ПЕПТИДЫ-ПРОИЗВОДНЫЕ ИЛ-4 ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ХРОНИЧЕСКОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА И ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2015 года по МПК C07K14/435 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к малым пептидам, полученным из цитокина, интерлейкина-4 (ИЛ-4), способным связываться с рецепторами ИЛ-4 и ингибировать активацию макрофагов и, таким образом, предотвращать начало воспалительного ответа. Кроме того, изобретение относится к применению указанных пептидов для изготовления лекарственного средства для лечения различных патологических состояний, при которых значительную роль играет ИЛ-4.

Предшествующий уровень техники

Нарушения, ассоциированные с воспалением, включают большую независимую группу расстройств, которые лежат в основе ряда заболеваний человека. Примеры расстройств, ассоциированных с воспалением, включают астму, хроническое воспаление и аутоиммунные заболевания, в том числе ревматоидный артрит. Хроническое воспаление представляет собой патологическое состояние, характеризующееся сопутствующим активным воспалением, разрушением ткани и попытками восстановления. Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое системное аутоиммунное расстройство, которое является причиной атаки иммунной системы на суставы, в которых оно вызывает воспаление (артрит) и разрушение. Также РА может повреждать некоторые органы, такие как легкие и кожу. Он может быть инвалидизирующим и болезненным состоянием, способным привести к значительной потере функционирования и подвижности. Его диагностируют при помощи анализов крови (особенно теста, называемого ревматоидный фактор) и рентгена.

Воспалительная реакция, наблюдаемая при аутоиммунном заболевании, включает как клеточные, так и растворимые компоненты. Причина РА неизвестна. Он включает комплекс взаимодействий различных клеток, цитокинов и ферментов. Заболевание начинается, когда стимулированный антиген получает доступ к суставу, запуская иммунный ответ. Антигенный стимул активирует CD4+ лимфоциты (Т-клетки). Как только Т-клетки становятся активированными, начинается комплексный каскад биологических событий, включающий стимуляцию макрофагов, В-клеток, фибробластов, хондроцитов и остеокластов. Активированные макрофаги секретируют цитокины, такие как интерлейкин-1 (ИЛ-1), ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-15 и фактор некроза опухолей α (ФНО-α) (Martinez et al., 2008).

CD4+ Т-клетки (клетки Тх2) секретируют интерлейкин-4 (ИЛ-4). Он представляет собой плейотропный цитокин, воздействующий на различные типы клеток и тканей. Его воздействие на иммунные клетки приводит к активации и росту В-клеток, продукции IgG и IgE, индукции молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II, росту и выживанию Т-клеток, дифференциации Тх2, увеличению роста тучных клеток, увеличению секреции ИЛ-2 и ИЛ-12-индуцированного γ-интерферона (IFN-γ) клетками-наивными киллерами (NK), снижению количества С5а и С3а рецепторов в моноцитах и дендритных клетках, образованных из моноцитов, и ингибированию активации макрофагов (Agnello et al., 2003; Szehedi et al., 2003; Roland, 2003).

В ряде лабораторий структуру рекомбинантного человеческого ИЛ-4 определяют как методом ЯМР, так и методом рентгено-структурного анализа. Он обладает классической цитокиновой структурой с четырьмя пучками спиралей (Muller et al., 1995). ИЛ-4, подобно другим цитокинам, проявляет свою биологическую активность посредством связывания рецепторов на поверхности клетки. Один рецепторный комплекс состоит из двух компонентов: ИЛ-4R α-цепи (ИЛ-4Rα) и ИЛ-2R γ-цепи (γ-цепь общая для ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-15 и ИЛ-21), и обозначен как ИЛ-4R типа I, тогда как другой рецепторный комплекс состоит из ИЛ-4Rα и α-цепи ИЛ-13 (ИЛ-13Rα1), и обозначен как ИЛ-4Р типа II. Поскольку γ-цепь экспрессируется на большинстве гемопоэтических и иммунных клеток, предполагается, что ИЛ-4 воздействует на эти клетки в форме ИЛ-4R типа I. Для сравнения, экспрессия ИЛ-13Rα1 ограничена некоторыми линиями дифференцировки, такими, как дифференцировка В клеток в гематопоэтические и иммунные клетки, но повсеместно определяется на неиммунных клетках (Izuhara et al., 2002). Таким образом, ИЛ-4 воздействует на неиммунные клетки в форме ИЛ-4R/ИЛ-13R типа II.

Связывание ИЛ-4 с а-цепью его рецептора является ключевым моментом для генерации раннего иммунного ответа с преобладанием Тх2. Кристаллическую структуру промежуточного комплекса между человеческим ИЛ-4 и ИЛ4-ВР определяли при разрешении 2,3 Ǻ(PDB ID: 1IAR). Таким образом были выявлены: новая пространственная ориентация двух белков, небольшое, но неожиданное конформационное изменение в рецептор-связанном ИЛ-4, и области взаимодействия с тремя отдельными кластерами транс-взаимодействующих остатков (Наде et al., 1999). Кристаллическая структура промежуточного комплекса II4-II4r была открыта недавно (PDB ID: 3BPL; LaPorte et al., 2008).

Рекомбинантный ИЛ-4 подвергали различным клиническим испытаниям. ИЛ-4 оказался полезен пациентам с псориазом, эффективно корректируя дисбаланс в иммунных функциях (Martin 2003). Безопасность и переносимость рекомбинантного человеческого интерлейкина-4, продуцируемого в Escherichia coli (rhuIL-4), оценивали в фазе I и фазе II исследований на пациентах с различными злокачественными опухолями. Клинические испытания показали, что подкожное введение rhuIL-4 является безопасным и хорошо переносится при дозах до 5 мкг/кг/день и до 10 мкг/кг при введении 3 раза в неделю. Хотя преклинические исследования безопасности на яванских макаках показали некоторое количество вредных эффектов, при последующем повторном ежедневном введении дозы rhuIL-4 похожие эффекты у пациентов обычно не наблюдались (Leach et al., 1997). Наиболее распространенные токсические явления представляли собой повышенные функциональные пробы печени, тошноту/рвоту/диарею, дискомфорт/усталость, отек, головную боль, миалгию/боль в суставах и лихорадку/озноб. Несмотря на обнадеживающее доклиническое увеличение ингибирующего и иммуномодулирующего эффектов, ИЛ-4 при указанных дозировке и схеме показал лишь небольшую противоопухолевую активность (Whitehead et al., 1998).

Многие аутоиммунные и воспалительные заболевания человека все еще лечат при помощи сочетания кортикостероидов и общей иммунносупрессии. Лучшее понимание патогенеза этих заболеваний привело к более специфичным способам лечения. В их числе в качестве будущих способов лечения рассматривают рекомбинантные гуманизированные белки. Однако лекарственные средства, основанные на рекомбинантных белках, обладают некоторыми недостатками, включая высокие затраты на производство, большое колебание показателей качества между партиями и денатурацию во время хранения.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к фрагментам ИЛ-4, которые могут быть химически синтезированы и могут применяться в качестве функциональных миметиков ИЛ-4.

Настоящее изобретение относится к соединению, содержащему изолированный пептид, состоящий не более чем из 35 последовательных аминокислотных остатков, полученных из ИЛ-4, или к ее варианту, идентичному ей по меньшей мере на 70%. Соединение, содержащее такую аминокислотную последовательность, согласно изобретению способно (i) связываться с рецептором ИЛ-4; (ii) ингибировать воспалительный ответ; (iii) ингибировать активацию макрофагов; (iii) активировать В-клетки; (iv) активировать рост и выживание Т-клеток; (v) снижать количество С5а и С3а рецепторов в моноцитах и дендритных клетках, (vi) модулировать активность рецептора ИЛ-4.

Соответственно, другой аспект изобретения относится к применению соединений по изобретению в качестве лекарственных средств и для приготовления лекарственных средств для лечения состояния или заболевания, при котором частью указанного лечения являются (i) связывание рецептора ИЛ-4; (ii) ингибирование воспалительного ответа; (iii) ингибирование активации макрофагов; (iii) активация В-клеток; (iv) активация роста и выживания Т-клеток; (v) снижение количества С5а и С3а рецепторов в моноцитах и дендритных клетках, (vi) модуляция активности рецептора ИЛ-4.

Также в другом аспекте пептид по изобретению или соединение, содержащее пептид, могут применять для получения антитела. Такие антитела будут связываться с эпитопом в составе пептида по изобретению.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим пептид по изобретению или антитело, способное распознавать эпитоп в составе пептида по изобретению.

Также изобретение относится к способу лечения состояний, при которых являются полезными: (i) связывание с рецептором ИЛ-4; (ii) ингибирование воспалительного ответа; (iii) ингибирование активации макрофагов; (iii) активация В-клеток; (iv) активация роста и выживания Т-клеток; (v) снижение количества С5а и С3а рецепторов в моноцитах и дендритных клетках; (vi) модуляция активности рецептора ИЛ-4, где указанный способ включает стадию введения пациенту, нуждающемуся в этом, соединения по изобретению, антитела по изобретению или фармацевтической композиции, содержащей указанную пептидную последовательность, указанное соединение или указанное антитело.

Описание чертежей

Фигура 1

Структура ИЛ-4 в комплексе с эктодоменом ИЛ-4Rα (PDB ID: 1IAR). Локализация пептида 1 (SEQ ID NO:2) (слева) и пептида 3 (SEQ ID NO:3) (справа) отмечена серым.

Фигура 2

Структура ИЛ-4 в комплексе с эктодоменом ИЛ-4Rα (PDB ID: 1IAR). Локализация пептида 3а (SEQ ID NO:1) (слева) и пептида 4 (SEQ ID NO:4) (справа) отмечена серым.

Фигура 3

Структура ИЛ-4 в комплексе с эктодоменом γ-цепи общего рецептора (PDB ID: 3BPL). Локализация пептида 1 (SEQ ID NO:2) (слева) и пептида 3 (SEQ ID NO:3) (справа) отмечена серым.

