ПРОИЗВОДНЫЕ 2-R1-4-R2-6-ПОЛИНИТРОМЕТИЛ-1,3,5-ТРИАЗИНОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2015 года по МПК C07D251/16 C07D403/04 A61K31/53 A61K31/495 A61P31/04 

Изобретение относится к биологически активным соединениям, а именно к полинитрометил-1,3,5-триазинам и их производным, обладающим антибактериальной активностью, и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии.

Проблема разработки антибактериальных препаратов актуальна на протяжении всей истории микробиологии. Среди бактериальных инфекций выделяются такие возбудители особо опасных инфекций, как Yersinia pestis и Vibrio cholerae, относящиеся к I и II группе патогенности и вызывающие тяжелые заболевания у человека с летальностью, достигающей 80-90% при отсутствии своевременного лечения. Существует и целый спектр не столь опасных возбудителей, относящихся к III и IV группе патогенности, тем не менее приводящих иногда к тяжелым формам заболеваний, таким как пневмония, брюшной тиф, менингит, отит, сальмонеллез и т.д. Ввиду постоянно идущей адаптации патогенных микроорганизмов к распространенным лекарственным веществам, давно известные антибиотики потеряли большую часть своей антибактериальной активности, и уже не справляются с возложенной на них ролью. Таким образом, необходимо наличие новых эффективных антибактериальных препаратов, которые бы обладали высокой активностью, низкой токсичностью и продолжительным действием в отношении прокариот, патогенных для человека.

Бактериальные ДНК-метилтрансферазы модифицируют остатки цитозина в положениях C⁵ или N⁴, или остатки аденина в положении N⁶. В составе систем рестрикции-модификации у бактерий и фагов МТазы играют главную роль в защите бактериальной ДНК от расщепления соответствующими по специфичности эндонуклеазами рестрикции. Однако многие бактерии (а также их фаги) кодируют и «одиночные» МТазы, среди которых наиболее многочисленны ферменты семейства Dam, катализирующие метилирование экзоциклической N⁶-аминогруппы аденина в палиндромных последовательностях GATC. Данное семейство включает уже более ста GATC-специфичных МТаз (http://rebase.neb.com), причем все ферменты характеризуются высоким уровнем гомологии первичных структур (табл.1).

Известно, что Dam метилирование влияет на бактериальный фенотип, экспрессию генов, инициацию репликации и пострепликативную репарацию неспаренных оснований ДНК. В последние годы также показано, что Dam МТазы часто ответственны за регуляцию генов, вовлеченных в различные процессы бактериального патогенеза, и влияют на патогенность и/или жизнеспособность штаммов Yersinia spp., Salmonella spp., V.cholerae, H.influenzae, E.coli, P.gingivalis, P.multocida и др. В качестве примера можно привести контроль образования пиелонефрит-ассоциированных пилей (ресничек) и функционирования рар оперона в уропатогенных штаммах E.coli [Hemday A., Krabbe M., Braaten В., Low D. Self-perpetuating epigenetic pili switches in bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 2002. V. 99 Suppi 4. P.16470-16476].

Dam мутантный штамм S.enterica был авирулентен при оральном или интраперитонеальном введении мышам 10000-кратной летальной дозы [Heithoff D.M., Smsheimer R.L., Low D.A., Mahan M.J. An essential role for DNA adenine methylation m bacterial virulence // Science. 1999. V. 284. No.5416. P.967-970]. Dam-минус мутанты Vibrio cholerae и Yersinia pseudotuberculosis оказались нежизнеспособны [Julio S.M., Heithoff D.M., Provenzano D., Klose K.E., Sinsheimer R.L., Low D.A., Mahan M.J. DNA adenine methylase is essential for viability and plays a role in the pathogenesis of Yersinia pseudotuberculosis and Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2001. V. 69. No.12. P.7610-7615].

Известны данные о биологической активности производных 1,3,5-триазинов. Известен ряд производных 1,3,5-триазина, обладающих противовирусной активностью: производные 1,3,5-триазина, обладающие активностью против вирусного гепатита А [Международная заявка (WO) №96/04914, опубл. 22.02.1996]; производные 1,3,5-триазина, обладающие активностью против ретровирусов [Заявка Японии №6016561, опубл. 25.01.1994]; производные 1,3,5-триазина, обладающие активностью против гепатита В [Патент США №6335339, опубл. 01.01.2002].

