденовирусных векторов, используемых в виротерапии и генной терапии рака.

Онколитический аденовирус по настоящему изобретению можно вводить млекопитающему, предпочтительно человеку. Целью введения онколитического аденовируса является лечение, включая, в качестве неограничивающих примеров, меланомы, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки и рака легких. Кроме того, рассматривается введение онколитического аденовируса в опухоли, находящиеся в предраковой стадии. Понятно, что онколитический аденовирус вводят в фармацевтически приемлемой форме. Специалисты в данной области могут обеспечить необходимую дозу с использованием стандартных процедур. Понятно, что доза должна представлять собой эффективное количество онколитического аденовируса для того, чтобы обеспечить уменьшение опухоли при лечении пациента. Вирус можно вводить непосредственно в опухоль, в полость, в которой опухоль находится, в сосудистую сеть опухоли, вокруг опухоли или путем системной внутривенной инъекции в организм пациента. Предпочтительно, введение является системным.

Протоколы использования вирусов, описанных в настоящем изобретении, для лечения рака являются теми же процедурами, которые используются в области виротерапии при помощи аденовирусов и генной терапии с использованием аденовирусов. В области генной терапии существует большой опыт использования неонколитических и онколитических аденовирусов. Имеются многочисленные публикации, описывающие лечение опухолевых клеток в культуре, экспериментальных моделях на животных и клинических испытаниях с пациентами. Для лечения клеток в культуре in vitro аденовирус, очищенный с помощью любого из составов, описанных выше, добавляют к культуральной среде для получения инфицирования опухолевых клеток. Для лечения опухолей в экспериментальных моделях на животных или у пациентов аденовирус может вводится регионально путем инъекции в опухоль или в полость тела, где находится опухоль, или системно путем инъекции в кровяное русло.

Онколитический аденовирус по изобретению можно вводить отдельно или в композиции с фармацевтически приемлемыми носителями и эксципиентами. Специалист в рассматриваемой области адаптирует композицию в соответствии с конкретным способом введения. Композиции могут включать онколитический аденовирус в качестве единственного противоопухолевого агента или в комбинации с другим терапевтическим средством, таким как химиотерапевтический препарат или вектор со встроенным терапевтическим геном. Кроме того, терапию с использованием онколитических аденовирусов можно комбинировать с лучевой терапией.

Если иное не определено, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такой же смысл, как это обычно понимается любым специалистом в рассматриваемой области. Способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, могут быть использованы в практике настоящего изобретения. Повсюду в описании и пунктах формулы изобретения слово «включать» и его вариации не предназначается для исключения других технических особенностей, добавок, компонентов или стадий. Дополнительные объекты, преимущества и особенности изобретения станут очевидными для специалистов в рассматриваемой области после изучения описания или могут быть изучены из практики изобретения. Следующие конкретные варианты осуществления и чертежи предоставляются в виде иллюстрации, и они не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ.1 (а) показана структура онколитических аденовирусов, характеризующихся содержанием и экспрессией гена гиалуронидазы PH20. Аденовирус AdwtRGD-PH20 содержит ген белка PH20, встроенный после ген волокна аденовируса. Экспрессия гена белка PH20 регулируется главным поздним промотором (MLP) аденовируса посредством вставки акцептора сплайсинга (SA) аденовируса перед геном белка PH20. Трансляция белка этого гена оптимизируется за счет введения последовательности kozak (k) перед последовательностью начала трансляции. Аденовирус ICOVIR15 и ICOVIR17 являются аденовирусами, избирательно реплицирующимися в опухоли. Они характеризуются содержанием 4 участков связывания E2F и одного участка связывания Sp1 в эндогенном промоторе Е1а. Оба вируса также представляют модифицированную версию вирусного волокна, в которое был встроен пептид RGD-4C, и мутантный вариант белка Е1А, у которого были делетированы аминокислоты 121-129 полипептидной цепи (мутация Δ24). Кроме того, ICOVIR17 содержит ген гиалуронидазы PH20, встроенный, как в аденовирусе AdwtRGD-PH20. (b) показывает последовательность, встроенную в аденовирус AdA24RGD вместо последовательности от нуклеотида 419 до нуклеотида 422. Эта вставка сделана для того, чтобы встроить четыре участка связывания с фактором E2F-1 и один участок связывания с фактором Sp1. Последовательности, подчеркнутые как «nt 385-419» и «nt 422-461», соответствуют дикому типу AdA24RGD. (c) показывает полную кассету, встроенную в геномы ICOVIR17 и AdwtRGD-PH20, относительно геномов ICOVIR15 и AdwtRGD (SEQ ID NO: 4). Показаны акцептор сплайсинга IIIa, kozak и последовательность полиаденилирования (polyA). Последовательность, кодирующая белок PH20, простирается от kozak до последовательности полиаденилирования. ФИГ.1 относится к ПРИМЕРУ 3.

ФИГ.2 демонстрирует аминокислотную последовательность белка PH20 (SEQ ID NO: 1) и профиль гидрофобности в соответствии с алгоритмом Кайт-Дулитл. Белок РН20 представляет собой мембранный белок, присутствующий в плазматической и акросомальной мембране сперматозоидов. (a) Аминокислотная последовательность показывает гидрофобную последовательность, ответственную за заякоривание белка в мембране (подчеркнутая последовательность). В настоящем изобретении экспрессируемый вирусом белок PH20 представляет делетированный гидрофобных хвост. Точка расщепления указана внутри круга. За счет этой делеции белок PH20 секретируется во внеклеточную среду. (b) Профиль гидрофобности 100 концевых аминокислот белка PH20 по Кайт-Дулитл. Стрелка указывает на начало гидрофобного участка, который был элиминирован.

