СПОСОБ КОНТРОЛЯ ИНГИБИРУЮЩИХ СВОЙСТВ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ФЛОРЫ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛ Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12Q1/22 

Изобретение относится к медицинской, санитарной и ветеринарной микробиологии и может быть использовано при контроле качества питательной среды для выделения бруцелл из контаминированного посторонними микроорганизмами материала. С этой целью на поверхность плотной питательно среды засевают микробные взвеси тест-штаммов Staphylococcus aureus АТСС 25923, Streptococcus faecalis 602 и Proteus vulgaris HX 19 222, с последующим культивированием и учетом результатов посева.

Для успешного выделения бруцелл из загрязненных посторонней микрофлорой объектов необходимо выполнение двух условий. Во-первых, среда должна быть высокопитательной, т.к. бруцеллы требовательны к источникам питания и растут медленнее большинства других микроорганизмов. Во-вторых, необходимо максимально подавить рост микробов-ассоциантов, как правило, быстрорастущих. В противном случае питательные вещества будут исчерпаны, кроме того, некоторые представители посторонней микрофлоры обладают антимикробной активностью. В средах для выделения бруцелл в качестве ингибиторов посторонних грамотрицательных микроорганизмов наиболее часто применяются антибиотик полимиксин В и антибактериальное вещество - налидиксовая кислота, грамположительной - антибиотики ванкомицин и бацитрацин, а также красители - генцианвиолет и малахитовый зеленый. Подавление роста микробов-ассоциантов должно проводиться аккуратно, т.к. бруцеллы чувствительны к большинству антимикробных веществ: практически отсутствуют селективные агенты, к которым эти микроорганизмы не были бы чувствительны в той или иной мере. Вышеизложенные обстоятельства обуславливают значимость контроля ингибирующих свойств питательной среды для выделения бруцелл.

Известен способ контроля ингибирующих свойств питательной среды для выделения бруцелл из материала, содержащего сопутствующую микрофлору, с помощью тест-штамма Staphylococcus aureus АТСС 25923 [1]. Основа данной среды включает г/л: пептон - 10,0; мясной экстракт - 5,0; глюкозу - 10,0; натрия хлорид - 5,0; агар микробиологический - 15,0; воду дистиллированную - до 1 л. После регидратации и автоклавирования основы среды в нее вводится селективная добавка, содержащая полимиксин В - 5000 ME; бацитрацин - 25000 ME; циклогексимид - 0,1 г; налидиксовую кислоту -0,005 г; нистатин - 100000 ME; ванкомицин - 0,02 г.

При проведении контроля на поверхность питательной среды засевается микробная взвесь тест-штамма стафилококков с последующим культивированием при температуре 37°С. Рост тест-штамма должен отсутствовать.

Недостатком данного способа является возможность осуществления контроля ингибиции только в отношении ограниченного числа грамположительных микроорганизмов, в средах, содержащих в качестве единственного селективного агента грамположительной микрофлоры бацитрацин. Эффективность подавления большинства видов грамположительных микроорганизмов в средах, включающих другие селективные агенты, а также грамотрицательных микроорганизмов данным способом определить нельзя. Контроль с помощью только одного тест-штамма Staphylococcus aureus АТСС 25923 будет неэффективным и в случае сочетанного применения ингибиторов грамположительной микрофлоры. Так в случае совместного использования бацитрацина с малахитовым зеленым достаточно концентрации последнего 0,00025 г в 1 литре среды при малом содержании и даже полном отсутствии бацитрацина для подавления роста стафилококков. Эффективная концентрация малахитового зеленого, подавляющая рост большинства грамположительных микроорганизмов составляет 0,001 г/л. Аналогичный результат наблюдается при использовании генцианвиолета и ряда других ингибиторов грамположительной микрофлоры. Следует также учесть, что бацитрацин является дефицитным и дорогим антибиотиком, стоимость которого ограничивает его применение даже в терапевтических целях [2]. Вследствие дефицитности и высокой стоимости бацитрацина в питательных средах для выделения бруцелл в Российской Федерации используют другие ингибиторы грамположительной микрофлоры.