Фигура 4

Структура ИЛ-4 в комплексе с эктодоменом ИЛ-4Rα и γ-цепи общего рецептора (PDB ID: 3BPL). Локализация пептида За (SEQ ID NO:1) (слева) и пептида 4 (SEQ ID NO:4) (справа) отмечена серым.

Фигура 5

Действие пептида Ph1, полученного из ИЛ-4, (SEQ ID NO:2) на разрастание нейритов в культурах мозжечковых шаровых нейронов. Пептид P2d применяли в качестве положительного контроля (см. Soroka et al., 2002).

Фигура 6

Действие Ph2 (SEQ ID NO:3) на разрастание нейритов в культурах мозжечковых шаровых нейронов. Уровень значимости по сравнению с контролем следующий: ***=p<0.001. Были выполнены семь независимых экспериментов.

Фигура 7

Секреция ФНО-α макрофагами при предварительной обработке Ph2 (SEQ ID NO:3).

А: гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов без предварительной обработки при помощи Ph2 или активации при помощи ИФН-γ (заштрихованный столбик), при активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (белый столбик) и при предварительной обработке при помощи 100 мкМ гидрокортизона и активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (черный столбик). Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из предварительно не обработанных активированных макрофагов (белый столбик), следующий: ***=p<0,001. В: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов при предварительной обработке при помощи Ph2 в различных концентрациях перед активацией при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ. Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из не обработанных предварительно активированных макрофагов (0 столбик), следующий: ***=p<0,001. Результаты на обоих чертежах приведены в виде процентных соотношений по отношению к необработанному контролю, активированному посредством только ИФН-γ. Результаты шести независимых экспериментов приведены для контроля и концентраций Ph2 9, 27, 81 и 243 мкг/мл.

Фигура 8

Связывание Ph2 (SEQ ID NO:3) с ИЛ-4rα.

Изучение связывания посредством поверхностного плазменного резонанса. А: В качестве контроля исследовали связывание между ИЛ-4 и ИЛ-4rα посредством фиксации ИЛ-4rα на чипе с последующей подачей на чип раствора с ИЛ-4. В: Связывание между Ph2 и ИЛ4rα изучали посредством фиксации Ph2 на чипе и подачи на чип раствора с ИЛ4rα. Результаты анализировали и КД вычисляли при помощи компьютерного программного обеспечения BIAevaluation.

Фигура 9

Воздействие Ph3 (SEQ ID NO:1) на разрастание нейритов в культурах мозжечковых шаровых нейронов. Уровень значимости по сравнению с контролем следующий: **=p<0,01. Были выполнены семь независимых экспериментов.

Фигура 10

Секреция ФНО-α макрофагами при предварительной обработке при помощи Ph3 (SEQ ID NO:1).

А: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов без предварительной обработки при помощи Ph3 или активации посредством ИФН-γ (заштрихованный столбик), при активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (белый столбик) и при предварительной обработке при помощи 100 мкМ гидрокортизона и активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (черный столбик). Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из предварительно не обработанных активированных макрофагов (белый столбик), следующий: ***=p<0,001. В: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов при предварительной обработке при помощи Ph3 в различных концентрациях до активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ. Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из предварительно не обработанных активированных макрофагов (0 столбик), следующий: ***=p<0,001. Результаты на обоих чертежах приведены в виде процентного соотношения по отношению к необработанному контролю, активированному лишь посредством ИФН-γ. Результаты шести независимых экспериментов приведены для контроля и концентраций Ph3 9, 27 и 81 мкг/мл.

Фигура 11

Связывание Ph3 (SEQ ID NO:1) с ИЛ-4rα.

Изучение связывания посредством поверхностного плазменного резонанса. А: В качестве контроля было изучено связывание между ИЛ-4 и ИЛ-4rα путем фиксации ИЛ-4rα на чипе с последующей подачей раствора с ИЛ-4 на чип. В: Связывание между Ph3 и ИЛ-4rα изучали посредством фиксации Ph3 на чипе и подачи раствора с ИЛ-4rα на чип. Результаты анализировали и КД вычисляли при помощи компьютерного программного обеспечения BIAevaluation.

Фигура 12

Воздействие Ph4 (SEQ ID NO:4) на разрастание нейритов в культурах мозжечковых шаровых нейронов. Уровень значимости по сравнению с контролем следующий: *=p<0,05, **=p<0,01. Были выполнены пять независимых экспериментов.

Фигура 13

Секреция ФНО-α макрофагами при предварительной обработке при помощи Ph5 (SEQ ID NO:5).

А: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов без предварительной обработки при помощи Ph4 или активации посредством ИФН-γ (заштрихованный), при активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (белый) и при предварительной обработке при помощи 100 мкМ гидрокортизона и активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (черный). В: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов при предварительной обработке при помощи 9 мкг/мл Ph5 перед активацией при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ. Были выполнены два независимых эксперимента.

Фигура 14

Секреция ФНО-α макрофагами при предварительной обработке при помощи Ph6 (SEQ ID NO:6).

А: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов без предварительной обработки при помощи Ph4 или активации посредством ИФН-γ (заштрихованный), при активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (белый) и при предварительной обработке при помощи 100 мкМ гидрокортизона и активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (черный). В: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов при предварительной обработке при помощи различных концентраций Ph6 перед активацией при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ. Были выполнены два независимых эксперимента.

Фигура 15

Секреция ФНО-α макрофагами при предварительной обработке при помощи Ph8 (SEQ ID NO:1).

А: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов без предварительной обработки при помощи Ph3 или активации посредством ИФН-Y (заштрихованный столбик), при активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (белый столбик) и при предварительной обработке при помощи 100 мкМ гидрокортизона и активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (черный столбик). Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из предварительно не обработанных активированных макрофагов (белый столбик), следующий: ***=p<0,001. В: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов при предварительной обработке при помощи Ph8 в различных концентрациях перед активацией при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ. Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из предварительно не обработанных активированных макрофагов (0 столбик), следующий: ***=p<0,001. Результаты на обоих чертежах приведены в виде процентного соотношения по отношению к необработанному контролю, активированному только ИФН-γ. Результаты шести независимых экспериментов приведены для контроля и концентраций Ph8 9, 27, 81 и 243 мкг/мл.

Фигура 16

Секреция ФНО-α макрофагами при предварительной обработке при помощи Ph10 (SEQ ID:1).

А: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого макрофагами без предварительной обработки при Ph10 или активации посредством ИФН-γ (заштрихованный столбик), при активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (белый столбик) или при предварительной обработке при помощи 100 мкМ гидрокортизона и активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (черный столбик). Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из предварительно не обработанных активированных макрофагов (белый столбик), следующий: **=p<0,01. В: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов при предварительной обработке при помощи Ph10 в различных концентрациях перед активацией при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ. Уровень значимости по сравнению с количеством ФНО-α, высвобождаемым из предварительно не обработанных активированных макрофагов (0 столбик), следующий: **=p<0,01. Результаты на обоих чертежах приведены в виде процентных соотношений по отношению к необработанному контролю, активированному лишь посредством ИФН-γ. Результаты четырех независимых экспериментов приведены для контроля и концентраций Ph10 9, 27, 81 и 243 мкг/мл. Только два эксперимента были выполнены с использованием концентрации 54 мкг/мл Ph10, эти данные не включены в статистический анализ.

Фигура 17

Секреция ФНО-α макрофагами при предварительной обработке при помощи Ph12 (SEQ ID:19).

А: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов без предварительной обработки при помощи Ph12 или активации посредством ИФН-γ (заштрихованный), при активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (белый) и при предварительной обработке при помощи 100 мкМ гидрокортизона и активации при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ (черный). В: Гистограмма количества ФНО-α, высвобождаемого из макрофагов при предварительной обработке при помощи Ph12 в различных концентрациях перед активацией при помощи 0,01 мкг/мл ИФН-γ. Были выполнены два эксперимента.

Подробное описание изобретения

Соединение по изобретению может представлять собой фрагмент, полученный из интерлейкина-4, или оно может быть получено из варианта интерлейкина-4, такого, как естественный или рекомбинантный вариант интерлейкина-4, например вариант интерлейкина-4, образующийся посредством альтернативного сплайсинга или генетического полиморфизма, или любой тип рекомбинантного интерлейкина-4.

Пептид по изобретению представляет собой пептид, способный взаимодействовать с рецептором ИЛ-4, модулируя сигналинг рецептора ИЛ-4, активируя В-клетки, активируя рост и выживание Т-клеток, снижая количество С5а и С3а рецепторов в моноцитах и дендритных клетках или ингибируя активацию макрофагов.

Термины «модуляция» или «модулирование» обозначают изменения, такие как ингибирование или стимуляция. Термин «взаимодействие» обозначает действие, такое как связывание пептида с рецептором ИЛ-4, которое вызывает эффект.

Аминокислотная последовательность

Соединения по изобретению содержат пептид, состоящий из непрерывной последовательности аминокислот, полученной из ИЛ-4, или его фрагмента, или варианта.

В одном воплощении соединение по изобретению может содержать пептид, состоящий не более чем из 35 последовательных аминокислотных остатков, которые получены из интерлейкина-4 (SEQ ID:38), или его фрагмента, или варианта, по меньшей мере на 75% идентичного SEQ ID NO:38 или ее фрагменту.

Аминокислотная последовательность предшественника ИЛ-4 человека (Swiss-Prot ID: P05112) является следующей:

MGLTSQLLPP LFFLLACAGN FVHGHKCDIT LQEIIKTLNS LTEQKTLCTE LTVTDIFAAS KNTTEKETFC RAATVLRQFY SHHEKDTRCL GATAQQFHRH KQLIRFLKRL DRNLWGLAGL NSCPVKEANQ STLENFLERL KTIMREKYSK CSS (SEQ ID NO:38)

Последовательность пептида по изобретению состоит не более чем из 35 последовательных аминокислотных остатков, как, например, от 3 до 35 аминокислотных остатков, например от 3 до 30, например от 3 до 25, например от 5 до 25, например от 7 до 25, например от 8 до 25, например от 10 до 25 или от 12 до 25, такой как от 14 до 25. Предпочтительными являются последовательности, содержащие от 5 до 25 последовательных аминокислотных остатков.