ФИГ.3 показывает, что онколитический аденовирусы, содержащие ген гиалуронидазы PH20, экспрессируют растворимый белок, который демонстрирует активность гиалуронидазы. Гели показывают, что образцы гиалуроновой кислоты, инкубированные с супернатантом вируса, экспрессирующего гиалуронидазу PH20, расщеплялись с образованием олигосахаридов различных размеров. Образцы, инкубированные с супернатантами контрольных аденовирусов (AdwtRGD и ICOVIR15), демонстрируют наличие нерасщепленной гиалуроновой кислоты. ФИГ.3 соответствует ПРИМЕРУ 4.

ФИГ.4 показывает, что встраивание и экспрессия гена гиалуронидазы PH20 не мешает репликации аденовируса, избирательно реплицирующегося в опухоли. Клетки клеточных линий A549 (a) и SKMel28 (b) инфицировали онколитическими аденовирусами ICOVIR15 и ICOVIR17 (который отличается от ICOVIR15 содержанием гена PH20) и количество вируса в клеточных экстрактах определяли (ось X, общий вирус, в TU/мл) в разное время (ось Y, в часах после инфицирования). Графики показывают, что кинетика продуцирования вируса является одинаковой для обоих вирусов, демонстрируя, что встраивание и экспрессия гена гиалуронидазы PH20 в аденовирус ICOVIR17 не влияет на репликацию вируса. ФИГ.4 соответствует ПРИМЕРУ 5.

ФИГ.5 показывает онколитическую эффективность in vitro онколитического аденовируса, который содержит и эспрессирует ген гиалуронидазы PH20. Онколитическую активность аденовируса, эспрессирующего гиалуронидазу PH20 (ICOVIR17), сравнивали in vitro с активностью подобного онколитического вируса без гена гиалуронидазы PH20 (ICOVIR15) в двух опухолевых клеточных линиях, эспрессирующих большое количество гиалуроновой кислоты, SKMel28 (a) и PC3 (b). Индуцируемый вирусом цитопатический эффект (CPE) определяли по снижению уровней белка в монослое инфицированных клеток (определяли способом BCA). Клетки засевали в 96-луночный планшет в количестве 10000 клеток/лунку. На следующий день клетки инфицировали серийными разведениями вируса. Инфицированные клетки инкубировали в течение 5 дней, промывали PBS и определяли количество белка, оставшееся в лунке. Результаты показывают, что в условиях in vitro экспрессия гиалуронидазы PH20 не улучшает онколитической активности аденовируса, поскольку кривые цитотоксичности были одинаковыми для обоих вирусов. % клеточной выживаемости в зависимости от TU/клетку представлен на графике. ФИГ.5 соответствует ПРИМЕРУ 5.

ФИГ.6 демонстрирует противоопухолевую активность онколитического аденовируса, эспрессирующего гиалуронидазу PH20 in vivo. Клетки меланомы человека (SKMel28) прививали с каждой стороны бестимусных мышей Balb/c. При достижении опухолями среднего размера 150 мм³ в них инъецировали PBS или 1×10⁸ трансдуцирующих единиц AdwtRGD-PH20 (10 опухолей/группу). (а) График показывает средний рост опухолей (в %) в каждой группе по отношению ко дню 0 как функцию от времени после введения (в днях). Результат демонстрирует, что онколитический аденовирус, эспрессирующий ген гиалуронидазы PH20, статистически значимо обладает более высокой противоопухолевой активностью по сравнению с контрольной группой (PBS), р<0,00001. 100% опухолей с инъекцией AdwtRGD-PH20 регрессировали на 10-50% объема на 27 день после инъекции, в отличие от 0% регрессии в группе с инъекцией PBS. (b) количество гиалуроновой кислоты в опухолях с инъекцией PBS или AdwtRGD-PH20 в конце эксперимента анализировали иммуногистохимически. Изображения демонстрируют, что опухоли с инъекцией AdwtRGD-PH20 имеют более низкое количество гиалуроновой кислоты по сравнению с контрольными опухолями. ФИГ.6 соответствует ПРИМЕРУ 6.1.

ФИГ.7 показывает, что экспрессия гиалуронидазы PH20 улучшает противоопухолевый эффект онколитического аденовируса после его внутриопухолевого введения. Клетки меланомы человека (SKMel28) прививали с каждой стороны бестимусных мышей Balb/c. При достижении опухолями среднего размера 150 мм³ в них инъецировали PBS или 1×10⁸ трансдуцирующих единиц ICOVIR15 или ICOVIR17 (10 опухолей/группу) в однократной дозе. (а) На графике показан средний рост опухолей (в %) относительно дня 0 как функция времени после введения (в днях). Онколитический аденовирус, эспрессирующий гиалуронидазу PH20 (ICOVIR17), представляет лучший противоопухолевый эффект, чем контрольный аденовирус, который не эспрессирует эту гиалуронидазу (ICOVIR15). (b) После 42 дней лечения мышей умерщвляли и опухоли собирали и взвешивали. В таблице приведены обобщенные результаты для объема опухолей, процента роста опухолей и массы опухолей в конце эксперимента. Опухоли с инъекцией ICOVIR17 представляют значительно меньшую массу опухоли по сравнению с опухолями с инъекцией ICOVIR15 (* p<0,05) и опухолями с инъекцией PBS (# p<0,05). В отличие от результатов, полученных in vitro, где вирус может без труда распространяться через монослой клеток, результаты in vivo показывают, что внутри опухоли, где внеклеточной матрикс препятствует распространению вируса, экспрессия гиалуронидазы PH20 увеличивает противоопухолевую активность онколитического аденовируса. ФИГ.7 соответствует ПРИМЕРУ 6.2.