Известна методика контроля ингибирующих свойств в отношении бактериальной флоры питательного агара для культивирования и выделения возбудителя бруцеллеза сухого (бруцеллагара), выпускаемого по ТУ 9398-170-78095326-2012 ФГУН ГНЦ ПМБ (Оболенск) и содержащего г/л: панкреатического гидролизата рыбной муки - 7,5; пептона мясного - 7,5; панкреатического гидролизата казеина - 10,0; стимулятора роста гемофильных микроорганизмов - 5,0; дрожжевого экстракта - 3,0; D-глюкозы - 2,0; натрия хлорида - 3,5; тиамина хлорида - 0,005; эритрита - 0,01; натрия пиросерни-стокислого - 0,1; агара микробиологического - 10,0±3,0. Для подавления бактериальной флоры к 1 л бруцеллагара прибавляют селективную добавку, включающую 5 мг полимиксина В. Методика предполагает использование штамма Escherichia coli АТСС 25922, рост которого должен полностью подавляться при посеве на поверхность среды, разлитой в чашки Петри по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10^-4 не позднее 48-72 ч инкубации при температуре (37±1)°С [3].

Однако данная методика не позволяет контролировать подавление грамположительных микроорганизмов и части грамотрицательной микрофлоры, в том числе часто встречающихся во внешней среде микроорганизмов рода Proteus. Контроль ингибирующих свойств среды в отношении микроорганизмов данного рода имеет большую практическую значимость, т.к. во-первых - протеи достаточно широко распространены в объектах внешней среды, в частности они, присутствуют в кишечнике здорового человека и многих животных, обнаруживаются в навозе, почве и загрязненных водах, а во-вторых - на плотных питательных средах многие штаммы протея растут в виде «роения» т.е., в виде сплошной пленки способной распространяться на всю поверхность плотной питательной среды покрывая колонии других микроорганизмов, и делая невозможным выделение чистой культуры.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является процедура контроля ингибирующих свойств питательной среды для выделения бруцелл, включающей (г/л): питательный бульон для культивирования микроорганизмов - 14,0-16,0; пептон ферментативный - 9,0-11,0; витаминный препарат "ЭКД" - 4,0-6,0; D(+) глюкоза - 0,5-1,5; натрия хлорид - 4,0-6,0; метабисульфит натрия - 0,05-0,15; кристаллический фиолетовый - 0,0005-0,0015; налидиксовая кислота - 0,015-0,025; агар микробиологический - 10,0-12,0 [4]. Процедура предполагает использование тест-штаммов S. aureus 209-Р, Е. coli 168/59, P. vulgaris НХ19 222, рост которых при посеве по 0,1 мл микробных взвесей из разведения 10" на контролируемую среду должен отсутствовать.

Следует отметить, что данная процедура более информативна, чем вышеперечисленные способы контроля. Ее недостатком является отсутствие контроля ингибиции грамположительных микроорганизмов большим количеством часто применяемых антимикробных агентов.

Целью изобретения является повышение информативности способа контроля ингибирующих свойств питательной среды для выделения бруцелл за счет использования тест-штаммов грамположительных микроорганизмов, отличающихся по спектру резистентности к различным антимикробным агентам.

Поставленная цель достигается тем, что для контроля ингибирующих свойств среды для выделения бруцелл в отношении бактериальной микрофлоры используются тест-штаммы Staphylococcus aureus АТСС 25923, Streptococcus faecalis 602 и Proteus vulgaris HX 19 222.

Предложенный способ заключается в том, что тест-культуры P. vulgaris НХ 19 222, S. aureus АТСС 25923 и S. faecalis 602 выращивают на поверхности скошенного питательного агара при температуре (37±1)°С в течение (22±2) ч. Выросшие культуры тест-штаммов смывают с поверхности скошенных агаров 0,9%-ным раствором натрия хлорида, доводят концентрацию микробных взвесей до 10 единиц по стандартному образцу мутности ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России ОСО 42-28-85П соответствующего года выпуска. Полученную взвесь культуры каждого штамма десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводят до разведения 10^-4. В процессе разведения перенос взвеси в следующую пробирку производят стерильной пипеткой объемом 1 мл, меняя пипетку для каждого разведения.

По 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^-4 высевают на 3 чашки Петри испытываемой среды и равномерно распределяют покачиванием по всей поверхности. Посевы P. vulgaris НХ 19 222, S. aureus АТСС 25923 и S. faecalis 602 инкубируют при температуре (37±1)°С. Учет результатов посевов проводят ежедневно в течение 10 суток инкубации. Рост колоний микроорганизмов должен отсутствовать.

