ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕВИДНЫХ ГРИБОВ РОДА CANDIDA Российский патент 1998 года по МПК C12N1/14 C12N1/14 C12R1/725 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микологии, и может быть использовано для оптимизации способов выращивания дрожжевидных грибов рода Candida с целью повышения выхода спорового материала при снижении времени культивирования, а также повышения сохранности и жизнеспособности клеток грибка.

Известна питательная среда Городковой (см. П.Н. Кашкин. Руководство по медицинской микологии. М. : Медицина, 1978, с. 38) для выявления спор у дрожжей, содержащая мясной бульон, пентон, хлористый натрий, глюкозу, агар и воду.

Однако она дает низкий выход спор. При хранении на ней культуры Candida жизнеспособность клеток гриба через месяц после посева падает более чем вдвое.

Известна также среда для грибов Candida (см. В.В. Курасова, В.В. Костин, Л. С. Малиновская. Методы исследования в ветеринарной микологии. М.: Колос, 1971, с. 292), содержащая пептон, декстрозу, двузамещенный фосфат натрия, сульфат натрия, висмутный индикатор и воду.

Но эта среда может использоваться только как дифференциально-диагностическая или для изучения ферментативных свойств гриба C. albicans. Имеющийся в ее составе висмутный индикатор оказывает отрицательное действие на развитие гриба, частично изменяя его морфологию, и поэтому применение ее как среды сохранения невозможно.

Известно, что жизнеспособность микроскопических грибов поддерживается следующими методами: периодическими пересевами (2-3 раза в месяц), лиофилизацией, хранением под слоем вазелинового масла. Однако частые пересевы снижают активность грибов. Кроме того, недостатком данного метода является и то, что в моменты пересева возможна контаминация лабораторного оборудования культурами и заражение персонала, трудоемкость работы и расход в больших количествах реактивов, входящих в состав питательных сред. При использовании метода лиофилизации происходят изменения структуры и физико-химических свойств грибков. У некоторых грибов (в том числе и C. albicans) при хранении на средах под маслом обнаруживаются признаки утраты спороношения, уменьшения скорости роста. Кроме того, к недостаткам хранения на питательных средах под слоем вазелинового масла следует отнести и возможность инфицирования лаборатории и ее персонала из-за разбрызгивания масла при обжигании петли (см. Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф. Герхарда, М., 1983, т. 1, с. 535, и Промышленная микробиология. /Под ред. Н.С. Егорова. М., 1989, с. 149-167). Кроме того, все вышеперечисленные методы подразумевают первоначальное культивирование грибов на различных питательных средах до достижения определенной концентрации клеток C. albicans.

Наиболее близкой к заявляемой среде является среда Сабуро, содержащая глюкозу, пептон, агар и воду (см. Методы исследования в ветеринарной микологии. /Под ред. Н.А. Спесивцевой. М.: Колос, 1971), используемая для культивирования как плесневых, так и дрожжевидных грибков.

Но данная среда считается "пробной", то есть используется как диагностическая, и выживаемость спор Candida через 30 суток после хранения на ней снижается в 5-7 раз.

Изобретение направлено на решение задачи получения максимального количества спор Candida albicans в минимальные сроки при одновременном повышении выживаемости и жизнеспособности грибковых клеток при хранении, исключающем частые пересевы, использование методов лиофилизации и применение минеральных масел.

Для решения поставленной задачи питательная среда для культивирования грибов рода Candida, содержащая глюкозу, растворитель, пептон и агар, содержит в качестве растворителя солевой раствор Хенкса и дополнительно имеет гидролизат лактальбумина и сыворотку крови крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Глюкоза - 4,0-5,0
Агар - 3,5-3,6
Пептон - 0,95-1,05
Гидролизат лактальбумина - 0,45-0,55
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 9,0-11,0
Солевой раствор Хенкса - Остальное
В известных источниках патентной и научно-технической информации не описано питательных сред для культивирования грибов рода Candida на основе солевого раствора Хенкса, лактальбумина, сыворотки крови и компонентов среды Сабуро, позволяющей повысить выход спор при минимальных сроках культивирования и повышения их жизнеспособности и выживаемости при хранении за счет количественного подбора ингредиентов среды.

Известно использование солевого раствора Хенкса, сыворотки крови и сухого фермантативного гидролизата мышечных белков в качестве питательных сред для выращивания культур клеток животных и последующего культивирования на них вирусов (см., например, авт. св. СССР N 1025722, кл. C 12 N 1/00, опубл. 30.06.83). Однако такие среды не пригодны для выращивания грибов рода Candida.

Вышеописанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом техническом решении "изобретательского уровня".

Глюкоза - белые кристаллы или мелкокристаллический порошок без запаха, сладкого вкуса. Хорошо растворяется в воде. Водный раствор глюкозы при слабом нагревании должен быть прозрачным и бесцветным.

Солевой раствор Хенкса с лактальбумином и сывороткой крови - прозрачная жидкость с растворенными в ней солями в физиологических соотношениях, pH 7,2-7,4, розово-красного цвета, придаваемого присутствием фенолового красного, являющегося индикатором концентрации гидроксильных ионов.

Гидролизат лактальбумина - ферментативный гидролизат белка сыворотки молока. Бело-желтый порошок, хорошо растворимый в воде. Используется в конечной 0,5%-ной концентрации.