ФИГ.8 показывает, что экспрессия гиалуронидазы PH20 улучшает противоопухолевый эффект онколитического аденовируса после его системного введения. Клетки меланомы человека (SKMel28) прививали с каждой стороны бестимусных мышей Balb/c. После того, как опухоли в среднем достигали 100 мм³, в мышей инъецировали PBS или 5×10¹⁰ физических частиц ICOVIR15 или ICOVIR17 (ICOVIR15, содержащий PH20) (8-10 опухолей/группу) внутривенно. (а) На графике показан средний рост опухолей (в %) для каждой группы по сравнению с днем 0 как функция времени после введения (в днях). Результат показывает, что экспрессия гиалуронидазы PH20 приводит к увеличению онколитической активности аденовируса, поскольку подавление роста опухоли, индуцированное ICOVIR17, значительно выше, чем подавление, индуцированное в контрольной группе (ICOVIR15), * р<0,00001. (b) Изображения показывают, что распределение аденовирусов ICOVIR15 и ICOVIR17 в опухолях, извлеченных в конце эксперимента (день 48). Опухоли мышей с инъекцией онколитического аденовируса ICOVIR17 демонстрируют весьма обширные некротические области (жирная стрелка), снижение количества областей с жизнеспособными клетками (v) и крупные и многочисленные центры репликации вируса (области с зеленой флуоресценцией показаны тонкими стрелками) по сравнению с опухолями с инъекцией контрольного аденовируса, ICOVIR15. ФИГ.8 соответствует ПРИМЕРУ 6.3.

ФИГ.9 демонстрирует, что увеличение противоопухолевой системной активности аденовирусов, эспрессирующих фермент гиалуронидазу PH20, не ограничивается одним типом опухоли. (а) График показывает средний рост опухолей поджелудочной железы NP-18 (в %) для каждой группы по сравнению с днем 0 как функцию времени после введения (в днях). # означает значимый (p≤0,02) по сравнению с опухолями, подвергавшимися лечению PBS с 14 по 30 день, и значимый (p≤0,05) по сравнению с опухолями, подвергавшимися лечению PBS с 14 по 30 день; *, значимый (p≤0,02) по сравнению с опухолями, подвергавшимися лечению ICOVIR-15 с 12 по 30 день. (b) Изображения демонстрируют распределение аденовирусов ICOVIR15 и ICOVIR17 в опухолях NP-18 на 30. * p≤0,01 по сравнению с опухолями, подвергавшимися лечению ICOVIR15. «% p.a.» означает % положительной области. ФИГ.9 соответствует ПРИМЕРУ 6.4.

ФИГ.10 (a) демонстрирует структуру онколитического аденовируса ICOVIR17 и ICOVIR17RGDK. (b) показывает аминокислотную последовательность модифицированного варианта волокна в ICOVIR17RGDK. Подчеркнутая последовательность соответствует аминокислотам 91RGDK94, которые отличаются от вида волокна аденовируса типа 5 дикого типа человека. ФИГ.10 соответствует ПРИМЕРУ 8.

ФИГ.11 демонстрирует онколитическую активность двух аденовирусов (ICOVIR17 и ICOVIR17RGDK) в двух опухолевых клеточных линиях, одна из которых является аденокарциномой легких A549 (a), а другая - аденокарциномой поджелудочной железы NP-18 (b). % выживаемости клеток в зависимости от TU/клетку. ФИГ.11 соответствует ПРИМЕРУ 9.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1. Конструирование онколитических аденовирусов

Были сконструированы два онколитических аденовируса, содержащих ген гиалуронидазы PH20: аденовирус AdwtRGD-PH20 и ICOVIR17.

кДНК гиалуронидазы PH20 была получена путем ПНР-амплификации различных экзонов с использованием в качестве матрицы геномной ДНК клеточной линии A549, с последующим соединением этих экзонов специфическими фланкирующими праймерами, содержащими сайт рестрикции Mfel. Полученный фрагмент расщепляли с Mfel и клонировали путем лигирования в челночную плазмиду pNKFiberRGD (которая содержит последовательность волокна аденовируса, модифицированную RGD) для получения плазмиды pNKFiberPH20. кДНК, соответствующая PH20, клонированному в плазмиду pNKFiberPH20, представляет собой в SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 демонстрирует кодирующие нуклеотиды для белка PH20 (изоформа с инвентарным номером GenBank NP_694859.1) с инициирующего кодона (ATG) до положения 1467. Нуклеотидная последовательность области 1468-1527 этой GenBank-последовательности кодирует гидрофобный конец белка, который заякоривает белок в мембране. Эта последовательность была делетирована, и она не присутствует в SEQ ID NO: 2. После нуклеотида 1468 был добавлен кодон терминации трансляции ТАА.