В предпочтительном воплощении указанные пептиды по изобретению содержат не более 35 последовательных аминокислот и являются производными альфа-спирали ИЛ-4.

Термин «альфа-спираль» обозначает общий мотив во вторичной структуре белков, альфа спираль (α-спираль) представляет собой право- или левозакрученную спиральную конформацию, где каждая N-H группа остова служит донором водородной связи для С=O группы, расположенной на остове четырьмя аминокислотными остатками ранее.

В предпочтительном воплощении указанные пептиды по изобретению содержат последовательность формулы:

Х1-Х2-Х3, где

Х1 представляет собой L,

Х2 представляет собой I, Q, G, Т, или заряженную аминокислоту; и

Х3 представляет собой Q, Т, или заряженную аминокислоту.

В одном предпочтительном воплощении Х2 представляет собой I или Q.

В более предпочтительном воплощении Х2 представляет собой I.

В другом более предпочтительном воплощении Х2 представляет собой Q.

В одном предпочтительном воплощении Х2 представляет собой заряженную аминокислоту.

В предпочтительном воплощении Х3 представляет собой заряженную аминокислоту.

В более предпочтительном воплощении Х3 представляет собой R или Е.

В одном наиболее предпочтительном воплощении Х3 представляет собой R.

В другом более предпочтительном воплощении Х3 представляет собой Е.

В другом предпочтительном воплощении Х3 представляет собой Q или Т.

В еще более предпочтительном воплощении Х1 представляет собой L, Х2 представляет собой I и Х3 представляет собой R.

В другом еще более предпочтительном воплощении Х1 представляет собой L, Х2 представляет собой Q и Х3 представляет собой Е.

В наиболее предпочтительном воплощении указанные пептиды по изобретению состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из одной из следующих аминокислотных последовательностей:

AQFHRHKQLIRFLKRA SEQ ID NO:1

AITLQEIIKTLNSA SEQ ID NO:2

ARFLKRLDRNLWGG SEQ ID NO:3

AERLKTIMREKYSKS SEQ ID NO:4

LQEIKTLN SEQ ID NO:5

KRLQQNLFGG SEQ ID NO:6

Ac-AQFHRHKQLIRFLKRA SEQ ID NO:7

QEIIKKL SEQ ID NO:8

AIQNQEEIKYLNS SEQ ID NO:9

AIILQEI SEQ ID NO:10

IVLQEII SEQ ID NO:11

TLGEIIKGVNS SEQ ID NO:12

VTLIDHSEEIFKTLN SEQ ID NO:13

LQERIKSLN SEQ ID NO:14

RLDRENVAVYNLW SEQ ID NO:15

LRSLDRNL SEQ ID NO:16

RLLRLDRN SEQ ID NO:17

RFLKRYFYNLEENL SEQ ID NO:18

RNKQVIDSLAKFLKR SEQ ID NO:19

RHKALIR SEQ ID NO:20

KKLIRYLK SEQ ID NO:21

RHKTLIR SEQ ID NO:22

MQDKYSKS SEQ ID NO:23

AERVKIEQREYKKYS SEQ ID NO:24

SQLIRFLKRLA SEQ ID NO:25

TVTDIFAASKNTT SEQ ID NO:26

TLENFLERLKTA SEQ ID NO:27

TEKEVLRQFYSA SEQ ID NO:28

KTLTELTKTLNS SEQ ID NO:29

AHKEIIKTLNSLQKA SEQ ID NO:30

AKTLSTELTVTA SEQ ID NO:31

STLENFLERLA SEQ ID NO:32

NEERLKTIMRA SEQ ID NO:33

RAATVLRQFYSR SEQ ID NO:34

KTLNSLTEQKT SEQ ID NO:35

AHRHKQLIRA SEQ ID NO:36

ATAQQFHRHKQA SEQ ID NO:37,

или ее варианта, или фрагмента.

В одном воплощении указанные пептиды по изобретению состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из одной из следующих аминокислотных последовательностей:

AQFHRHKQLIRFLKRA (SEQ ID NO:1)

Ac-AQFHRHKQLIRFLKRA (SEQ ID NO:7)

RHKALIR (SEQ ID NO:20)

KKLIRYLK (SEQ ID NO:21)

RHKTLIR (SEQ ID NO:22)

SQLIRFLKRLA (SEQ ID NO:25)

AHRHKQLIRA (SEQ ID NO:36),

или ее варианта, или фрагмента.

В одном воплощении указанные пептиды по изобретению состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из одной из следующих аминокислотных последовательностей:

AITLQEIIKTLNSA (SEQ ID NO:2)

LQEIKTLN (SEQ ID NO:5)

AIILQEI (SEQ ID NO:10)

IVLQEII (SEQ ID NO:11)

LQERIKSLN (SEQ ID NO:14)

AHKEIIKTLNSLQKA (SEQ ID NO:30),

или ее варианта, или фрагмента.

В настоящем контексте используется стандартный однобуквенный код для аминокислотных остатков, а также стандартный трехбуквенный код. Аббревиатуры аминокислот соответствуют рекомендациям IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9-37. На протяжении всего описания и формулы изобретения для природных аминокислот используется или трехбуквенный код, или однобуквенный код. В случае если L или D конфигурация точно не указана, следует понимать, что рассматриваемая аминокислота представлена в природной L форме, см. Pure & Appl. Chem. Vol. (56(5) pp 595-624 (1984), или D форме, такой, что образующиеся пептиды могут состоять из аминокислот L формы, D формы или последовательности смешанных L и D форм.

Если ничего не указано, следует понимать, что С-концевая аминокислота пептида для применения по изобретению представлена в виде свободной карбоновой кислоты, она также может быть обозначена как "-ОН". Однако С-терминальная аминокислота пептида для применения по изобретению может представлять собой амидированное производное, которое обозначают как "-NH₂". Если не указано иное, N-концевая аминокислота полипептида содержит свободную аминогруппу, она также может быть обозначена как "Н-".

Пептид, его фрагмент или вариант по изобретению также может содержать одну или несколько не встречающихся в природе аминокислот.

Предпочтительный пептид по изобретению представляет собой изолированную непрерывную пептидную последовательность, содержащую не более 35 аминокислотных остатков ИЛ-4. Следует понимать, что все пептиды по изобретению содержат по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из любой последовательности SEQ ID NO:1-37, или ее фрагмента, или варианта.

Таким образом, некоторые воплощения по изобретению могут относиться к пептиду, содержащему фрагмент последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1-37. Другое воплощение может относиться к вариантам SEQ ID NO:1-37.

В одном воплощении вариант фрагмента отличается от фрагмента SEQ ID NO:38. Вариант фрагмента может отличаться от фрагмента SEQ ID NO:38 за счет наличия другой аминокислоты в одном или более положениях. Предпочтительно вариант имеет отличия от фрагмента SEQ ID NO:38 в положениях до 10-й аминокислоты, более предпочтительно в положении до 8-й аминокислоты, так, например, в положениях до 6-й аминокислоты, например в положениях до 5-й аминокислоты, таком как в 4, 3, 2 или 1 положение. Такие варианты могут иметь другие отличия от фрагмента SEQ ID NO 38, такие как наличие одной или более химических модификаций.

Вариант аминокислотной последовательности по изобретению, выбранной из последовательностей SEQ ID NO:1-38, может быть:

i) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 70% идентичностью с выбранной последовательностью, такой как 71-75% идентичность, например 76-80% идентичностью, такой как 81-85% идентичность, такой как 86-90% идентичность, например 91-95% идентичностью, такой как 96-99% идентичность, где идентичность определена в виде процентного соотношения идентичных аминокислот в указанной последовательности при сопоставлении с выбранной последовательностью. Идентичность между аминокислотными последовательностями может быть вычислена при помощи хорошо известных алгоритмов, таких как BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 или BLOSUM 90;

ii) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 70% положительных совпадений аминокислот с выбранной последовательностью, например 71-80% положительных совпадений аминокислот, например 81-85% положительных совпадений аминокислот, например 86-90% положительных совпадений аминокислот, например 91-95% положительных совпадений аминокислот, например 96-99% положительных совпадений аминокислот, где положительное совпадение аминокислот определяется как наличие в одинаковом положении в двух сравниваемых последовательностях аминокислотных остатков, обладающих сходными физическими и/или химическими свойствами. Предпочтительные положительные аминокислотные совпадения по настоящему изобретению представляют собой K и R, Е и D, L и М, Q и Е, I и V, I и L, А и S, Y и W, K и Q, S и Т, N и S и Q и R;

iii) аминокислотной последовательностью, идентичной выбранной последовательности или обладающей по меньшей мере 70% идентичностью с указанной последовательностью, такой как 71-80% идентичность, например 81-85% идентичностью, такой как 86-90% идентичность, например 91-95% идентичностью, такой как 96-99% идентичность, или обладающей по меньшей мере 75% положительных совпадений аминокислот с выбранной последовательностью, например 76-80% положительных совпадений аминокислот, например, 81-85% положительных совпадений аминокислот, например 86-90% положительных совпадений аминокислот, например 91-95% положительных совпадений аминокислот, например 96-99% положительных совпадений аминокислот, и содержащей другие химические группы, например фосфорильную, серную, ацетильную, гликозильную группы.

Термин «вариант пептидной последовательности» также означает, что пептидная последовательность может быть модифицирована, например, посредством замещения одного или более аминокислотных остатков. Могут применяться как L-аминокислоты, так и D-аминокислоты. Другая модификация может содержать производные, такие как эфиры, сахара и т.д., например метиловый и ацетиловый эфиры, а также модификации полиэтиленгликоля.

Кроме того, аминогруппа пептида может быть преобразована в амид, где кислотная часть амида представляет собой жирную кислоту.