Сыворотка крови крупного рогатого скота, без консерванта, нативная - продукт, получаемый при отстаивании цельной крови, лишенной фибрина и форменных элементов. Представляет собой слегка опалесцирующую жидкость от желтоватого до бледно-розового цвета. Используется в конечной 10%-ной концентрации. Является протектором клеточных элементов гриба при хранении.

Агар питательный сухой - желирующее вещество, получаемое из водорослей, для создания плотности сред и обогащенный питательными веществами в виде гидролизатов независимо от происхождения, pH 7,2-7,4.

Пептон - продукт, получаемый в результате неполного ферментативного гидролиза белков пепсином, со своеобразным запахом, желто-кремового цвета. Растворяется в кипящей воде.

Состав солевого раствора (в граммах) следующий:
Хлористый натрий (NaCl) - 0,8
Хлористый калий (KCl) - 0,04
Сернокислый магний (MgSO₄•7H₂O) - 0,01
Хлористый магний (MgCl•6H₂O) - 0,01
Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na₂HPO₄) - 0,006
Однозамещенный фосфорнокислый калий (KH₂PO₄) - 0,006
Хлористый кальций (CaCl₂) - 0,014
Феноловый красный - 0,002
Бидистиллированная вода, pH 7,0-7,2 - до 100
Соли являются источниками минерального питания грибов, а также обеспечивают буферность питательного субстрата.

Питательную среду готовят следующим образом.

К солевому раствору Хенкса с гидролизатом лактальбумина и сывороткой крови добавляют порошковую глюкозу в количестве 1:20-1:25 от объема раствора, перемешивают и доводят смесь до кипения. В кипящий раствор вносят при помешивании пептон в количестве 1:100 от объема раствора и агар в количестве 1:35-1:36. Полученный субстрат автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин.

Пример приготовления среды.

К 100 мл раствора Хенкса (с гидролизатом лактальбумина и сывороткой крови) добавляют 4-5 г порошка глюкозы и подвергают нагреванию. В кипящий раствор вносят 1 г пептона и тщательно перемешивают. Затем добавляют 3,5 г агара, перемешивают до полного расплавления последнего. Полученную смесь подвергают стерилизации автоклавированием. После стерилизации слегка остуженный субстрат разливают по чашкам Петри или пробиркам.

При микологическом изучении среды, приготовленной согласно предлагаемому способу, использовали сравнительные посевы и подсчет спор при культивировании, а также такие критерии оценки, как жизнеспособность и выживаемость клеток грибов рода Candida при хранении.

В качестве посевного материала использовали штамм C. albicans. Посевы инкубировали при 28^oC. Отбор проб проводили через каждые трое суток (3-6-9-12) и подсчитывали в камере Горяева по общепринятой методике. Для определения жизнеспособности культуры проводили подсчет колоний после высева 30-суточной культуры в последовательных десятикратных разведениях и инкубировали их на соответствующих средах в течение 48 ч при констатации роста. Выживаемость определяли по отношению числа грибковых клеток к первоначальному числу спор (до начала хранения), принятому за 100%. Для этого в пробирки с хранившимися культурами вносили 1 мл физиологического раствора, производили смыв клеток гриба и в дальнейшем пересев на свежую аналогичную питательную среду в объеме 0,1 мл и в десятикратных разведениях. Через 48 ч после появления первичных колоний производили их подсчет. Полученные экспериментальные данные представлены в табл. 1 и 2.

Как видно из данных, представленных в табл. 1, среда предлагаемого состава превосходит прототип по урожаю спор Candida albicans на всех этапах культивирования (в 1,36-2,0 раз). Кроме того, на среде Городковой рост клеток завершается уже к 6-ти суткам культивирования, а на заявляемой среде накопление продолжается до 12 суток.

Из данных, приведенных в табл. 2, видно, что жизнеспособность спор грибов Candida проявляется на предлагаемой среде в разведении 10^-6, тогда как на традиционных средах - только до разведения 10^-5. Кроме того, количественный рост колоний во всех разведениях отличается в 3-5 раз в пользу заявляемой среды.

Полученные экспериментальные данные, приведенные в табл. 1 и 2, свидетельствуют о том, что интенсивность, жизнеспособность и выживаемость микроскопических грибков рода Candida зависят от состава сред.

В результате исследований выявлено, что лучшей средой для максимального накопления спор в кратчайшие сроки является заявляемая среда. Данная питательная среда способствует выживаемости и обеспечивает достаточную жизнеспособность культуры C. aldicans.

Использование: биотехнология, в частности микология, и может быть использовано для отпимизации сред для выращивания дрожжевидных грибов рода Candida. Сущность изобретения: питательная среда содержит, мас.%: глюкозу 4 - 5; пептон 0,95 - 1,05; агар 3,5 - 3,6; гидролизат лактальбумина 0,45 - 0,55; сыворотку крови крупного рогатого скота 9 - 11; солевой раствор Хенкса - остальное. Среда позволяет интенсифицировать рост дрожжевидных грибов Candida albicans. 2 табл.

Питательная среда для культивирования дрожжевидных грибов рода Candida, содержащая глюкозу, пептон, агар и растворитель, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гидролизат лактальбумина и сыворотку крови крупного рогатого скота, а в качестве растворителя - солевой раствор Хенкса при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Глюкоза - 4,0 - 5,0
Пептон - 0,95 - 1,05
Агар - 3,5 - 3,6
Гидролизат лактальбумина - 0,45 - 0,55
Сыворотка крови крупного рогатого скота - 9,0 - 11,0
Солевой раствор Хенкса - Остальное0