ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к питательным средам для культивирования микроорганизмов, и может быть использовано при промышленном приготовлении бактерийных вакцин.

Уровень техники

Известна питательная среда следующего состава г/л: агар-агар - 20,0; гидролизат говяжьего мяса, содержащий аминный азот - 0,12%; натрий хлористый - 5,0; 20% гидроокись натрия - 0,002; дистиллированная вода до 1 л (см. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, Биргер М.О., 1972 г., с.53).

Недостатком данной среды является ее высокая себестоимость, низкое качество.

Известна питательная среда для культивирования широкого спектра микроорганизмов, включающая, г/л: гидролизат кильки панкреатический - 17,9; натрий хлорид - 7,7±0,3; агар микробиологический - 11,2±1,2; рН 7,3±0,2, дистиллированную воду (см. справочник по микробиологическим питательным средам, Меджидов М.М., 2003 г., с.26).

Питательная среда должна обеспечивать на всех засеянных чашках рост тест-штаммов: Shigella flexneri la 8516 и Shigella sonnei «S. Form» при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^-6 через 18-20 ч инкубации при температуре (37±1)°С в виде бесцветных прозрачных круглых колоний диаметром (1,5±0,5) мм; тест-штаммов Pseudomonas aeruginosa 27/99 и Serratia marcescens-1 с образованием сине-зеленого и красного пигментов соответственно через 18-20 ч инкубации при температуре (37±1)°С - для Р. aeruginosa 27/99 и (22±2)°С для S. marcescens-1 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси, соответствующей 10 единицам по ОСО 42-28-59-85 (Фармакопейная статья №42-3520-98., с.3).

Недостатком данной среды является ее высокая себестоимость, низкое качество.

Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятая авторами за прототип является питательная среда для культивирования микроорганизмов, включающая питательную основу, натрий хлористый, агар микробиологический, дистиллированную воду, при этом она дополнительно содержит натрий фосфорнокислый 2-замещенный и сульфит натрия, а в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат молок лососевых рыб при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат молок лососевых рыб 380-580 Натрий хлористый 4,0-6,0 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 3,0-5,0 Сульфит натрия 0,3-0,6 Агар микробиологический 11,0-13,0 Дистиллированная вода остальное

(см. пат. №2348686, кл. C12N 1/20, C12Q 1/04, опубл. 10.03.2009 г.).

Недостатком данной питательной среды является высокая ее себестоимость.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка получения качественной и дешевой питательной среды для культивирования микроорганизмов.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к повышению качества и удешевлению получения питательной среды.

Технический результат достигается с помощью питательной среды для культивирования микроорганизмов, включающей питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, сульфит натрия, агар микробиологический и дистиллированную воду, при этом в качестве питательной основы используют ферментативный гидролизат калифорнийских червей при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат калифорнийский червей 100,0-300,0 Натрий хлористый 3,0-7,0 Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 2,0-6,0 Агар микробиологический 10,0-14,0 Сульфит натрия 0,2-0,7 Дистиллированная вода остальное

Сущность получения питательной среды для культивирования микроорганизмов заключается в следующем.

Питательную среду готовят на основе ферментативного гидролизата из биомассы калифорнийских червей для выращивания микроорганизмов следующим образом. Биомассу калифорнийских червей в количестве 0,5 кг соединяют с 1 л водопроводной воды и кипятят в течение 10 мин. Затем червей отделяют от бульона и измельчают в гомогенизаторе до однородной массы. Бульон остужают до температуры 45-50°С, подщелачивают Na₂CO₃ до рН 8,2 по фенолфталеину. Фарш калифорнийских червей помещают в трехлитровый стеклянный баллон, заливают готовым остывшим бульоном, добавляют 150 г поджелудочной железы КРС. К общему объему содержимого баллона вливают 2% хлороформа, закрывают плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом. Баллон помещают в термокамеру при температуре 37°С. Выдерживают в течение 14 суток, встряхивают в течение первых суток через каждые 15 минут по 5 минут, а в последующие дни через каждые два часа по 5 минут. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. В конце переваривания жидкость фильтруют через ткань Белтинга и 4 слоя фильтровальной бумаги. Измеряют аминный азот. В фильтрат добавляют 2% хлороформа, пробкуют и хранят при температуре от 2 до 8°С.

При биохимическом исследовании в ферментативном гидролизате из биомассы калифорнийских червей были обнаружены органические кислоты (яблочная, аскорбиновая, янтарная, пировиноградная), незаменимые аминокислоты (аргинин солянокислый, треонин, пролин, метионин, лизин солянокислый, валин), витамины (РР, А, С, B₁, B₂), макро- и микроэлементы (Zn, Fe, Na, К, Mg, Ca), углеводы (глюкоза, гликоген, лактоза). Эти данные подтверждают его высокую питательную ценность, затем ферментативный гидролизат калифорнийских червей разбавляют дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14 мг % - 200 мл; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный - 4,0; дистиллированная вода - остальное, нагревают до 60°С, затем добавляют 20% NaOH до рН 8,2 и 2% активированного угля марки «ОУ-А» к объему, кипятят в течение 10 минут. Фильтруют через фильтровальное полотно и двенадцать слоев фильтровальной бумаги, в прозрачный, охлажденный фильтрат добавляют агар микробиологический 12,0, варят 10 минут.