В другом аспекте варианты аминокислотных последовательностей по изобретению могут содержать в пределах одного варианта или его фрагмента или среди различных вариантов или их фрагментов по меньшей мере одну замену, такую как ряд заместителей, введенных независимо друг от друга. Варианты комплекса или его фрагменты могут таким образом содержать консервативные замены независимо друг от друга, где по меньшей мере один глицин (Gly) в указанном варианте или его фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Ala, Val, Leu, и Ile, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один аланин (Ala) в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Gly, Val, Leu и Ile, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один валин (Val) в указанном варианте или его фрагменте замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Gly, Ala, Leu, и Ile, и независимо от этого варианты или его фрагменты, где по меньшей мере лейцин (Leu) указанного варианта или его фрагменты замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, Gly, Ala, Val, и Ile, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один изолейцин (Ile) указанных вариантов или их фрагментов замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Gly, Ala, Val и Leu, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере одна аспарагиновая кислота (Asp) в указанном варианте или его фрагменте замещена аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Glu, Asn, и Gln, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один аспарагин (Asn) в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Asp, Glu, и Gln, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один глутамин (Gln) в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Asp, Glu, и Asn, и где по меньшей мере один фенилаланин в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Туг, Trp, His, Pro, и предпочтительно выбранной из группы аминокислот, состоящей из Tyr и Trp, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один тирозин (Tyr) в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Phe, Trp, His, Pro, предпочтительно аминокислоты, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Phe и Trp, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один аргинин (Arg) в указанном фрагменте замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Lys и His, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один лизин (Lys) в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Arg и His, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один пролин (Pro) в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Phe, Tyr, Trp, и His, и независимо от этого варианты или их фрагменты, где по меньшей мере один цистеин (Cys) в указанных вариантах или их фрагментах замещен аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, состоящей из Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, и Tyr.

Таким образом, из вышесказанного следует, что один и тот же вариант пептидного фрагмента или фрагмент указанного варианта может содержать более чем одну консервативную аминокислотную замену из более чем одной группы консервативных аминокислот, как определено в данном документе ранее. Термин «консервативная аминокислотная замена» применяют в данном документе тождественно с термином «гомологичная аминокислотная замена».

Группами консервативных аминокислот являются следующие:

A, G (нейтральные, слабогидрофобные),

Q, N, S, Т (гидрофильные, незаряженные)

E, D (гидрофильные, кислые)

Н, K, R (гидрофильные, основные)

L, Р, I, V, М, F, Y, W (гидрофильные, ароматические)

С (поперечно сшивающие)

Консервативные замены могут вводить в любое положение предпочтительного пептида, предназначенного для применения по изобретению, или его фрагмента. Однако также желательным может быть введение неконсервативных замен, в частности, но не ограничиваясь указанным, неконсервативной замены в любом из одного или более положений.

Неконсервативная замена, приводящая к образованию варианта фрагмента пептида для применения по изобретению, может, например, по существу отличаться (i) полярностью, например, остаток с неполярной боковой цепью (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe или Met) замещается остатком с полярной боковой цепью, таким как Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, или Gln или заряженной аминокислотой, такой как Asp, Glu, Arg, и Lys, или заряженный или полярный остаток замещается неполярным остатком; и/или (ii) отличия состоят в эффекте в отношении ориентации пептидного остова, например, при замещении Pro или Gly другим остатком; и/или (iii) отличия состоят в электрическом заряде, например, при замещении отрицательно заряженного остатка, такого как Glu или Asp, положительно заряженным остатком, таким как Lys, His или Arg (и наоборот); и/или (iv) отличия состоят в основном в стерическом объеме, например, при замещении объемного остатка, такого как His, Trp, Phe или Tyr остатком, обладающим меньшей боковой цепью, например Ala, Gly или Ser (и наоборот).

Замещение аминокислот в одном воплощении может быть выполнено на основании их уровней гидрофобности и гидрофильности и относительного сходства боковой цепи заместителя аминокислоты, включая заряд, размер и др.

Пептид по изобретению представляет собой пептид, способный взаимодействовать с рецептором ИЛ-4.

В одном воплощении пептид по изобретению способен модулировать сигналинг рецептора ИЛ-4.

В предпочтительном воплощении пептид по изобретению способен стимулировать сигналинг ИЛ-4. В другом предпочтительном воплощении пептид по изобретению способен ингибировать сигналинг рецептора ИЛ-4.

В другом воплощении пептид по изобретению способен активировать В-клетки.

В еще одном воплощении пептид по изобретению способен активировать рост и выживание Т-клеток.

В другом воплощении пептид по изобретению способен снижать количество С5а и С3а рецепторов в моноцитах и дендритных клетках.

В еще одном воплощении пептид по изобретению способен ингибировать активацию макрофагов.

Как фрагменты, так и варианты аминокислотных последовательностей по изобретению функционально эквивалентны указанным последовательностям.

Термин «функциональный эквивалент» аминокислотной последовательности в настоящем контексте обозначает молекулу, которая соответствует критериям для варианта или фрагмента указанной аминокислотной последовательности, описанной ранее, и которая способна проявлять одну или более функциональную активность указанной последовательности или соединения, содержащего указанную последовательность. В предпочтительном воплощении функциональный эквивалент аминокислотной последовательности по изобретению способен взаимодействовать с рецептором ИЛ-4 и модулировать сигналинг рецептора ИЛ-4.

Изобретение относится как к изолированным пептидам по изобретению, так и к слитым белкам, содержащим пептиды по изобретению.

В одном воплощении пептид по изобретению представляет собой изолированный пептид. Термин «изолированный пептид» обозначает пептид по изобретению, представляющий собой отдельное соединение, а не часть другого соединения. Изолированный пептид может быть получен с помощью любых способов рекомбинации или химического синтеза и отделен от других соединений, или он может быть отделен от более длинного полипептида или белка посредством способа энзиматического или химического расщепления и дальнейшего отделения от других белковых фрагментов.

Последовательность пептида может присутствовать в соединении в виде единственной копии, т.е. созданной в виде мономера последовательности пептида, или он может присутствовать в виде нескольких копий одинаковых последовательностей, например в виде мультимера, содержащего две или более копий последовательности, выбранной из SEQ ID NO:1-37, или двух или более копий фрагмента или варианта указанной последовательности.

В другом воплощении изолированный пептид по изобретению может содержать фрагмент интерлейкина-4, который состоит из непрерывной аминокислотной последовательности, полученной из интерлейкина-4, выбранной из SEQ ID NO:1-37 или ее варианта. В другом воплощении изолированный пептид может состоять из одной или более последовательностей SEQ ID NO:1-37.

Получение пептидных последовательностей

Пептидная последовательность по настоящему изобретению может быть получена любым из общепринятых способов синтеза, технологий рекомбинации ДНК, энзиматического расщепления полноразмерных белков, из которых получают пептидные последовательности, или комбинации указанных способов.

Синтетическое получение

Способы синтетического получения пептидов хорошо известны в области техники. Подробное описание, а также практическое руководство для получения синтетических пептидов можно найти в Synthetic Peptides: A User's Guide (Advances in Molecular Biology), Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002, или в Pharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins, Frokjaer and Hovgaard eds., Taylorand Francis, 1999.

Пептиды, например, могут быть синтезированы путем химического синтеза с помощью Fmoc (флторенилметилоксикарбонила) и при помощи Acm-защищенных цистеинов. После очистки посредством фазовой ВЭЖХ пептиды могут быть в дальнейшем обработаны для получения, например, циклических или С- или N-концевых модифицированных изоформ. Способы циклизации и терминальной модификации хорошо известны в области техники и подробно описаны в вышеуказанных руководствах.

В предпочтительном воплощении пептидные последовательности по изобретению получают синтетическим способом, в частности способом пептидного синтеза при помощи последовательности (SAPS - sequence assisted peptide synthesis).

Пептиды могут быть синтезированы либо партиями в полиэтиленовом сосуде, оборудованном полипропиленовым фильтром для фильтрации, либо с помощью варианта твердофазного способа на полиамиде с непрерывным режимом (Dryland, A. and Sheppard, R.C., (1986) J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125-137) на полностью автоматическом синтезаторе пептидов с 9-фторенилметилоксикарбонилом (Fmoc) или трет-бутилоксикарбонилом (Вое) в качестве N-a-амино-защитной группы и приемлемыми общеизвестными защитными группами на функциональных группах боковой цепи.

Рекомбинантное получение

Таким образом, в одном воплощении пептиды по изобретению получают с помощью технологии рекомбинации ДНК.

Последовательность ДНК, кодирующая пептид или соответствующий полноразмерный белок, из которого происходит пептид, может быть получена синтетически посредством хорошо известных стандартных способов, например фосфоамидинового способа, описанного Beaucage and Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1869, или способа, описанного Matthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-805. Согласно фосфоамидиновому способу, олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом синтезаторе ДНК, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в приемлемые векторы.

Последовательность ДНК, кодирующая пептид, может также быть получена посредством фрагментации последовательностей ДНК, кодирующих соответствующий полноразмерный белок пептидного происхождения, при помощи ДНКазы I согласно стандартному протоколу (Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2 rd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Настоящее изобретение относится к полноразмерным белкам, выбранным из группы белков, определенных ранее. ДНК, кодирующая полноразмерные белки по изобретению, альтернативно может быть фрагментирована при помощи специфических рестрицирующих эндонуклеаз. Фрагменты ДНК в дальнейшем очищают при помощи стандартных процедур, описанных в Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2 rd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Последовательность ДНК, кодирующая полноразмерный белок, также может иметь происхождение из геномной или кДНК, например, полученной посредством приготовления библиотеки геномной или кДНК и скрининга последовательностей ДНК, кодирующих полноразмерный белок целиком или часть полноразмерного белка, путем гибридизации при помощи синтетических олигонуклеотидных проб согласно стандартным способам (cf. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989). Последовательность ДНК также может быть получена путем полимеразной цепной реакции при помощи специфических праймеров, например, как описано в US 4,683,202 или в Saiki et al., 1988, Science 239:487-491.

