ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА ВОЗБУДИТЕЛЯ РОЖИ СВИНЕЙ ERYSIPELOTHRIX RHUISIPATHIE Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к общей биотехнологии и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для приготовления микробиологических питательных сред для наращивания биомассы штамма возбудителя рожи свиней.

Возбудитель рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie является культурой, требовательной к условиям питания. При активации штамма после длительного хранения большое значение имеет скорость наращивания биомассы. Как правило, для научных и коммерческих целей применяют традиционные питательные среды на основе мясного сырья. Мясопептонный бульон МПБ и ΜΠΑ из перевара Хоттингера обеспечивают хороший рост микроорганизмов без изменения их культуральных и биологических свойств. Гидролизаты кильки и рыбной муки также широко применяются при производстве сухих питательных сред для культивирования микроорганизмов, т.к. белки рыбы по своему строению и аминокислотному составу наиболее сходны с белками мяса и способны удовлетворить потребности микроорганизмов в органических соединениях азота. Тем не менее, поиск высококачественных и недорогих питательных сред является актуальной задачей.

Известна Питательная среда для выращивания микроорганизмов (см. патент № 2089609, С1, C12N1/20, RU), содержащая источник азотного питания, хлористый натрий, агар. В качестве азотного питания используют панкреатический гидролизат кормовой рыбной муки с содержанием аминного азота 4,4±0,2%, общего азота 12,±0,5%. Существенным недостатком является то, что гидролизат имеет высокую стоимость, из-за необходимости ввоза из-за границы. Наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому изобретению является «Поживне середовище «Аквамеда» для культивування микроорганизмов» (див. Пат. №34711 U, C12N1/20, UA), где питательной средой является смесь щелочного гидролизата из моллюсков с кислотным гидролизатом из рыбного сырья в соотношении 3:1 - 1:3. Конечная концентрация содержания аминного азота составляла 60-120 мг %. В состав среды также входят глюкоза или мальтоза, пептон и агар. Недостатком известной среды является недостаточная для культивирования штамма возбудителя рожи свиней конечная концентращя содержания аминного азота.

Признаками, общими с существенными признаками изобретения Питательная среда для культивирования штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie, является то, что в состав среды входят пептон ферментативный, а также щелочной гидролизат из морского сырья.

В основу изобретения Питательная среда для культивирования штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie поставлена задача путем использования продуктов морского генеза сконструировать питательную среду, которая обеспечит оптимальный рост штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie для приготовления вакцины.

Поставленная задача достигается тем, что для культивирования вакцинного штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie готовят питательную среду, состоящую из рыбного автолизата, в который дополнительно вводят 20-50% щелочного мидийного гидролизата.

Мидийный гидролизат и автолизат кильки получают по с известным технологиям (см. Крутченский Г.В., Кулясова В.Е. К вопросу получения белковых гидролиза-тов из моллюска леды//Известия ТИНРО.- 1976.- 99.- С. 102-104); Лихварь Н.А. Сухие питательные среды из свежих и замороженных отходов рыбной промышленности. Ученые записки ДагНИВИ по производству питательных сред. Махачкала, 1956, 2.).

Авторы исследовали уровень формирования биомассы промышленного штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie №286 на различных средах (табл. 1).

Как видно из табл. 1 культура проявляла на всех средах, кроме эталонной, невысокую интенсивность роста, что свидетельствует о требовательности к условиям питания. На некоторых средах к тому же отмечали полиморфизм палочек возбудителя рожи свиней: появлялись удлиненные цепочки E.rhuisipathie, что является признаком неблагоприятных условий культивирования, в частности из-за несбалансированного питания.

Далее исследовали среды, которые кроме гидролизатов кильки содержали от О до 50% мидийного гидролизата (табл. 2). Культивировали штамм в стандартных температурных условиях в течение 48 часов. Оптическую плотность измеряли на фото-электрокалориметре при длине волны 545 нм и толщине кюветы 5 мм. Контрольным образцом было незасеянная среда такого же состава.

Как видно из табл. 2, добавление в питательную среду мидийного гидролизата в количестве 20% от объема обеспечивало удвоение биомассы как в эталонной среде (0,163 против 0,081), так и в опыте (0,130 против 0,063), а внесение 50% мидийного гидролизата в среду утраивало прирост. При этом разница между опытной и эталонной средой, несмотря на отсутствие в исследуемой среде глюкозы, с увеличением содержания мидийного гиролизата постепенно уменьшалась.