ПРИМЕР 2. Конструирование аденовируса AdwtRGD-PH20: для создания аденовируса AdwtRGD-PH20, ген волокна аденовируса плазмиды pVK50cau (который содержит полную последовательность Ad5 с сайтом рестрикции Swa I в волокне) был заменен с помощью гомологических рекомбинации в дрожжах геном волокна, за которым следует ген гиалуронидазы PH20, полученный из плазмиды pNKFiberPH20, расщепленной NotI/KpnI.

Аденовирус AdwtRGD-PH20, характеризующийся эспрессированием гена гиалуронидазы PH20 под контролем главного позднего промотора и содержанием трипептида RGD в волокне аденовируса, был образован путем расщепления при помощи PacI плазмиды pAdwtRGD-PH20 и трансфекции клеток HEK293. Аденовирус AdwtRGD, описанный ранее, характеризуется содержанием трипептида RGD в волокне аденовируса (см. M. Majem et al., «Control of E1A to under an E2F-1 to promoter insulated with the myotonic 20 dystrophy locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenovirus Ad-Delta24RGD», Cancer Gene Therapy 2006, vol. 13, pp. 696-705). AdwtRGD был сконструирован путем расщепления Рас I плазмиды pVK503, содержащей полный геном Ad5 с волокном, модифицированным RGD (см. Dmitriev et al., «An adenovirus receiving-independent vector with genetically modified fibres 25 demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus cell entry mechanism», J. Virol. 1998, vol. 72, pp. 9706-13), с последующей трансфекцией клеток 293.

ПРИМЕР 3. Конструирование аденовируса ICOVIR17: для образования этого аденовируса была использована аденовирусная плазмида pICOVIR17. Для конструирования этой плазмиды ген аденовирусного волокна из плазмиды pICOVIR15 был заменен путем гомологичной рекомбинацией в дрожжах геном волокна с последующим геном гиалуронидазы PH20 из плазмиды pAdwtRGD-PH20, расщепленной при помощи SpeI/PacI.

Аденовирус ICOVIR15, полученный из аденовируса AdA24RGD, который характеризуется содержанием делеции Δ24 в кодирующей последовательности белка Е1а. Эта делеция влияет на взаимодействие Е1а с pRB. AdA24RGD также содержит вставку пептида RGD в волокно аденовируса для увеличения инфекционной активности вируса. Эти две модификации описаны в K. Suzuki et al., «Conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity shows 5 improved oncolytic potency», Clin Cancer Res 2001, vol. 7, pp. 120-6. Для контролирования экспрессии Е1а четыре участка связывания E2F-1 и один участок связывания Sp1 из AdA24RGD были встроены в эндогенный промотор Е1а. Таким образом был получен ICOVIR15. Эта вставка была сделана путем замены последовательности 419-422 генома последовательностью с 4 участками связывания E2F-1 и одним участком связывания Sp1, так что окончательной является последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 3 и на ФИГ.1(b). Для осуществления этой стадии направленным мутагенезом в промотор Е1А плазмиды pEndK/Spe был создан уникальный сайт рестрикции BsiWI (см. J.E. Carette et al., «Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in 15 cancer cells», Cancer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7). Участок связывания Sp1 вводили в сайт рестрикции BsiWI плазмиды pEndK/Spe путем лигирования этой расщепленной по BsiWI плазмиды с праймерами Sp1F (5'-GTACGTCGACCACAAACCCC GCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3' SEQ ID NO: 5) и Sp1R (5'-GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGGTCGAC-3' SEQ ID NO: 6), гибридизованных друг с другом. Участки связывания E2F вводили при помощи связывающих праймеров E2FF2 (5'-GTACGTCGGCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGCAAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTTCGAA-3' SEQ ID NO: 7) и E2FR2 (5'-GTACTTCGAACCACTTTTACGCGCCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCACGAGCCGCCGAC-3' SEQ ID NO: 8), гибридизованных друг с другом, для конструирования плазмиды pEndK415Sp1E2F2. Далее, последовательность CAU, которая содержит элементы, необходимые для репликации плазмид в дрожжах (центромера, область автономной репликации ARS и селективный маркер URA3), была введена путем гомологичной рекомбинации в дрожжи для того, чтобы образовать плазмиду pEndK415Sp1E2F2CAU. И наконец, для конструирования pICOVIR15cau была осуществлена гомологичная рекомбинация в дрожжах между плазмидой pEndK415Sp1E2F2CAU, расщепленной KpnI, и аденовирусным геномом аденовируса AdA24RGD. ICOVIR15 был получен путем трансфекции PacI-расщепленной pICOVIR15cau в клетки HEK293.

Вирус ICOVIR17, который содержит те же модификации, что и ICOVIR15 плюс вставка гена гиалуронидазы после гена волокна аденовируса, был образован путем расщепления плазмиды pICOVIR17 при помощи PacI и трансфекции в клетки НЕК293. Правильность структуры геномов AdwtRGD-PH20 и ICOVIR17 проверяли путем рестрикции по Hind III. Кроме того, область гена PH20 секвенировали с использованием специфических праймеров.