Затем последовательность ДНК встраивают в рекомбинантный экспрессионный вектор, которым может быть любой вектор, удобный для получения рекомбинантной ДНК. Выбор вектора часто зависит от клетки хозяина, в которую он будет введен. Таким образом, вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует в виде внехромосомного элемента, репликация которого не зависит от репликации хромосомы, например, плазмиды. Альтернативно, это может быть вектор, который при введении в клетку хозяина встраивается в геном клетки хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ми), в которую он встраивается.

В векторе последовательность ДНК, кодирующая пептид или полноразмерный белок, должна быть функционально соединена с приемлемой промоторной последовательностью. Промотор может представлять собой любую последовательность ДНК, которая проявляет предпочтительную транскрипционную активность в клетке хозяина и может быть получена из генов, кодирующих белки или гомологичные или гетерологичные в отношении хозяйской клетки. Примерами приемлемых промоторов для управления транскрипцией кодирующей последовательности ДНК в клетках млекопитающих являются промотор SV40 (Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1:854-864), промотер МТ-1 (ген металлотионеина) (Palmiter et al., 1983, Science 222:809-814) или основной поздний промотор аденовируса 2. Приемлемый промотор для применения в клетках насекомых представляет собой промотор полигедрина (Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311:7-11). Приемлемые промоторы для применения в дрожжевых хозяйских клетках включают промоторы из дрожжевых гликолитических генов (Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:12073-12080; Alber и Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1:419-434) или генов алкогольдегидрогеназы (Young et al., 1982, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaenderetal, eds., Plenum Press, New York), или промоторы ТРИ (US 4,599,311) или ADH2-4c (Russell et al., 1983, Nature 304:652-654). Приемлемые промоторы для применения в мицелиальных хозяйских клетках представляют собой, например, промотор ADH3 (McKnight et al., 1985, EMBO J. 4:2093-2099) или промотор tpiA.

Кодирующая последовательность ДНК также может быть функционально соединена с приемлемым терминатором, таким как терминатор гормона роста человека (Palmiter et al., op. cit), или (для хозяев-грибов) с промоторами ТРИ (Alber and Kawasaki, указ. соч.) или ADH3 (McKnight et al., указ. соч.). Кроме того, вектор может содержать элементы, такие как сигналы полиаденилирования (например, из региона SV 40 или Elb аденовируса 5), транскрипционные энхансерные последовательности (например, энхансер SV 40) и трансляционные энхансерные последовательности (например, таковые, кодирующие VA РНК аденовируса).

Кроме того, рекомбинантный экспрессионный вектор может содержать последовательность ДНК, позволяющую вектору реплицироваться в рассматриваемой клетке-хозяине. Примером такой последовательности (если клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего) является ориджин репликации SV 40. Также вектор может содержать маркер селекции, например ген, продукт которого восполняет недостаток в клетке-хозяине, такой как ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу (ДГФР), или ген, придающий устойчивость к лекарственным средствам, например, неомицину, гидромицину или метотрексату.

Способы, применяемые для лигирования последовательностей ДНК, кодирующих пептиды или полноразмерные белки, промотор и терминатор соответственно, и встраивания их в приемлемые векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны специалистам в области техники (см., например, Sambrook et al., в цитируемой работе).

Для получения рекомбинантных пептидов по изобретению кодирующие последовательности ДНК могут быть эффективно соединены со второй последовательностью, кодирующей пептид, и последовательностью, кодирующей сайт расщепления протеазой, образуя конструкцию ДНК, кодирующую рекомбинантный белок, где последовательность, кодирующая сайт расщепления протеазой, расположенный между фрагментом НВР и второй ДНК, кодирующей пептид, встроена в рекомбинантный экспрессионный вектор и экспрессируется в клетках хозяина. В одном воплощении, указанный второй пептид выбран, не ограничиваясь указанным, из группы, включающей глутатион-3-редуктазу, тимозин теленка, бактериальный тиоредоксин или человеческий убиквитин естественного или синтетического типа, или его пептиды. В другом воплощении пептидная последовательность, содержащая сайт для расщепления протеазой, может представлять собой фактор Ха с аминокислотной последовательностью IEGR, энтерокиназу с аминокислотной последовательностью сайта расщепления DDDDK, тромбин с аминокислотной последовательностью сайта расщепления LVPR/GS, или Acharombacter lyticus с аминокислотной последовательностью сайта расщепления XKX.

Клетка-хозяин, в которую вводят экспрессионный вектор, может представлять собой любую клетку, способную экспрессировать пептиды или полноразмерные белки, и предпочтительно представляет собой эукариотическую клетку, такую как клетки беспозвоночных (насекомое) или клетки позвоночных, например ооциты Xenopus laevis или клетки млекопитающего, в частности клетки насекомого и млекопитающего. Примеры приемлемых клеточных линий млекопитающих представляют собой клеточные линии HEK293 (АТСС CRL-1573), COS (ATCC CRL-1650), BHK (ATCC CRL-1632, АТСС CCL-10) или СНО (ATCC CCL-61). Способы трансфекции клеток млекопитающих и экспрессирующие последовательности ДНК, вводимые в клетки, описаны, например, в Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp.601-621; Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341; Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422-426; Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro and Pearson, 1981, в Somatic Cell Genetics 7, p.603; Graham and van der Eb, 1973, Virol. 52:456; и Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845.

Альтернативно, в качестве клеток-хозяев могут использовать клетки грибов (включая клетки дрожжей). Примеры приемлемых клеток дрожжей включают клетки Saccharomyces spp. или Schizosaccharomyces spp., в частности штаммы Saccharomyces cerevisiae. Примерами других клеток грибов являются клетки мицелиальных грибов, например, Aspergillus spp. или Neurospora spp., в частности штаммы Aspergillus oryzae или Aspergillus niger. Применение Aspergillus spp. для экспрессии белков описано, например, в ЕР 238 023.

Среда, применяемая для культивирования клеток, может представлять собой любую обычную среду, приемлемую для выращивания клеток млекопитающих, такую как среда, содержащая или не содержащая сыворотку, включающую подходящие добавки, или среда, приемлемая для роста клеток насекомых, дрожжей или грибов. Приемлемая среда доступна от частных поставщиков или может быть приготовлена согласно опубликованным протоколам (например, в каталогах Американской коллекции типовых культур).

Пептиды или полноразмерные белки, полученные рекомбинантным способом в клетках, затем могут очищаться от культуральной среды обычными способами, включающими отделение хозяйских клеток от среды при помощи центрифугирования или фильтрации, осаждения белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью солей, например, сульфата аммония, очистки посредством хроматографических способов, например ВЭЖХ, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и др.

Лекарственное средство

Задачей изобретения является создать соединение, способное модулировать активность ИЛ-4, где указанное соединение по изобретению можно применять в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, при которых модуляция сигналинга ИЛ-4 может рассматриваться как существенное условие для выздоровления.

Таким образом, изобретение относится к применению одного или более пептидов, содержащих последовательность, полученную из ИЛ-4, или ее фрагмент или вариант, для изготовления лекарственного средства.

В одном воплощении лекарственное средство по изобретению содержит по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей согласно SEQ ID NO:1-37, или фрагментов или вариантов указанных последовательностей. В другом воплощении лекарственное средство по изобретению содержит антитело, способное связываться с эпитопом ИЛ-4 или его фрагментом, или фрагмент или вариант указанного антитела.

Лекарственное средство по изобретению содержит эффективное количество одного или более соединений, определенных выше, или композицию, содержащую соединение, определенное выше, в сочетании с фармацевтически приемлемыми добавками. Такое лекарственное средство может быть, соответственно, разработано для орального, чрескожного, подкожного, местного, внутримышечного, внутривенного, внутричерепного, интратектального, интрацеребровентрикулярного, назального, интраназального или пульмонального введения или парентерального введения, дополненного внутрисуставным введением в суставную сумку или около нее.

Стратегии разработки состава лекарственных средств и композиций, основанные на пептидах по настоящему изобретению, в целом соответствуют стратегиям изготовления любого другого лекарственного продукта, основанного на белке. Потенциальные проблемы и указания по преодолению этих проблем рассмотрены в некоторых руководствах, например "Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems", Ed. A.K. Banga, Technomic Publishing AG, Basel, 1995.

Инъекционные лекарственные средства обычно готовят в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, приемлемых для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Препарат также может быть эмульгирован. Активный ингредиент часто смешивают с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимы с активным ингредиентом. Приемлемые эксципиенты представляют собой, например, воду, солевой раствор, декстрозу, глицерин, этанол или др. и их комбинации. Кроме того, по желанию, препарат может содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, агенты, регулирующие рН, или повышающие эффективность или доставку препарата.

Препараты соединений по изобретению могут быть получены способами, известными специалистам в области техники. Препараты могут содержать фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты, включая микросферы, липосомы, микрокапсулы, наночастицы или др.

Соответственно, препарат может быть введен путем инъекции, возможно, в том месте, где активный ингредиент оказывает свое воздействие. Дополнительные препараты, приемлемые для других способов введения, включают свечи, назальные, пульмональные и, в некоторых случаях, оральные препараты. Традиционные связывающие вещества и носители для свечей включают полиалкиленгликоли или триглицериды. Такие свечи могут быть приготовлены из смесей, содержащих активный ингредиент(ы) в пределах от 0,5% до 10%, предпочтительно 1-2%. Оральные препараты включают такие обычно применяемые эксципиенты, как, например, фармацевтические категории маннитола, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и др. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, препаратов с замедленным высвобождением или порошков и обычно содержат 10-95% активного ингредиента(ов), предпочтительно 25-70%.

Другие препараты представляют собой таковые, приемлемые для назального и пульмонального введения, например, ингаляторы и аэрозоли.

Активное соединение может быть включено в состав в нейтральной или солевой форме.

Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (например, полученные при помощи свободных аминогрупп пептидного соединения), полученные с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфорная, серная, азотная кислоты и другие, или органическими кислотами, такими как муравьиная, уксусная, трихлоруксусная, трифторуксусная, пропионовая, бензойная, коричная, лимонная, фумаровая, гликолевая, молочная, малеиновая, яблочная, малоновая, миндальная, щавелевая, пикриновая, пировиноградная, салициловая, янтарная, метансульфоновая, этансульфоновая, винная, аскорбиновая, памовая, бисметиленсалициловая, этандисульфоновая, глюконовая, цитраконовая, аспарагиновая, стеариновая, пальметиновая, этилендиамин тетрауксусная (ЭДТК), гликолевая, п-аминобензойная, глутаминовая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая кислоты и др. Соли, приготовленные при помощи свободной карбоксильной группы, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и др.

Дополнительные примеры неорганических и органических солей присоединения кислоты включают фармацевтически приемлемые соли, описанные в J. Pharm. Sci. 1977, 66, 2, которые включены в данный документ путем ссылки. Примеры солей металлов включают соли лития, натрия, калия, магния и др. Примеры солей аммония и алкилированных солей аммония включают соли аммония, метиламмония, диметиламмония, триметиламмония, этиламмония, гидроксиэтиламмония, диэтиламмония, бутиламмония, тетраметиламмония и др.

Препараты вводят способом, совместимым с лекарственной формой, и в количестве, необходимом для достижения терапевтического эффекта. Вводимое количество зависит от субъекта, подлежащего лечению, например от массы и возраста субъекта, заболевания, подлежащего лечению, и стадии заболевания. Приемлемые диапазоны доз, соответствующие килограмму массы тела, обычно приблизительно равны нескольким сотням мкг активного ингредиента на одно введение, с предпочтительным диапазоном от приблизительно 0,1 мкг до 5000 мкг на килограмм массы тела. При применении мономерных форм соединений приемлемые дозы часто находятся в интервале от 0,1 мкг до 3000 мкг на килограмм массы тела и, в частности, в пределах от приблизительно 0,1 мкг до 1000 мкг на килограмм массы тела. При применении мультимерных форм соединений приемлемые дозы часто лежат в интервале от 0,1 мкг до 1000 мкг на килограмм массы тела, например в интервале от приблизительно 0,1 мкг до 750 мкг на килограмм массы тела и в частности в интервале от 0,1 мкг до 500 мкг на килограмм массы тела, например в интервале от приблизительно 0,1 мкг до 250 мкг на килограмм массы тела. В частности, при назальном введении применяют меньшие дозы, чем при введении другими путями. Введение может быть выполнено однократно или с последующими повторными введениями. Также доза зависит от пути введения и варьирует в зависимости от возраста и массы субъекта, подлежащего лечению. Предпочтительная доза мультимерных форм будет лежать в интервале от 1 мг до 70 мг на 70 кг массы тела.

Для большинства показаний предпочтительно локальное или по существу локальное применение.

Некоторые соединения по настоящему изобретению достаточно активны, в случае ряда других эффект будет повышаться, если препарат дополнительно содержит фармацевтически приемлемые добавки и/или носители. Такие добавки и носители известны в области техники. В некоторых случаях выгодно включать соединение, которое обеспечивает доставку активного вещества к его мишени.

В некоторых случаях необходимо вводить препарат многократно. Введение могут осуществлять путем непрерывной инфузии, такой как интравентрикулярная инфузия, или введения в больших дозах, например, несколько раз в день, ежедневно, несколько раз в неделю, еженедельно и т.д. Предпочтительно, введение лекарственного средства начинают до или сразу после того, как индивидуум был подвергнут фактору(ам), который может привести к клеточной гибели. Предпочтительно лекарственное средство вводят в течение 8 часов после воздействия фактора, например в течение 5 часов после воздействия фактора. Многие соединения демонстрируют длительный эффект, при котором введение соединений может быть выполнено с длительными интервалами, такими как 1 неделя или 2 недели.

При применении в кондуитах нерва введение может быть непрерывным или в виде небольших порций, основанном на контролируемом высвобождении активного соединения(ий). Кроме того, для контроля скорости высвобождения и/или участка высвобождения могут применять предшественники. Другие типы имплантов, а также оральное введение аналогично могут быть основаны на контролируемом высвобождении и/или применении предшественников.

Как указано выше, настоящее изобретение относится к лечению индивидуума с целью индуцирования дифференциации, модулирования пролиферации, стимулирования регенерации, нейрональной пластичности и выживания клеток in vitro или in vivo, где лечение включает введение эффективного количества одного или более соединений, как определено выше.

Другая стратегия введения включает имплантацию или введение клеток, способных экспрессировать и секретировать рассматриваемое соединение. Таким образом, соединение может быть продуцировано в месте, которое подлежит воздействию.

Лечение

Соединения по изобретению в частности полезны для лечения воспалительных заболеваний и состояний. Соединения полезны при заболеваниях и состояниях, указанных ниже, в частности полезны для лечения воспаления, ассоциированного с ревматоидным артритом и аутоиммунными заболеваниями, а также с болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона и болезнью Хантингтона.

Примеры расстройств, ассоциированных с воспалением, которые могут быть вылечены при помощи соединений по изобретению, включают нейровоспаление, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, астму и другие аллергические реакции, аутоиммунные заболевания, такие как острый рассеянный энцефаломиелит (ОРЭМ), болезнь Аддисона, боковой амиотрофический склероз (БАС), анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром (АФС), аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунная болезнь внутреннего уха, буллезный пемфигоит, целиакия, болезнь Чагеса, хроническое обструктивное заболевание легких, дерматомиозит, сахарный диабет типа 1, эндометриоз, болезнь Гудпасчера, болезнь Гравеса, синдром Гийена-Барре (СГБ), тиреоидит Хашимото, гнойный гидраденит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, интерстициальный цистит, красная волчанка, ограниченная склеродермия, рассеянный склероз, миастения гравис, нарколепсия, нейромиотония, обыкновенная пузырчатка, злокачественная анемия, полимиозит, первичный билиарный цирроз, ревматоидный артрит, шизофрения, склеродермия, синдром Съегрена, системная красная волчанка (СКВ), темпоральный артериит (также известный как «гигантоклеточный артериит»), васкулит, витилиго, синдром Вегенера, хроническое воспаление, хронический простатит, гломерулонефрит, гиперчувствительность, воспалительные заболевания кишечника, воспалительные заболевания тазовых органов, реперфузионное повреждение, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, васкулит, остеоартрит, тендовагинит и артрит.

Также возможно лечение непроходящего острого воспаления из-за недеградируемых патогенов, персистирующих чужеродных тел или аутоиммунных реакций, воспалительного заболевания центральной нервной системы, такого как менингит, энцефалит, воспалительная и токсическая нефропатия, включая острый инфекционный полиневрит, воспалительные расстройства с разрушением тканей, ВИЧ, гепатит, остеоартрит, тендовагинит и артрит.

В одном воплощении лечение может включать неиммунные заболевания, этиологическими источниками которых являются воспалительные процессы, включая рак, атеросклероз и ишемическое заболевание сердца.

Антитело

Целью настоящего изобретения является предложить применение антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или рекомбинантного белка, способных селективно связываться с эпитопом, содержащим непрерывную аминокислотную последовательность, полученную из интерлейкина-4, или ее фрагмент, гомолог или вариант. Изобретение относится к любому антителу, способному селективно связываться с эпитопом, содержащим непрерывную аминокислотную последовательность, полученную из интерлейкина-4, выбранную из любой из последовательностей SEQ ID NO:1-37, или фрагмента или варианта указанной последовательности.

Термин «эпитоп» обозначает специфическую группу атомов (на молекуле антигена), которая распознается (как антиген) антителами. Термин «эпитоп» эквивалентен термину «антигенная детерминанта». Эпитоп может содержать 3 или более аминокислотных остатков, например 4, 5, 6, 7, 8 аминокислотных остатков, которые локализованы в непосредственной близости, например внутри непрерывной аминокислотной последовательности, или локализованы в отдельных участках аминокислотной последовательности антигена, но в результате белковой укладки приближены друг к другу.

Молекулы антител относятся к семейству плазматических белков, называемых иммуноглобулинами, основная составная часть которых, иммуноглобулиновая укладка или домен, используются в различных формах во многих молекулах иммунной системы и других биологических системах распознавания. Типичный иммуноглобулин имеет четыре полипептидные цепи, содержащие антигенсвязывающий участок, известный как вариабельный участок, и невариабельный участок, известный как константный участок.

Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины размером приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи, в то же время число дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует у различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеют расположенные на равном расстоянии друг от друга дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым - некоторое количество константных доменов. Каждая легкая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VL) и на другом конце - константный домен. Константный домен легкой цепи соответствует первому константному домену тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи соответствует вариабельному домену тяжелой цепи. Полагают, что отдельные аминокислотные остатки формируют поверхность контакта между легкой и тяжелой цепями вариабельных доменов (Novotny J, & Haber Е. Proc Natl Acad Sci USA. 82(14):4592-6, 1985).

В зависимости от аминокислотных последовательностей константного домена их тяжелых цепей иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существует по меньшей мере пять (5) основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG-1, IgG-2, IgG-3 и IgG-4; IgA-1 и IgA-2. Тяжелые цепи константных доменов, которые относятся к различным классам иммуноглобулинов, называют альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (µ) соответственно. Легкие цепи антител могут быть отнесены к одному из двух сильно отличающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотных последовательностей их константного домена. Структуры субъединиц и пространственные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термин «вариабельный» в контексте вариабельного домена антител относится к тому факту, что среди антител определенные части вариабельных доменов сильно отличаются по последовательности. Вариабельные домены служат для связывания и определения специфичности каждого конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность не всегда одинаково распределена на протяжении вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность, (CDR), также известными как гипервариабельные участки вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи.