Известно, что ряд производных 1,3,5-триазина обладает свойством подавлять жизнедеятельность малярийного и кокоцидозного плазмодия, 2,6-диамино-1,2-дигидро-арилметокси-1,3,5-триазины обладают антималярийной активностью [Патент США №3876785, опубл. 08.04.1975]; 1-фенил-замещенные 1,3,5-триазинов эффективны против кокцидиоза у людей и животных [Патент США №3948893, опубл. 06.04.1976].

Известно, что производные 2-R₁-4-R₂-6-полинитрометил-1,3,5-триазинов (где R₁, R₂ - одинаковые или разные алкоксильные (замещенные алкоксильные), арилоксильные (замещенные арилоксильные), аминные заместители (в т.ч. циклические амины и диамины); полинитрометильная группа: C(NO₂)₂CH₂OH, C(NO₂)₂CH₃, C(NO₂)₂CH₂CH₂CN, C(NO₂)₂CH₂CH₂COOR, C(NO₂)₂Cl, C(NO₂)₂Br, C(NO₂)₃) обладают цитотоксической и противоопухолевой активностью [Бахарев В.В., Гидаспов А.А., Булычев Ю.Н. Синтез и цитотоксическая активность 2,4-дизамещенных 1,3,5-триазинилдинитроэтанолов и динитроэтанов // Хим.-фарм. журнал: 2000, т.34 №7, с.6-12; Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Качановская Е.В., Якунина Н.Г., Булычев Ю.Н. Синтез и цитотоксическая активность эфиров и нитрилов 1,3,5-триазинилдинитромасляных кислот // Хим. - фарм. журнал, 2002, т.36, №7, с.26-32; Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Галкина М.В., Екимова Е.В., Булычев Ю.Н., Качановская Е.В., Косарева Е.А., Якунина Н.Г. Синтез и цитотоксическая активность галогендинитрометильных производных 1,3,5-триазина // Хим.-фарм. журнал, 2004, т.38, с.9-15; Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Булычев Ю.Н. Синтез и цитотоксическая активность тринитрометильных производных 1,3,5-триазина // Хим.-фарм. журнал, 2008, т.42, №5, с.11-13], а также антиметастатической (ингибирование метастаз) активностью [Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Федоров Б.С., Фадеев М.А., Коновалова Н.П. Новые антиметастатические препараты на основе хлординитрометил-1,3,5-триазинов // Журнал прикладной химии, 2009, т.82, вып.10, с.1664-1668]. Ряд полинитрометил-1,3,5-триазинов обладает способностью генерировать оксид азота NO [Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Качановская Е.В., Булычев Ю.Н., Левина В.И., Азизов О.В., Арзамасцев А.П., Григорьев Н.Б., Гранин В.Г. Синтез и электрохимическое исследование NO-генерирующей способности полинитрометильных производных 1,3,5-триазина // Хим. - фарм. журнал, 2003, №9, с.12-16].

Известны данные и о противоопухолевой и противораковой активности производных как других триазинов - эффективный противоопухолевый препарат "Тирапазамин" (Tirazone®, tirapazamine) - 1,2,4-бензотриазин-3-амин-1,4-диоксид, [Международная заявка (WO) №97/11699, опубл. 03.04.1997], так и 1,3,5-триазинов в частности [Заявка США №10/673521, опубл. 10.06.2004; Заявка США №10/594994, опубл. 20.11.2008; Патент США №7750001, опубл. 06.07.2010].

Однако о данных соединениях нет сведений, что они обладают антибактериальной активностью.

Первые работы в области медицинского применения производных 1,3,5-триазинов были проведены еще в 1956 г., когда в качестве возможных антибиотиков минимальной токсичности были представлены 2-арилсульфонамид-1,3,5-триазины [Патент США №2774756, опубл. 18.12.1956]. Позже в 1964 г., было показано, что при использовании небольших количеств 2,6-диамино-1,3,5-триазинов совместно с сульфонамидными препаратами общая антибактериальная активность такой смеси может возрастать до 20% [Патент США №3123527, опубл. 03.03.1964]. После чего дальнейшие работы в этом направлении на долгое время прекратились.

Известно, что производные бензо-1,2,4-триазинов обладают свойством подавлять жизнедеятельность болезнетворных бактерий [Патент США №4027022, опубл. 31.05.1977]. Видно значительное отличие в структуре представленных соединений от представленных в настоящей заявке на изобретение. Минимальные ингибирующие концентрации (MIC), полученные на препаратах различных клеточных линий, почти в 2-6 раз выше аналогичных эффективных ингибирующих концентраций (IC₅₀) соединений, представленных в настоящей заявке на изобретение.

Наиболее близким аналогом (прототипом) являются 2,4-диамино-1,3,5-триазины, обладающие антибактериальной активностью [Патент США №7622469, МПК A61K 31/53, опубл. 24.11.2009].