Полная кассета, встроенная в геномы ICOVIR17 и AdwtRGD-PH20 в сравнении с геномами ICOVIR15 и AdwtRGD, показана на ФИГ.1 (c) и в SEQ ID NO: 4. Последовательность, кодирующая белок PH20, находится между последовательностью kozak и последовательностью полиаденилирования.

ПРИМЕР 4. Экспрессия растворимого белка с активностью гиалуронидазы при помощи аденовируса, который содержит ген гиалуронидазы PH20

Чтобы продемонстрировать, что аденовирус, который содержит ген гиалуронидазы PH20, эспрессирует растворимый белок с активностью гиалуронидазы, культуры линии клеток A549 инфицировали вирусами AdwtRGD, AdwtRGD-PH20, ICOVIR15 или ICOVIR17, используя множественность инфицирования, которая обеспечивала более 80% инфицирования (20 M.O.I). Через 24 ч после инфицирования инфицированную среду заменяли свежей средой. Затем, по прошествии еще 24 ч, свежую среду (или супернатант) собирали и концентрировали фильтрацией на колонке Amicon Extreme (Millipore, Billerica, США) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрированные супернатанты инкубировали ночь при 37°C с раствором гиалуроновой кислоты (1,5 мг/мл) в фосфатном буфере (рН=6), содержащем 0,1 М NaCl и 0,05% BSA. Расщепленную гиалуроновую кислоту анализировали с помощью электрофореза в 15%-ом полиакриламидном геле (см. M. Ikegami-25 Kawai et al., «Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its application to assay of hyaluronidase activity», Analytical biochemistry 2002, vol. 311, pp. 157-65). Олигосахаридные продукты расщепления гиалуроновой кислоты пищеварение фиксировали в матриксе геля в растворе алциана синего в течение 30 мин. Наконец, олигосахариды прокрашивали нитратом серебра. Результат показан на ФИГ.3. Результаты демонстрируют, что супернатант клеток, инфицированных аденовирусами, включающими ген гиалуронидазы PH20 (AdwtRGD-PH20 и ICOVIR17), содержит растворимый белок, способный расщеплять гиалуроновую кислоту (полисахарид высокой молекулярной массы) на олигосахариды длиной от 5 до более чем 50 единиц дисахаридных повторов.

ПРИМЕР 5. Отсутствие эффекта на репликацию вируса и цитотоксичность in vitro, опосредованного онколитическим аденовирусом, который эспрессирует ген гиалуронидазы PH20

Для проверки того, что включение гена гиалуронидазы PH20 не влияло на репликацию вируса, опухолевые клеточные линий A549 и SKMel-28 были инфицированы онколитическим аденовирусом ICOVIR15 или ICOVIR17. Через четыре часа после инфицирования инфекционную среду заменяли свежей средой. Тотальные клеточные экстракты собирали в разные моменты времени после инфицирования и три раза замораживали-оттаивали для высвобождения вирусов. Количество вирусов в клеточном экстракте определяли путем инфицирования HEK293 и анти-гексонового окрашивания (см. М.Majem выше). Результат приведен на ФИГ.4. Встраивание гена гиалуронидазы PH20 не влияет на репликацию аденовируса ICOVIR17, поскольку этот вирус демонстрирует ту же репликацию, что и аденовирусный контроль.

Чтобы продемонстрировать действие экспрессии гиалуронидазы PH20 на цитотоксичность онколитического аденовируса in vitro, клетки из опухолевых клеточных линий PC3 и SKMel-28 были инфицированы серийными разведениями вирусов ICOVIR15 или ICOVIR17. Через пять и шесть дней после инфицирования, соответственно, количество белка, как показателя выживаемости клеток, оценивали при помощи спектрофотометра. Результаты показаны на ФИГ.5. Литическая активность ICOVIR17 в этих двух опухолевых линиях является такой же, как активность ICOVIR15, указывая, что экспрессия гиалуронидазы PH20 не оказывает каких-либо онколитических преимуществ в условиях in vitro.

ПРИМЕР 6. Применение реплицирующегося аденовируса, который содержит ген гиалуронидазы PH20, для эффективного лечения опухолей.

6.1. Эксперимент in vivo проводили с использованием бестимусных мышей породы Balb/c с привитыми опухолями SKMel-28. В сумме 5×10⁶ опухолевых клеток клеточной линии SKMel-28 вводили подкожно с каждой стороны мыши. Через 21 день мышей с опухолями (с объемом опухоли 150 мм³) распределили в различные экспериментальные группы (n=10 на группу). Опухоли контрольной группы получали однократную внутриопухолевую инъекцию забуференного физиологического раствора (20 мкл). Мыши в группе, подвергаемые лечению AdwtRGD-PH20, получили внутриопухолевую инъекцию (20 мкл) 1×10⁸ трансдуцирующих единиц этого вируса на опухоль (эквивалент 2×10⁹ вирусных частиц или в.ч.). Опухоли измеряли каждые два или три дня при помощи кронциркуля и объем опухоли рассчитывали по формуле: V (мм³)=A(мм)×В²(мм²)×p/6, где А представляет собой больший или продольный размер, а В представляет собой поперечный размер. ФИГ.6 показывает процент роста опухоли по сравнению с началом лечения (день 0). Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистическая значимость различий между результатами рассчитывали с использованием непараметрического теста Манна-Уитни для несовпадающих данных. Кривые роста сравнивали с использованием дисперсионного анализа. Результаты считались значимыми в случае, если p<0,05. Лечение опухолей аденовирусом AdwtRGD-PH20 приводило к регрессиям опухолей в 100% подвергнутых лечению опухолей. % опухолевого роста был значительно меньше, чем в контрольной группе, начиная с первых дней после инъекции. Анализ опухолей в конце эксперимента показал снижение количества гиалуроновой кислоты, присутствующей во внеклеточном матриксе опухолей, в которые инъецировали AdwtRGD-PH20.