Более высококонсервативные части вариабельных доменов называют каркасом (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепи содержат четыре FR участка, по существу принимающие конфигурацию β-слоя, которые соединены посредством трех CDR, образующих петли, соединяющие и в некоторых случаях формирующие часть структуры β-слоя. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR участков и при помощи CDR другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего участка антител. Константные домены напрямую не вовлечены в связывание антигена антителом, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.

Таким образом, антитело, предусмотренное для применения по настоящему изобретению, может быть в любой из различных форм, включая целый иммуноглобулин, фрагмент антитела, такой как Fv, Fab, и подобные фрагменты, одну цепь антитела, которая включает вариабельные домены областей, определяющих комплементарность, (CDR), и подобные формы, причем все они подпадают под широкий термин «антитело», как он применяется в настоящем документе. Настоящее изобретение предусматривает применение антитела любой специфичности, поликлонального или моноклонального, и не ограничено антителами, которые распознают и осуществляют иммунную реакцию со специфическим антигеном. В контексте как способа лечения, так и способа скрининга, описанных ниже, предпочтительные воплощения представляют собой применение антитела или его фрагмента, где это антитело или фрагмент являются иммуноспецифичными для антигена или эпитопа по изобретению.

Термин «фрагмент антитела» относится к части полноразмерного антитела, обычно антигенсвязывающему или вариабельному участку. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты. Папаиновое расщепление антител приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых Fab фрагментами, каждый из которых имеет единственный антигенсвязывающий сайт, и остаточному "Fc" фрагменту, названному так из-за его способности легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает F(ab')₂ фрагмент, который имеет два антигенсвязывающих участка, способных перекрестно сшивать антиген, и другой остаточный фрагмент (обозначенный pFc'). Дополнительные фрагменты могут включать диатело, нормальные антитела, молекулы антител с одной цепью и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антитела. В данном документе термин «функциональный фрагмент» применительно к антителам относится к Fv, F(ab) и F(ab')₂ фрагментам.

Термин "фрагмент антитела" употребляется в данном документе взаимозаменяемо с термином "антигенсвязывающий фрагмент".

Фрагменты антитела могут иметь размер приблизительно 4 аминокислот, 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 9 аминокислот, приблизительно 12 аминокислот, приблизительно 15 аминокислот, приблизительно 17 аминокислот, приблизительно 18 аминокислот, приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 25 аминокислот, приблизительно 30 аминокислот или более. Обычно фрагмент антитела по изобретению может иметь любой максимальный размер, настолько большой, насколько это позволит ему иметь сходные или иммунологические свойства по сравнению с антителом, которое специфично связывается с эпитопом, содержащим пептидную последовательность, выбранную из любой последовательности, определенной в данном документе как SEQ ID NO:1-37, или фрагмента указанной последовательности. Таким образом, в контексте настоящего изобретения термин «фрагмент антитела» идентичен термину «антигенсвязывающий фрагмент».

Фрагменты антител сохраняют некоторую способность селективно связывать свой антиген или рецептор. Некоторые типы фрагментов антител определены следующим образом:

(1) Fab представляет собой фрагмент, который содержит моновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела. Fab фрагмент может быть получен путем расщепления целого антитела при помощи фермента папаина с образованием интактной легкой цепи и части одной тяжелой цепи.

(2) Fab' представляет собой фрагмент молекулы антитела, который может быть получен путем обработки целого антитела пепсином с последующим восстановлением с образованием интактной легкой цепи и части тяжелой цепи. Из одной молекулы антитела получают два Fab' фрагмента. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце тяжелой цепи домена СН1, включая один или более цистеин из шарнирной области антитела.

(3) (Fab')₂ представляет собой фрагмент антитела, который может быть получен посредством обработки целого антитела ферментом пепсином без последующего восстановления.

(4) F(ab')₂ представляет собой димер из двух Fab' фрагментов, связанных вместе посредством двух дисульфидных связей.

Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный участок распознавания и связывания антигена. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в прочной нековалентной ассоциации (V_H - V_L димер). Его конфигурация такова, что три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с определенным антигенсвязывающим сайтом на поверхности димера V_H - V_L. В совокупности шесть CDR придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три CDR, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем целый связывающий участок.

(5) Одноцепочечное антитело (single chain antibody, SCA) определяется как молекула, подвергнутая генной инженерии, содержащая вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи, связанный приемлемым полипептидным линкером, в виде генетически слитой одноцепочечной молекулы. Такие одноцепочечные антитела также относятся к "одноцепочечным Fv" или "sFv" фрагментам антител. Обычно Fv полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между VH и VL доменами, который позволяет sFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Для ознакомления с sFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113:269-315 Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, NY, 1994.

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими участками, фрагменты которых содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одну полипептидную цепь (VH-VL). За счет линкера, который слишком короток, чтобы допустить соединение между двумя доменами на одной цепи, домены вынуждены соединяться с комлементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих участка. Более полно диатела описаны, например, в ЕР 404,097; WO 93/11161 и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448(1993).

Изобретение также предусматривает мультивалентные антитела, обладающие по меньшей мере двумя связывающими доменами. Связывающие домены могут обладать специфичностью по отношению к одному лиганду или различным лигандам. В одном воплощении мультиспецифичная молекула представляет собой биспецифичное антитело (BsAb), которое несет по меньшей мере два различных связывающих домена, по меньшей мере один из которых происходит из антитела. Мультивалентные антитела могут быть получены рядом способов. Различные способы получения би- и мультивалентных антител описаны, например, в U.S. Pat. No. 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498 и 5,482,858.

Изобретение включает как поликлональное, так и моноклональное антитело, антигенсвязывающие фрагменты и их рекомбинантные белки, способные связываться с эпитопом по изобретению.

Получение поликлональных антител хорошо известно специалистам в области техники. См., например, Green et al. 1992. Production of Polyclonal Antisera, in: Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press); Coligan, et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters, in: Current Protocols in Immunology, section 2.4.1, включенные в данный документ при помощи ссылки.

Получение моноклональных антител также традиционно. См., например, Kohler & Milstein, Nature, 256:495-7 (1975); Coligan, et al., sections 2.5.1-2.6.7; и Harlow, et al., in: Antibodies: A Laboratory Manual, page 726, Cold Spring Harbor Pub. (1988). Моноклональные антитела могут быть изолированы и очищены от гибридомной культуры посредством ряда общепризнанных способов. Такие способы изоляции включают аффинную хроматографию на протеин-А-сефарозе, гель-хроматографию и ионообменную хроматографию. См., например, Coligan, et al., sections 2.7.1-2.7.12 and sections 2.9.1-2.9.3; Barnes, et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG). In: Methods in Molecular Biology, 1992, 10:79-104, Humana Press, NY.

Способы работы in vitro и in vivo с моноклональными антителами хорошо известны специалистам в области техники. Например, моноклональные антитела, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть приготовлены посредством гибридомного способа, впервые описанного Kohler и Milstein, 1975, Nature 256, 495-7, или могут быть получены посредством рекомбинантных способов, например, как описано в US 4,816,567. Моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению также могут быть выделены из фаговых библиотек антител при помощи способов, описанных в Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628, а также в Marks et al., 1991, J Mol Biol 222:581-597. Другой способ включает гуманизацию моноклонального антитела посредством рекомбинантных способов для получения антител, содержащих специфические для человека и распознаваемые последовательности. См., для ознакомления Holmes, et al., 1997, J Immunol 158:2192-2201 и Vaswani, et al., 1998, Annals Allergy, Asthma & Immunol 81:105-115.

Термин «моноклональное антитело», как употребляется в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. где индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются однородными за исключением возникающих естественным образом мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против единственного антигенного участка. Кроме того, по сравнению со стандартными препаратами поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела выгодны тем, что они синтезируются гибридомной культурой, не загрязненной иммуноглобулинами. Модификатор «моноклональное» хакрактеризует антитело как полученное из по существу гомогенной популяции антител и не подлежит толкованию как подразумевающий антитело, полученное каким-либо особенным способом.

Моноклональные антитела согласно данному документу отдельно включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида, или относящихся к конкретным классам или подклассам антител, в то время как остаток цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида, или относящихся к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они проявляют желаемую биологическую активность (US 4,816,567); Morrison et al, 1984, Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855.

Способы получения фрагментов антител также известны в области техники (см., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988, включенное в данный документ посредством ссылки). Фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть получены путем протеолитического гидролиза антитела или путем экспрессии в Е.coli ДНК, кодирующей указанный фрагмент. Фрагменты антител могут быть получены посредством стандартных способов расщепления целого антитела пепсином или папаином. Например, фрагменты антител могут быть получены посредством ферментативного расщепления антител при помощи пепсина для получения 5S фрагмента, обозначенного F(ab')₂. Данный фрагмент может быть дополнительно расщеплен при помощи тиолредуцирующего агента и при ряде блокирующих групп для сульфгидрильных групп, образующихся в результате расщепления дисульфидных связей, дает 3.5S Fab' моновалентные фрагменты. Альтернативно, ферментативное расщепление при помощи пепсина непосредственно дает два моновалентных Fab'фрагмента и Fc фрагмент. Эти способы описаны, например, в US 4,036,945 и US 4,331,647, и содержащихся в них ссылках. Эти патенты включены во всей их полноте в данный документ путем ссылки.

Могут применять другие способы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легкой-тяжелой цепи, дополнительное расщепление фрагментов или другие ферментативные, химические или генетические способы, если полученные фрагменты будут связывать антиген, который распознает интактное антитело. Например, Fv фрагменты содержат ассоциацию V_H и V_L цепей. Эта ассоциация может быть нековалентной, или вариабельные цепи могут быть связаны посредством внутримолекулярных дисульфидных связей или поперечно сшиты посредством химических веществ, таких как глутаральдегид. Предпочтительно, Fv фрагменты содержат V_H и V_L цепи, соединенные посредством пептидного линкера. Эти одноцепочечные антигенсвязывающие белки (sFv) получают посредством конструирования структурного гена, содержащего последовательности ДНК, кодирующие V_H и V_L домены, соединенные олигонуклеотидом. Структурный ген встраивают в экспрессионный вектор, который затем вводят в хозяйскую клетку, такую как Е.coli. Рекомбинантные хозяйские клетки синтезируют одну полипептидную цепь с линкерным пептидом, соединяющим два V домена. Способы получения sFv описаны, например, Whitlow, et al., 1991 в Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97; Bird et al., 1988, Science 242:423-426; US 4,946,778; и Pack, et al., 1993, BioTechnology 11:1271-77.