Однако представленные в настоящей заявке на изобретение соединения отличаются от прототипа структурно, поскольку являются не 2,4-диамино-производными, а 2-амино-4-алкокси (арилокси)- или 2,4-алкокси(арилокси)-производными 1,3,5-триазина, которые содержат полинитрометильные группы. Причем минимальные ингибирующие концентрации (MIC), полученные на препаратах прототипа различных клеточных линий, почти в 10-12 раз выше аналогичных эффективных ингибирующих концентраций (IC₅₀) соединений, представленных в настоящей заявке на изобретение.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание новых соединений на основе производных 1,3,5-триазина, обладающих более высокой антибактериальной активностью, в том числе и против патогенных для человека штаммов.

Указанный технический результат достигается применением производных 2-R₁-4-R₂-6-полинитрометил-1,3,5-триазинов, имеющих общую формулу:

где

n=0, X=NO₂, Cl, Br, R₁=R₂=OR₃, OAr (R₃-СН₃, С₂Н₅, СН₂(CH₂)₆СН₃, CH₂CH₂Cl, Ar=мета-С₆Н₄СН₃). R₁=OR₃, OAr, R₂=N(C₂H₅)₂.

n=1, Х-Cl, R₁=OR₃, R₂-NH(CH₂)₂NH₂, N(CH₂CH₂)₂NCH_3,

в качестве соединений, обладающих антибактериальной активностью.

Представленные в настоящей заявке соединения производные 1,3,5-триазина ориентированы на подавление процесса Dam ДНК-метилирования, существенно важного для жизнедеятельности и патогенеза бактерий, но отсутствующего у клетки хозяина. Как показано выше, для ряда патогенов Dam-минус мутанты авирулентны или нежизнеспособны, таким образом, считается, что ингибиторы Dam МТаз могут обладать широким спектром антибактериального действия [Casadesus J., Low D. Epigenetic gene regulation in the bacterial world // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V. 70, No. 3, P. 830-856; Wion D., Casadesus J. N⁶-methyl-adenine: an epigenetic signal for DNA-protein interactions // Nat. Rev. Microbiol. 2006. V. 4. No. 3. P. 183-192]. В этой связи подобные работы, по поиску селективных ингибиторов бактериальных Dam МТаз, ведутся последнее время в США компанией «EpiGenX Pharmaceuticals» [Mashhoon N., Pruss С., Carroll M., Johnson P.H., Reich N.O. Selective inhibitors of bac terial DNA adenine methyltransferases // Journal of Biomolecular Screening. 2006. V. 11. No. 5. P. 497-510].

Из уровня техники заявляемые соединения, обладающие антибактериальным действием не известны, вследствие чего данное техническое решение обладает новизной и соответствует критерию «изобретательский уровень».

Ниже приведены в качестве примеров сведения о синтезе заявляемых соединений.

Пример 1. Солянокислая соль 2-метокси-4-(4′-метилпиперазин-1′-ил)-6-хлор-динитрометил-1,3,5-триазина (сат-12179). Синтез описан в [Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Федоров Б.С., Фадеев М.А., Коновалова Н.П. Новые антиметастатические препараты на основе хлординитрометил-1,3,5-триазинов // Журнал прикладной химии, 2009, т.82, вып.10, с.1664-1668].

Пример 2. Солянокислая соль 2-метокси-4-(этил-1′,2′-диамин)-6-хлординитро-метил-1,3,5-триазина (сат-12180). Синтез описан в [Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Федоров B.C., Фадеев М.А., Коновалова Н.П. Новые антиметастатические препараты на основе хлординитрометил-1,3,5-триазинов // Журнал прикладной химии, 2009, т.82, вып.10, с.1664-1668].

Пример 3. 2,4-октилокси-6-бромдинитрометил-1,3,5-триазин (cam-12183). Синтез описан в [Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Галкина М.В., Екимова Е.В., Булычев Ю.Н., Качановская Е.В., Косарева Е.А., Якунина Н.Г. Синтез и цитотоксическая активность галогендинитрометильных производных 1,3,5-триазина // Хим. - фарм. журнал. - 2004, т.38, с.9-15].

Пример 4. 2,4-бис-(m-толилокси)-6-тринитрометил-1,3,5-триазин (cam-12380). Синтез описан в [В.В. Бахарев, А.А. Гидаспов, Е.В. Качановская. Синтез 2,4-диарилокси-6-тринитрометил-1,3,5-триазинов // Журнал органической химии. 2007, т. 43, №3, с.455-458].