Тест-штамм S. faecalis 602, существенно более резистентный к синтетическим красителям и некоторым другим веществам, применяемым для подавления грамположительных микроорганизмов, чем тест-штаммы стафилококков (5, 6). Рост последних прекращается, если концентрация наиболее часто применяемых кристаллического фиолетового, малахитового зеленого составляет 12,5-25% концентрации, ингибирующей рост S. faecalis 602, что не может гарантировать надлежащую ингибицию более устойчивой грамположительной микрофлоры. Так в соответствии с патентом РФ 2266956 содержание кристаллического фиолетового в среде варьируется в пределах от 0,0005 до 0,0015 г/л, а рост S. faecalis 602 ингибируется только при концентрации красителя 0,0025-0,005 г/л.

Касаясь применения при контроле ингибирующих свойств среды штаммов P. vulgaris НХ 19 222 и Е. coli 168/59 следует принять во внимание различие спектров антимикробного действия полимиксина В и налидиксовой кислоты, наиболее часто применяемых в составе сред для выделения бруцелл. (7, 8). Оба вещества проявляют активность в отношении большинства грамотрицательных бактерий (кишечной палочки, сальмонелл, шигелл, клеб-сиелл, энтеробактера и др.), однако полимиксин В практически не ингибирует микроорганизмы рода Proteus, в то время как налидиксовая кислота весьма интенсивно подавляет рост данных микроорганизмов. При проведении контроля троля с помощью штамма Е. coli АТСС 25922 и оптимальной в среде концентрации полимиксина В недостаточное содержание налидиксовой кислоты может быть не обнаружено.

Из вышесказанного следует, что контроль ингибиции грамотрицательной микрофлоры с помощью штамма кишечной палочки не дает дополнительной информации, избыточен и в то же время ведет к увеличению трудозатрат.

Информативность применения предложенного способа контроля ингибирующих свойств питательной среды для выделения бруцелл, по сравнению с известными, оценивали путем посева по 0,1 мл микробных взвесей из разведения 10^-4 тест-штаммов Е. coli 168/59, P. vulgaris ИХ 19 222, S. aureus АТСС 25923 и S. faecalis 602 на чашки Петри со средой культивирования бруцелл следующего состава (г/л): ферментативный гидролизат желатина (из расчета содержания в 1 л среды сухих веществ) 8,0; ферментативный гидролизат рыбной муки (из расчета содержания в 1 л среды сухих веществ) 4,0; дрожжевой экстракт 2,0; натрий хлористый 5,0; глюкоза 1,0; натрий сернисто-кислый пиро 0,1; агар микробиологический 9,0. В среду культивирования вводили селективную добавку, содержащую 4 антимикробных агента в концентрациях полностью подавляющих рост посторонних микроорганизмов, и добавки, в которых один из агентов отсутствовал или его концентрация была уменьшена.

С целью контроля жизнеспособности тест-штаммов применяли питательную среду для культивирования бруцелл без добавления селективных агентов. Для оценки степени ингибиции бруцелл на все среды проводили параллельный посев тест-штамма Brucella abortus 19 В А в дозе 100 микробных клеток на чашку Петри (по 0,1 мл из разведения 10^-6). За приемлемый уровень ингибиции бруцелл принимали рост не менее 50% колоний, от числа, выросших на среде без ингибиторов.

Заявляемый способ контроля ингибирующих свойств питательной среды для выделения бруцелл из контаминированного посторонней микрофлорой материала иллюстрируется нижеследующими примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1 (эталон - рецептура, содержащая 4 антимикробных агента).

К 1 л питательной среды для культивирования бруцелл добавляли бацитрацина 3000 ME, малахитового зеленого 0,001 г, полимиксина В 3000 ME, налидиксовой кислоты 0,0025 г.

Пример 2 (исключен бацитрацин).

К 1 л питательной среды для культивирования бруцелл добавляли малахитового зеленого 0,001 г, полимиксина В 3000 ME, налидиксовой кислоты 0,0025 г.

Пример 3 (исключен малахитовый зеленый).

К 1 л питательной среды для культивирования бруцелл добавляли бацитрацина 3000 ME, полимиксина В 3000 ME, налидиксовой кислоты 0,0025 г.

Пример 4 (уменьшено содержание полимиксина В).

К 1 л питательной среды для культивирования бруцелл добавляли бацитрацина 3000 ME, малахитового зеленого 0,001 г, полимиксина В 750 ME, налидиксовой кислоты 0,0025 г.

Пример 5 (уменьшено содержание налидиксовой кислоты).

К 1 л питательной среды для культивирования бруцелл добавляли бацитрацина 3000 ME, малахитового зеленого 0,001 г, полимиксина В 3000 ME, налидиксовой кислоты 0,000625 г.

Полученные в примерах результаты обобщены в табл.1.