6.2. В другом эксперименте лечение осуществляли путем внутриопухолевой инъекции ICOVIR15 или ICOVIR17. Опухоли клеточной линии меланомы человека SKMel-28 имплантировали в бестимусных мышей Balb/C nu/nu и, после создания, их подвергали внутриопухолевому лечению при помощи PBS или 1×10⁸ трансдуцирующих единиц вирусов ICOVIR15 или ICOVIR17 (эквивалент 2×10⁹ вирусных частиц или в.ч.). Результаты показаны на ФИГ.7. Лечение ICOVIR17 показало онколитическую активность, которая приводит к ингибированию роста опухоли, существенно отличающемуся от контрольной группы (PBS), p<0,05. В конце эксперимента опухоли были изъяты и взвешены. Таблица на ФИГ.7 показывает средний объем опухоли, процент роста опухоли и массу опухолей в конце эксперимента. Масса опухолей с инъекцией ICOVIR17 является значительно меньшей, чем массы опухолей в контрольных группах, PBS (# p<0,05) и ICOVIR15 (* p<0,05).

6.3. В другом эксперименте лечение осуществляли путем системных инъекции ICOVIR15 или ICOVIR17. Опухоли клеточной линии меланомы человека SKMel-28 имплантировали бестимусным мышам Balb/C nu/nu и, после создания, животных подвергали лечению при помощи инъекции в хвостовую вену PBS или 5×10¹⁰ физических частиц вируса ICOVIR15 или ICOVIR17. Результаты показаны на ФИГ.8. Лечение ICOVIR17 продемонстрировало онколитическую активность, что привело к подавлению роста опухоли, значительно отличающемуся от контрольной группы, PBS (# p<0,0001) и ICOVIR15 (* р<0,00001). В конце эксперимента опухоли были изъяты и заморожены по восемь. Различные участки опухолей, замороженных по восемь, обрабатывали антителами против гексона (капсидный белок аденовируса) и окрашивали контрастным красителем с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом. Противоопухолевая активность ICOVIR17 коррелирует с репликацией аденовируса на внутриопухолевом уровне, который оценивали в опухолях, полученных на 48 день после инъекции. Опухоли, подвергавшиеся лечению ICOVIR17, демонстрируют крупные некротические области, лучшее распределение вирусов и меньшие области жизнеспособных клеток, чем опухоли с инъекцией с ICOVIR15.

6.4. В другом эксперименте лечение осуществляли путем системной инъекции ICOVIR15 или ICOVIR17 бестимусным nu/nu мышам Balb/C, имплантированным опухолями клеточной линии аденокарциномы поджелудочной железы человека NP-18. После того, как опухоли были созданы, достигнув среднего объема 60 мм³, животных подвергали лечению через хвостовую вену при помощи PBS или 5×10¹⁰ физических частиц вирусов ICOVIR15 или ICOVIR17 (10 опухолей/группу). Результаты приведены на ФИГ.9, на которой показано, что увеличение противоопухолевой активности аденовируса, эспрессирующего фермент гиалуронидазу PH20, не ограничивается одним типом опухоли.

ФИГ.9(a) показывает, что экспрессия гиалуронидазы PH20 приводит к увеличению онколитической активности аденовируса, по сравнению с группой PBS и группой вирусного контроля (ICOVIR15). # означает значимый (p<0,02) по сравнению с опухолями, подвергавшимися лечению PBS от 14 дней до 30. & означает значимый (p<0,05) по сравнению с опухолями, подвергавшимися лечению PBS от 14 дней до 30. * означает значимый (p<0,02) по сравнению с опухолями, подвергавшимися лечению ICOVIR15 от 12-го до 30-го дня. На 30-й день опухоли были изъяты и заморожены по восемь, позднее обработаны антителом против гексона и окрашены контрастным красителем ДАПИ.

Для количественной оценки уровня внутриопухолевый репликации ICOVIR-17 пять жизнеспособных областей каждой опухоли анализировали (7/10 животных на группу) окрашиванием против гексона и процент положительных областей определяли путем компьютеризированного анализа изображений (программное обеспечение ImageJ). Результаты этого анализа представлены на ФИГ.9(b), где отмечается, что опухоли NP-18, подвергнутые лечению ICOVIR17, демонстрировали значительно большую площадь окрашивания на аденовирус по сравнению с опухолями, подвергнутыми лечению ICOVIR15 (*, значимый p<0,01).