Пример 5. 2-этокси-4-диэтиламин-6-хлординитрометил-1,3,5-триазин (cam-12446). Синтез описан в [Гидаспов А.А., Бахарев В.В., Галкина М.В., Екимова Е.В., Булычев Ю.Н., Качановская Е.В., Косарева Е.А., Якунина Н.Г. Синтез и цитотоксическая активность галогендинитрометильных производных 1,3,5-триазина // Хим.-фарм. журнал. - 2004, т.38, с.9-15].

Пример 6. 2-(′2-хлорэтокси)-диэтиламин-6-хлординитрометил-1,3,5-триазин (cam-12448). В суспензию 0,003 моля калиевой соли 2-(2′-хлорэтокси)-4-диэтиламин-6-динитрометил-1,3,5-триазина в 15 мл четыреххлористого углерода при 20-25°C и перемешивании барботировали газообразный хлор до перехода желтой окраски калиевой соли в белую (образуется KCl). Реакционную массу перемешивали 0,5 ч. Осадок отфильтровывали, четыреххлористый углерод удаляли с помощью роторного испарителя. Остаток вакуумировали в течение 1 ч при комнатной температуре и остаточном давлении 1 мм рт.ст. Целевой сат-12448 получен в виде вязкого масла желтоватого цвета с выходом 90%. Найдено, %: C 32.49, H 3.88, N 22.73, Cl 19.22. C₁₀H₁₄N₆O₅Cl₂. Вычислено, %: C 32.54, H 3.82, N 22.76, Cl 19,21. ИК-спектр, ν, см^-1: 2979,6; 2937,2; 2877,4; 1589,1; 1510,1; 1465,7; 1427,1; 1321,1; 1299,9; 1243,9; 1191,9; 1095,4; 1020,2; 977,8; 908,4; 835,1; 815,8; 788,8. Спектр ¹H-ЯМР (CDCl₃, внутренний стандарт - TMC), δ, м.д.: 1.15,1.22 два t (6H, CH₃, J=8 Гц), 3.54, 3.66 два q (4H, NCH₂, J₁=8 Гц, J=7,8 Гц), 3,80t (2H, OCH₂, J=8 Гц), 4,7 It (2H, CH₂Cl, J=8 Гц). 1,3,5-Триазины общей формулы 1 по химическому строению отличаются от ранее заявленных в качестве антибактериальных препаратов 1,3,5-триазинов [Заявка США №10/539234, опубл. 13.07.2006; Патент США №7622469, опубл. 24.11.2009] наличием связанной с циклом полинитрометильной функциональной группы, а именно C(NO₂)₂Cl или C(NO₂)₂Br или C(NO₂)₃.

Пример 7. Исследования антибактериальной активности заявляемых соединений

Основными объектами исследований in vitro служили гомогенные препараты Dam ДНК-метилтрансфераз бактериофага T2 (T2Dam), по структурным и функциональным свойствам близкому к Dam МТазе Escherichia coli [Hattman S., Malygin E.G. Bacteriophage T2Dam and T4Dam DNA-[N⁶-adenine]-methyltransferases // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2004. V.77. P.67-126; Horton J.R., Liebert K., Hattman S., Jeltsch A., Cheng X. Transition from nonspecific to specific DNA interactions along the substrate-recognition pathway of dam methyltransferase // Cell. 2005. V. 121. No.3. P.349-361] и Yersinia pseudotuberculosis (YpsDam).

Оценку потенциала низкомолекулярных химических соединений в отношении ингибирования реакции Dam-метилирования проводили на препаратах T2Dam и YpsDam стандартным методом ферментативного переноса [³H]-радиоактивной метки от [³H-CH₃]-AdoMet на ДНК-субстрат [Marzabal S., Dubois S., Thielking V., Cano A., Eritja R., Guschlbauer W. Dam methylase from Escherichia coli: kinetic studies using modified oligomers: hemimethylated substrates // Nucleic Acids Res. 1995. V.23. No.18. P.3648-3655]. Для каждого соединения была найдена зависимость активности фермента от концентрации ингибиторов (C ing). Проанализировав данные зависимости, согласно стандартному выражению: A=A_max/(1+([C ing] / IC₅₀)ⁿ), где n - коэффициент Хилла, были вычислены 50%-ные ингибирующие концентрации - IC₅₀, которые приведены в табл.2.