Благодаря высокому содержанию аминного азота (показатель питательности сред для выращивания микроорганизмов) гидролизаты из морепродуктов являются ценным сырьем для биотехнологических производств. В автолизате рыбы содержится в 4-10 раз больше аминного азота, чем необходимо для продуктивного роста промысловых штаммов. Мидийный гидролизат, при содержании его в среде не больше 20%, удваивает бактериальную массу. Таким образом объединение рыбного автолизата и щелочного мидийного гидролизата позволяет получить сбалансированную питательную среду для культивирования возбудителя рожи свиней.

Пример реализации способа. Готовили опытную серию вакцины против рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie №286 в объеме 3 дм³. Предварительно определили, что рН рыбного гидролизата составляла 6,0, a bmict амшного азоту -740 мг%. В мидийном гидролизате рН 7,7, а содержание амина азота 247мг%. Из этих компонентов готовили жидкие и твердые питательные среды по стандартным прописям для МПБ. В состав среды для культивирования промышленного штамма на предлагаемой питательной среде входила смесь рыбного автолизата и 20% по объему щелочного мидийного гидролизата, пептон ферментативный - 1% от общего объема, калий фосфорнокислый - 0,3%, натрий фосфорнокислый - 1, 8%, рН среды составляла 7,3-7,4. Штамм высевали в пробирки с жидкой средой, затем пересевали во флаконы с бульонами, а после культивирования в соответствующих условиях, пересевали во флаконы с такой же средой и культивировали в соответствующих условиях. По окончании культивирования определяли типичность и чистоту культуры микроскопией мазков из сред и устанавливали концентрацию микробных клеток.

Культура промышленного штамма возбудителя рожи свиней, полученная на средах из гидролизатов, по сравнению со средами, полученными с мясного сырья, не отличались по культурно-морфологическими свойствам и отвечала требованиям паспортных данных на штамм. Концентрация микробных клеток в 1 см должна составлять не менее 50 млн. Авторами получены следующие данные: на питательных средах из морепродуктов концентрация микробных клеток составила 50 млн., а на средах, изготовленных из отвара Хоттингера - 70 млн.

Инактивацию микробных культур проводили с использованием формальдегида в концентрации 0,4%. Проверку полноты инактивации проводили путем посевов полученной вакцины на питательные среды, микроскопией окрашенных по Грамму мазков. Контроль на безвредность вакцины проводили на 5 белых мышах массой 18-20 г, вводя им внутрибрюшинно по 0,3см3. Результаты наблюдения за животными в течение 16 суток показали, что вакцина безвредна: подопытные животные оставались живыми, нормально питались, изменений в поведении не отмечено.

Контроль иммуногенной активности проводили на тех же белых мышах после прививки вакциной. Мышей заражали контрольным штаммом возбудителя рожи в смертельной дозе. Все контрольные мыши (10 голов), которые не были привиты, погибли в течение 4-6 суток, все вакцинированные выжили в течение 10 суток. Исходя из результатов этих исследований, сделан вывод, что изготовленная вакцина является имунногенно-активной.

Таким образом, заявленная питательная середа с использованием продуктов морского генеза, обеспечивает рост штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie, пригодно для приготовления эффективной вакцины.

Питательная среда для культивирования штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie, относится к общей биотехнологии и ветеринарной микробиологии и может быть использована для приготовления микробиологических питательных сред для наращивания биомассы штамма возбудителя рожи свиней.

В питательной среде в качестве источника азотного питания используют смесь рыбного автолизата и щелочного мидийного гидролизата при следующем соотношении компонентов:

щелочной мидийный гидролизат 20-50% пептон ферментативний 1% калий фосфорнокислый 0,3% натрий фосфорнокислый 1,8% рыбный автолизат остальное.

Питательная среда для культивирования штамма возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhuisipathie, в состав которой входят пептон ферментативный, калий фосфорнокислый, натрий фосфорнокислый, а также гидролизат из морского сырья, отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания используют смесь рыбного автолизата и щелочного мидийного гидролизата при следующем соотношении компонентов:
щелочной мидийный гидролизат 20-50% пептон ферментативний 1% калий фосфорнокислый 0,3% натрий фосфорнокислый 1,8% рыбный автолизат остальное.