ПРИМЕР 7. Токсикологический профиль онколитических аденовирусов, эспрессирующих ген гиалуронидазы

Для проверки того, что встраивание гена гиалуронидазы существенно не изменяет характер токсичности, индуцированной онколитическими аденовирусами после внутривенного введения, были использованы сирийские хомячки (Mesocricetus auratus), поскольку они представляют собой экспериментальную модель на животных, пермиссивную к репликации аденовируса человека. Хомячки представляют экспериментальную модель на животных, пермиссивную к репликации аденовируса человека. Были использованы иммунокомпетентные самки в возрасте 5 недель (5-6 животных/группу). Они получали однократную дозу 4×10¹¹ в.ч. ICOVIR15 или ICOVIR17 внутривенно через головной вену в день 0 в 300 мкл PBS. В контрольной группе вводили тот же объем PBS. Через пять дней после введения животных умерщвляли и от каждого получали общую кровь и сыворотку при помощи сердечной пункции для определения параметров гепатотоксичности (ферменты АСТ и АЛТ) и подсчета популяций различных клеток крови способом проточной цитометрии (гемограмма). Одновременно получали печень животных и фиксировали в 4% параформальдегиде для окрашивания хематоксилином/эозином.

Результаты исследования гепатотоксичности показало, что в этой модели оба вируса вызывали определенную степень воспаления печени, с увеличением уровней трансаминаз АСТ и АЛТ. Однако между животными, подвергавшимися лечению ICOVIR15 или ICOVIR17, различия не наблюдалось. На гематологическом уровне каждый из вирусов вызывал увеличение популяции нейтрофилов, базофилов и моноцитов, а также снижение числа тромбоцитов, по отношению к контрольным животным, но опять же без всякого различия между ICOVIR15 и ICOVIR17.

ПРИМЕР 8. Конструирование вируса ICOVIR17RGDK

Для создания этого аденовируса была использована аденовирусная плазмида pICOVIR17RGDK. В этой плазмиде ген волокна дикого типа аденовируса 5 был заменен на вариант, модифицированный по его гепаринсульфат-связывающему домену (аминокислоты 91KKTK94 в полипептидной последовательности заменены на 91RGDK94). Плазмида pICOVIR17RGDK была сконструирована путем гомологичной рекомбинации в дрожжах между продуктом частичного расщепления pICOVIR17 по NdeI и расщепленной по EcoRI плазмидой pBSattKKT (содержащей модифицированный вариант волокна аденовируса, как описано в N. Bayo et al. «Replacement of adenovirus type 5 fibre shaft heparan sulphate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumour infectivity and targeting». Human Gene Therapy 2009, vol. 20, pp 1214-21).

ФИГ.10 показывает положение модификации 91RGDK94 в контексте ICOVIR17RGDK, а также полную последовательность белка волокна в этом аденовирусе. Аденовирус ICOVIR17 содержит вариант гена волокна аденовируса, где пептид RGD-4C (Cya-Asp-Cya-Arg-Gly-Asp-Cya-Phe-Cya; CDCRGDCFC, SEQ ID NO: 10) был встроен в HI-петлю knob-домена белка (гипервариабельная петля, эволюционно неконсервативная и сильно экспонированная на капсиде аденовируса). ICOVIR17RGDK совершенно аналогичен ICOVIR17, за исключением гена волокна, поскольку только волокно ICOVIR17RGDK отличается от аденовирус типа 5 дикого типа человека заменой аминокислот ⁹¹KKTK⁹⁴ пептидом ⁹¹RGDK⁹⁴ с высокой аффинностью связывания интегрина в shaft-домене белка (SEQ ID NO: 9).

ПРИМЕР 9. Онколитическая эффективность аденовируса с модификацией капсида ICOVIR17RGDK

Как показано на ФИГ.11, модификация капсида, присутствующая в ICOVIR17RGDK, не изменяет in vitro-цитотоксичность онколитического аденовируса, содержащего и эспрессирующего ген гиалуронидазы PH20. Онколитическую активность двух аденовирусов, которые экспрессируют гиалуронидазу PH20 (ICOVIR17 и 25 ICOVR17RGDK), сравнивали на двух опухолевых клеточных линиях, A549, полученной из аденокарциномы легких (ФИГ.11(a)) и NP-18, полученной из аденокарциномы поджелудочной железы (ФИГ.11(b)). Цитопатический эффект, индуцированный вирусом, определяют по снижению количества белка в монослое инфицированных клеток (способ BCA). Клетки двух опухолевых клеточных линий засевали в 96-луночный планшет из расчета 10000 клеток/лунку. На следующий день клетки инфицировали серийными разведениями вируса. Инфицированные клетки инкубировали в течение 6 дней, промывали PBS и определяли количество белка, оставшееся в лунке. Результаты показывают, что в условиях in vitro модификация капсида существенно не изменяет онколитическую активность аденовирусов.

ПРИМЕР 10. Различный токсикологический профиль онколитических аденовирусов, которые экспрессируют ген гиалуронидазы

Для оценки влияния модификации RGDK в бекграунде онколитических аденовирусов, эспрессирующих гиалуронидазу, были использованы иммунокомпетентные мыши Balb/C без опухолей. Использовали шестинедельных самцов (7 животных/группу). Они получали однократную дозу 5×10¹⁰ в.ч. ICOVIR17 или ICOVIR17RGDK внутривенно через хвостовую вену в день 0 в 150 мкл PBS. На 7-й день (2 животных/группу) и 12-й день (5 животных/группу) после введения животных умерщвляли и от каждого получали общую кровь и сыворотку при помощи сердечной пункции для подсчета популяций различных клеток крови способом проточной цитометрии (гемограмма) и для измерения параметров гепатотоксичности (ферменты АСТ и АЛТ). Результаты данного исследования показали, что оба вируса повышали уровни ферментов на 7-й день. Однако эти уровни возвращались к нормальным значениям на 12-й день. Между группами ICOVIR17 и ICOVIR17RGDK не наблюдалось существенных различий, несмотря на то, что тенденция снижения гепатотоксичности наблюдалась в группе животных с инъекцией ICOVIR17RGDK, по сравнению с группой ICOVIR17 (немного пониженные уровни АСТ и АЛТ). Что касается гематологического профиля животных на 12-й день после введения, то существенного различия в белых кровяных клетках и тромбоцитах не наблюдалось, за исключением числа лимфоцитов, которое было ниже у животных, подвергавшихся лечению ICOVIR17, чем у животных групп PBS и ICOVIR17RGDK.