Таблица 2 Ингибирующая активность IC₅₀ in vitro реакции Dam-метилирования на препаратах ДНК-метилтрансфераз T2Dam и YpsDam: Шифр соед. Молярная масса IC₅₀ T2Dam (мкМ) IC₅₀ YpsDam (мкМ) cam-12179 420,64 >27,40 8,2 cam-12180 380,58 5,4 6,2 cam-12183 520,43 2,3 3,5 cam-12380 442,35 0,5 4,8 cam-12446 334,72 >30 9,6 cam-12448 369,17 >30 7,9

Для оценки цитотоксической активности заявляемых соединений, полученных в соответствии с примерами 1-6, использовали следующую методику. Культуру клеток Vero выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. В культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемых соединений. После инкубирования в течение 3-5 суток монослой клеток прокрашивали витальным красителем нейтральным красным, после удаления красителя и отмывки избытка красителя вносили лизирующий раствор и количество красителя, включенного в монослой клеток, учитывали на спектрофотометре при длине волны 490 нм. В качестве контроля культуры клеток использовали лунки планшета, в которые не вносили никаких соединений. Данная методика основана на способности тестируемых соединений проникать в эукариотическую клетку и влиять на жизненно важные клеточные процессы, в связи с чем клетки погибают и не сохраняют способность фагоцитировать нейтральный красный.

Для определения антибактериальной активности представленных выше соединений использовали культуру клеток E.coli(BL). Культуру клеток E.coli(BL) выращивали в 25 мл пробирках в объеме 10 мл. В культуральную среду добавляли серийные разведения исследуемых соединений. Пробы инкубировали и производили отбор каждые 30 мин, количество биомассы клеточной культуры измеряли на спектрофотометре при длине волны 550 нм. Антибактериальная активность определялась путем сравнения снижения кинетики роста в пробах культуры клеток E.coli(BL) в присутствии соединений производных 1,3,5-триазина и контрольной пробы. В качестве контроля культуры клеток использовали пробы, в которые не вносили никаких соединений. Данная методика основана на способности тестируемых соединений проникать в прокариотическую клетку и подавлять активность бактериальных Dam ДНК-метилтрансфераз, в связи с чем клетки погибают или частично теряют свою активность, и скорость роста клеточной культуры уменьшается. Результаты определения цитотоксической и антибактериальной активности приведены в табл.3.

Таблица 3 Цитотоксическая активность 50% (TC₅₀) на культуре эукариотических клеток Vero и антибактериальная активность на культуре прокариот E.coli(BL) (IC₅₀). Индекс селективности как отношение цитотоксической и антибактериальной активности Шифр соед. TC₅₀ (мкМ)) на культуре Vero IC₅₀ (мкМ) на культуре E.coli(BL) Индекс селективности (TC₅₀/IC₅₀) cam-12179 87,6 0,23 380,9 cam-12180 28,3 0,04 707,5 cam-12183 25,3 0,03 843,4 cam-12380 10,8 0,16 68,8 cam-12446 16,0 0,11 152,7 cam-12448 14,5 1,4 10,2

Анализ данных, представленных в табл.3, показывает, что полинитрометил-1,3,5-триазины общей формулы 1 обладают высокой антибактериальной активностью. Высокий индекс селективности показывает, что данные химические соединения вполне пригодны для использования в качестве лекарственных препаратов, направленных на подавление бактериальных инфекций.

Изобретение относится к применению 2-R₁-4-R₂-6-полинитрометил-1,3,5-триазинов общей формулы:

где n=0, X=NO₂, Cl, Br, R₁=R₂=OR₃, OAr (R₃=CH₃, С₂Н₅, СН₂(СН₂)₆СН₃, CH₂CH₂Cl, Ar=мета-С₆Н₄СН₃), R₁=OR₃, OAr, R₂=N(C₂H₅)₂; n=1, X=Cl, R₁=OR₃, R₂=NH(CH₂)₂NH₂, N(CH₂CH₂)₂NCH₃ в качестве соединений, обладающих антибактериальной активностью. Техническим результатом является выявление соединений на основе производных 1,3.5-триазина, обладающих высокой антибактериальной активностью. 3 табл., 7 пр.

Применение 2-R₁-4-R₂-6-полинитрометил-1,3,5-триазинов общей формулы:

где:
n=0, X=NO₂, Cl, Br, R₁=R₂=OR₃, OAr (R₃=CH₃, С₂Н₅, СН₂(СН₂)₆СН₃, CH₂CH₂Cl, Ar=мета-С₆Н₄СН₃), R₁=OR₃, OAr, R₂=N(C₂H₅)₂,
n=1, X=Cl, R₁=OR₃, R₂=NH(CH₂)₂NH₂, N(CH₂CH₂)₂NCH_3,
в качестве соединений, обладающих антибактериальной активностью.