Измеряют рН, значение которого должно соответствовать 7,3±0,2. В случае отклонения значения рН от заданного показателя, его корректируют с помощью 20% раствора натрия гидроокиси (если рН ниже заданного значения) или раствором соляной кислоты в разведении 1:1 (если рН выше заданного значения). Затем добавляют натрий сернистокислый 0,004 г/л (400 мг). Профильтрованный агар должен быть прозрачным (определение проводят визуально). Агар разливают в флаконы, стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 минут.

Примеры конкретного получения питательной среды для культивирования микроорганизмов.

В качестве исходного сырья используют биомассу калифорнийских червей. Наиболее важной составной частью сырья животного происхождения, в том числе и червей, являются белки - высокомолекулярные азотистые органические вещества.

В качестве примера испытывают культуры тест-штаммов S. sonnei S. «form», S. flexneri, S. faecalis-602, S. typhi H-901, E.coli CA-18, которые выращивают на пластинках 2% агара Хоттингера рН 7,2 при температуре 37°С. Затем готовят микробную взвесь 1-суточную культуру тест-штаммов: S. sonnei S. «form», S. flexneri, S. faecalis-602, S. typhi H-901, E.coli CA-18 no оптическому стандарту мутности ОСО, ГИСК им. Л.А. Тарасевича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводят до содержания в 1 мл 1000 м.к.; 100 м.к. Из каждого разведения взвеси культур высевают стерильной пипеткой по 0,01 мл в три чашки Петри, стерильным шпателем распределяют взвесь по поверхности испытуемого агара. Учет результатов проводят через 24-48 часов.

Пример 1. Тест-штаммы S. sonnei S. «form», S. flexneri, S. faecalis-602, S. typhi H-901, E.coli CA-18 выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат калифорнийских червей 100,0; натрий хлористый 3,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 2,0; агар микробиологический 10,0; сульфит натрия 0,2; дистиллированная вода - до 1 литра. При таком соотношении ингредиентов наблюдается типичный рост микроорганизмов в количестве 3-х колоний диаметром 1,0 мм.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но тест-штаммы, указанные выше, выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат калифорнийских червей 150,0; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 3,0; агар микробиологический 11,0; сульфит натрия 0,3; дистиллированная вода - до 1 литра. При таком соотношении ингредиентов наблюдается типичный рост микроорганизмов в количестве 3-х колоний диаметром 1,1 мм.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, но тест-штаммы, указанные выше, выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат калифорнийских червей 200,0; натрий хлористый 5,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 4,0; агар микробиологический 12,0; сульфит натрия 0,4; дистиллированная вода - до 1 литра. При таком соотношении ингредиентов наблюдается типичный рост микроорганизмов в количестве 30 колоний диаметром 1,5 мм.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, но тест-штаммы, указанные выше, выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат калифорнийских червей 250,0; натрий хлористый 6,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 5,0; агар микробиологический 13,0; сульфит натрия 0,6; дистиллированная вода - до 1 литра. При таком соотношении ингредиентов наблюдается типичный рост микроорганизмов в количестве 15 колоний диаметром 1,2 мм.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, но тест-штаммы, указанные выше, выращивают на питательной среде, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат калифорнийских червей 300,0; натрий хлористый 7,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 6,0; агар микробиологический 14,0; сульфит натрия 0,7; дистиллированная вода - остальное. При таком соотношении ингредиентов наблюдается типичный рост микроорганизмов в количестве 6 колоний диаметром 1,0 мм.

Оценка ростовых качеств питательной среды при высеве тест-штамов на питательную среду представлены в таблице.

Таким образом, заявляемая питательная среда, приготовленная на основе ферментативного гидролизата из биомассы калифорнийских червей, вполне может заменить питательную среду на основе из говяжьего мяса и кильки панкреатической.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- повышение качества питательной среды;

- удешевление получения питательной среды;

- возможность широкого использования для культивирования микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к питательным средам для культивирования микроорганизмов, и может быть использовано при промышленном приготовлении бактерийных вакцин. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат из биомассы калифорнийских червей, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, сульфит натрия, агар микробиологический, дистиллированную воду. Изобретение позволяет увеличить количество колоний, выросших микроорганизмов. 1 табл.

Питательная среда для культивирования микроорганизмов, включающая питательную основу, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, сульфит натрия, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы используют ферментативный гидролизат калифорнийских червей при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
ферментативный гидролизат калифорнийских червей 100,0-300,0 натрий хлористый 3,0-7,0 натрий фосфорнокислый 2-замещенный 2,0-6,0 сульфит натрия 0,2-0,7 агар микробиологический 10,0-14,0 дистиллированная вода остальное