Представленные изобретения относятся к области биотехнологии и, в частности, онкологии и касаются онколитического аденовируса, его применения и фармацевтической композиции, содержащей такой аденовирус. Охарактеризованный аденовирус содержит встроенную в его геном последовательность, кодирующую фермент гиалуронидазу. Экспрессию фермента контролирует промотор, активный в клетках животных. Представленный аденовирус может быть использован для получения средства для лечения рака или предопухолевого состояния рака. Изобретения позволяют повысить эффективность и избирательность лечения. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 11 ил., 10 пр.

1. Онколитический аденовирус, содержащий встроенную в его геном последовательность, кодирующую фермент гиалуронидазу, для лечения рака или предопухолевого состояния рака, где экспрессия фермента контролируется промотором, активным в клетках животных.

2. Онколитический аденовирус по п.1, где аденовирус представляет собой аденовирус человека.

3. Онколитический аденовирус по п.2, где аденовирус человека выбран из группы, состоящей из серотипов аденовируса человека от 1 до 51 и гибридов двух и более разных серотипов.

4. Онколитический аденовирус по п.3, где аденовирус человека относится к серотипу 5.

5. Онколитический аденовирус по п.1, где фермент гиалуронидаза представляет собой тестикулярную гиалуронидазу млекопитающего.

6. Онколитический аденовирус по п.5, где фермент гиалуронидаза представляет собой тестикулярную гиалуронидазу человека.

7. Онколитический аденовирус по п.1, где последовательность, кодирующая фермент гиалуронидазу, содержит последовательность с элиминацией мембран-связывающего домена, что приводит к образованию растворимого фермента гиалуронидазы.

8. Онколитический аденовирус по п.1, где последовательность фермента встроена в онколитический аденовирус после нуклеотидной последовательности волокна аденовируса.

9. Онколитический аденовирус по п.1, где промотор выбран из группы, состоящей из промотора цитомегаловируса, главного позднего промотора аденовируса, промотора SV40, промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса, промотора RSV, промотора EF1-альфа, промотора бета-актина, промотора IL-2 человека, промотора IL-4 человека, промотора IFN, промотора E2F и промотора GM-CSF человека.

10. Онколитический аденовирус по п.1, где аденовирус содержит тканеспецифичный или опухолеспецифичный промотор, где промотор контролирует экспрессию одного или нескольких генов группы E1a, E1b, Е2 и Е4 для достижения избирательной репликации в опухолях.

11. Онколитический аденовирус по п.10, где промотор выбран из группы, состоящей из промотора E2F, теломеразного промотора hTERT, тирозиназного промотора, промотора специфического антигена предстательной железы, промотора альфа-фетопротеина и промотора СОХ-2.

12. Онколитический аденовирус по п.1, где аденовирус содержит мутации в одном или нескольких генах, выбранных из группы E1a, E1b, E4 и VA-RNA, для достижения избирательной репликации в опухолях.

13. Онколитический аденовирус по п.1, где аденовирус включает модификации в капсиде для увеличения его инфицирующей способности или для нацеливания на рецептор, присутствующий в опухолевых клетках, и где модификация в капсиде представляет собой замену гепаринсульфат-связывающего домена ККТК, присутствующего в волокне аденовируса, на домен RGDK.

14. Онколитический аденовирус по п.13, где модификация в капсиде представляет собой замену гепаринсульфат-связывающего домена KKTK, присутствующего в волокне аденовируса, на домен RGDK.

15. Онколитический аденовирус по п.1, где аденовирус содержит последовательность, которая оптимизирует трансляцию в белок последовательности, которая кодирует гиалуронидазу.

16. Онколитический аденовирус по п.1, где аденовирус содержит последовательность, которая активирует экспрессию последовательности, кодирующей гиалуронидазу.

17. Онколитический аденовирус по п.16, где последовательность, которая активирует экспрессию, выбрана из группы, состоящей из последовательности акцептора сплайсинга, которая обеспечивает процессинг РНК, последовательности IRES и последовательности 2А пикорнавируса.

18. Онколитический аденовирус по п.1, где аденовирус содержит один или несколько генов, встроенных в его геном, выбранных из группы генов проапоптоза, генов, стимулирующих иммунитет, генов опухолевых супрессоров или генов, активирующих пролекарства.

19. Фармацевтическая композиция, которая включает терапевтически эффективное количество онколитического аденовируса, как определено в любом из пп.1-18, совместно с фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами, для лечения рака или предопухолевого состояния рака.

20. Применение онколитического аденовируса, как определено в любом из пп.1-18, для получения лекарственного средства для лечения рака или предопухолевого состояния рака у млекопитающего, включая человека.