Как видно из таблицы, использование тест-штамма Streptococcus faecalis 602 позволило обнаружить отсутствие в примере №2 бацитрацина, в то время как применение Staphylococcus aureus АТСС 25923 оказалось неэффективным. В то же время последний штамм выявил отсутствие малахитового зеленого (пример №3).

Аналогичным образом с помощью тест-штамма P. vulgaris НХ 19 222 выявлена малая концентрация налидиксовой кислоты в примере №5. Контроль тест-штаммом Е. coli АТСС 25922 в данном примере был неинформативным, из-за ингибиции микроорганизмов полимиксином В.

Обнаружить низкое содержание полимиксина В в примере №4 не удалось ни одним из использованных тест-штаммов, т.к. они оба ингибируются налидиксовой кислотой. Данный результат свидетельствует о неэффективности проведения контроля с помощью тест-штамма Е. coli АТСС

Таким образом, заявленный способ определения ингибирующих свойств в отношении бактериальной флоры питательного агара для культивирования и выделения возбудителя бруцеллеза по сравнению с известными более информативен, т.к. позволяет обнаружить недостаточное подавление более широкого спектра микроорганизмов, в том числе резистентных к большинству антимикробных агентов грамположительных микроорганизмов.

Его использование позволит улучшить контроль биологических свойств питательной среды для выделения бруцелл из контаминированного материала и тем самым повысить эффективность обнаружения возбудителей бруцеллеза при бактериологических исследованиях.

Список используемой литературы

1. The OXOID Manual, 9th Edition, 2006. P. 2-78

2. Циммерман Я.С. Клиническая гастроэнтерология: избранные разделы. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009, - С. 225.

3. Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований «Питательный агар для культивирования и выделения возбудителя бруцеллеза сухой (Бруцеллагар)» Утверждена Приказом Росздрав-надзора №7031 -Пр/13 от 06.12.2013 г.

4. Патент РФ №2266956. Опубл. 27.12.2005, Бюл. №36.

5. Сычева М.В., Карташева О.Л., Щепитова Н.Е., Сафронов Ал.А. Антибио-тикорезистентность бактерий рода Enterococcus, выделенных из организма человека в норме и при патологии. Антибиотики и химиотерапия. 2016; 61; 7-8: 27-32.

6. Красная Ю.В., Нестеров А.С., Потатуркина-Нестерова Н.И. Значение бактерий рода Enterococcus в жизнедеятельности человека. Современные проблемы науки и образования. 2014. №6.; [Электронный ресурс] URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=l6620 (дата обращения: 16.10.2018).

7. Группа хинолонов/фторхинолонов. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Под редакцией Страчунский Л.С., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н. 2007; [Электронный ресурс] URL: http://www.antibiotic.ru/ab/038-42.shtml (дата обращения: 16.10.2018).

8. Щетинин Н.В. Полимиксины новый взгляд на известные антибиотики. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000, Т. 2. - №3: 68-73.

Изобретение относится к медицинской, санитарной и ветеринарной микробиологии и может быть использовано при контроле качества питательной среды для выделения бруцелл из контаминированного посторонними микроорганизмами материала. Способ контроля ингибирующих свойств в отношении бактериальной флоры питательной среды для выделения бруцелл предусматривает выращивание тест-культуры на поверхности скошенного питательного агара. Делают смыв с поверхности скошенного агара 0,9%-ным раствором натрия хлорида, доводят микробные взвеси до концентрации 10⁵ м.к./мл и высевают по 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма на 3 чашки Петри испытываемой среды. При этом в качестве тест-штаммов используют Streptococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus faecalis 602 и Proteus vulgaris HX 19222. По отсутствию роста тест-культур судят об ингибирующих свойствах питательной среды. Изобретение позволяет повысить информативность способа контроля ингибирующих свойств питательной среды для выделения бруцелл. 1 табл., 5 пр.

Способ контроля ингибирующих свойств в отношении бактериальной флоры питательной среды для выделения бруцелл, заключающийся в том, что тест-культуры выращивают на поверхности скошенного питательного агара, смывают с поверхности скошенного агара 0,9%-ным раствором натрия хлорида, доводят микробные взвеси до концентрации 105 м.к./мл и высевают по 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма на 3 чашки Петри испытываемой среды, отличающийся тем, что в качестве тест-штаммов используют Streptococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus faecalis 602 и Proteus vulgaris HX 19222, при этом по отсутствию их роста судят об ингибирующих свойствах питательной среды.