Другие формы фрагмента антитела представляют собой пептид, кодирующий одну область, определяющую комплементарность, (CDR). CDR пептиды ("минимальные единицы распознавания") часто вовлечены в распознавание и связывание антигена. Пептиды CDR могут быть получены путем клонирования или конструирования генов, кодирующих CDR интересующего антитела. Такие гены получают, например, посредством полимеразной цепной реакции для синтеза вариабельного участка РНК клеток, продуцирующих антитела. См., например, Larrick, et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol.2, page 106 (1991).

Изобретение предусматривает человеческие и гуманизированные формы нечеловеческих (например, мышиных) антител. Такие гуманизирванные антитела представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие, как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина, такую как последовательность, распознающую эпитоп. В большинстве случаев гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки в области, определяющей комплементарность, (CDR) реципиента замещены остатками CDR нечеловеческих видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, обладающих желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. Гуманизированное антитело(ла), содержащее минимальную последовательность(ти) атитела(ел) по изобретению, такую как последовательность(ти), распознающую эпитоп(ы), описанные в данном документе, представляют собой одно из предпочтительных воплощений по изобретению.

В некоторых случаях Fv каркасные остатки человеческого иммуноглобулина замещены соответствующими нечеловеческих остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются ни в реципиентном антителе, ни в импортированных CDR или каркасной последовательностях. Эти модификации осуществляют для дополнительного улучшения и оптимизации свойств антитела. Обычно гуманизированные антитела по существу содержат любой из по меньшей мере одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все CDR участки соответствуют таковым нечеловеческого иммуноглобулина и все или практически все FR участки являются FR участками консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Также, оптимально, гуманизированное антитело содержит по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Более подробно см.: Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Reichmann et al. 1988 Nature 332, 323-329; Presta, 1992, Curr Op Struct Biol 2:593-596; Holmes et al., 1997, J Immunol 158:2192-2201 и Vaswani, et al., 1998, Annals Allergy, Asthma & Immunol 81:105-115.

Антитела могут получать любыми стандартными в области техники способами получения поликлональных и моноклональных антител с использованием естественных или рекомбинантных фрагментов последовательности, выбранной из любой последовательности, определенной как SEQ ID NO:1-37, в качестве антигена. Такие антитела также могут быть получены при помощи вариантов или фрагментов SEQ ID NOs: 1-37.

Антитела также могут быть получены in vivo посредством обработки индивидуума, например путем введения иммуногенного фрагмента по изобретению указанному индивидууму. Таким образом, настоящее изобретение также относится к вакцине, содержащей иммуногенный фрагмент, описанный выше.

Заявка также относится к способу получения антитела по изобретению, где указанный способ содержит стадию создания иммуногенного фрагмента, описанного выше.

Изобретение относится как к антителу, способному модулировать, например повышать или аттенуировать, биологическую функцию ИЛ-4, в частности функцию, относящуюся к воспалению, так и к антителу, которое может распознавать и специфически связывать ИЛ-4 без модулирования его биологической активности.

Изобретение относится к применению указанных антител в терапевтической области, в том числе для модуляции активности ИЛ-4.

В одном аспекте изобретение относится к применению фармацевтической композиции, содержащей антитело, описанное выше.

Примеры

Пример 1

Конструировали и синтезировали четыре пептида, представляющие собой производные ИЛ-4, (SEQ ID NOs: 1-4).

Картирование локализации пептидов выполняли, применяя программное обеспечение PyMOL™, основанное на PyMOL v0.99 (DeLano Scientific LLC, South San Francisco, California, U.S.A). Картирование выполняли на основании кристаллической структуры тройного комплекса человеческого II4-II4r-II13ra, PDB ID: 3BPN и 3BPL (LaPorte et al., 2008).

ИЛ-4 взаимодействует с двумя модулями фибронектина типа III (FN3-1 и FN3-2) внеклеточной части ИЛ-4Rα (Фигура 1 и 2). ИЛ-4 взаимодействует с двумя модулями фибронектина типа III (FN3-1 и FN3-2) внеклеточной части ИЛ-4Rα и γ-цепи (фигуры 3 и 4).

Пример 2

4 пептида, полученные из ИЛ-4, тестировали в анализе разрастания нейритов, где они обладали той или иной биологической активностью.

Мозжечковые шаровые нейроны (CGN) готовили из крыс Вистар трехдевного и семидневного возрастов (Р3 и Р7) (Charles River, Suizfeld, Germany или Taconic, Ejby, Denmark). Мозжечок очищали от оболочек и кровяных сосудов, по существу гомогенизировали путем измельчения и трипсинизировали при помощи трипсина фирмы Sigma-Aldrich (Brendby, Denmark). Нейроны отмывали в присутствии ДНКазы 1 и соевого ингибитора трипсина (Sigma-Aldrich), и продукты распада клеток осаждали центрифугированием до посева. Для экспериментов с моноклональной культурой Р7 CGNs высевали с плотностью 10000 клеток/лунку на непокрытые восьмилуночные предметные стекла Lab-Tek (NUNC, Slangerup, Denmark) в нейробазальную среду-А, дополненную 0,4% (м/о) БСА. К среде сразу после посева добавляли пептиды в различных концентрациях, и клетки выдерживали при 37°С и 5% CO₂ в течение 24 ч. Затем культуры фиксировали, блокировали и инкубировали с поликлональным кроличьим антителом против GAP-43 крысы (Chemicon, Temecula, CA, USA) с последующей инкубацией с вторичным козьим антикроличьим антителом Alexa Fluor488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), как описано ранее (Neiiendam et al., 2004). Все иммуномеченые культуры были учтены посредством компьютизированной флуоресцентной микроскопии при помощи инвертированного микроскопа Nikon Diaphot (Nikon, Japan), оборудованного 20× объективом Nikon Plane. Изображения получали при помощи видеокамеры с зарядовой связью (Grundig Electronics, Nurnberg, Germany), используя пакет программного обеспечения Prima, разработанного в Protein Laboratory (University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark). Длину нейрональных отростков на клетку вычисляли при помощи пакета программного обеспечения Process Length, разработанного в Protein Laboratory (Ronn et al. 2000). Для вычисления разрастания нейритов обрабатывали по меньшей мере 200±20 клеток для каждой группы в каждом отдельном эксперименте.

Результаты:

Обнаружено, что пептиды с SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4 из ИЛ-4 связывающего участка индуцируют нейритогенный ответ первичных нейронов. Результаты воздействия SEQ ID NOs: 1 2, 3 и 4 на разрастание мозжечковых нейритов приведены на фигурах 5, 6, 9 и 12 соответственно.

Пример 3

Первичные макрофагальные клетки (или клетки клеточной линии макрофагов AMJ2C8, см. Ryan et al., 1997) могут культивировать в течение 24 ч при плотности 6×10^-5 клеток/мл в 12-луночных планшетах (Nunc, Slangerup, Denmark) при 37°С, 5% СО₂ и влажности 95%. Для определения высвобождения фактора некроза опухоли α (TNF-α) в ответ на стимуляцию липополисахаридами (ЛПС) трипликатные культуры культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, (DMEM) с 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) в течение 24 ч и затем стимулировали при помощи 0-10 мкг/мл ЛПС в течение дополнительного периода 24 ч, после которого отбирали супернатанты культур. Определение концентраций TNF-α в кондиционированной среде из обработанных ЛПС макрофагов выполняли при помощи L929 фибробластоподобных клеток, которые были чувствительны к TNF-α после воздействия актиномицином D (Не et al., 2002). L929 клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 20000 клеток на лунку и выдерживали при 37°С, 5% CO₂, RPMI 1640, дополненной 10% ФТС и 0,5% пенициллин-стрептомицином. За 1 час до применения в качестве TNF-α биотеста L929 клетки предварительно обрабатывали 5 мкг/мл актиномицином D (Sigma), и дополнительно инкубировали в различных разведениях с кондиционированной средой из ЛПС-обработанных культур макрофагов. Затем оценивали жизнеспособность клеток при помощи анализа CellTiter 96 (Promega, Madison, WI, USA).

Макрофаг-активирующие тест-системы

- Макрофаги высевали в 6-луночный аглютинационный планшет объемом 9,6 см² на лунку при плотности 10000 клеток/лунка.

- Пептиды или белки с потенциальными противовоспалительными эффектами добавляли к культуре. В качестве негативного контроля в одну лунку добавляли среду и в качестве позитивного контроля в одну лунку добавляли 100 мкл гидрокортизона.

- Клеточные культуры инкубировали в течение 24 ч при 37°С.

- Для активации макрофагов к культурам макрофагов добавляли γ-интерферон (IFN-γ) в концентрации 0,01 мкг/мл. В качестве контроля в одну лунку добавляли не IFN-γ, а среду.

- Клетки фибробластов высевали в 96-луночный планшет, в концентрации 0,2×10² клеток/мл.

- Обе клеточные культуры инкубировали в течение 24 ч при 37°С.

Кондиционированную среду из макрофагов отбирали путем открутки раствора с клетками в течение 5 мин при 1200 об/мин. К фибробластам добавляли кондиционированную среду, TNF-α добавляли для титрационной кривой и в конце добавляли актиномицин D к фибробластам в концентрации 0,5 мкг/мл.

Результаты:

Изучали воздействие пептидов с SEQ ID NO:1, 3, 5, 6 и 19 на ингибирование воспалительного ответа в культурах клеток макрофагов. Результаты приведены на фигурах 7, 10 и 13-17.

Пример 4

Изучение связывания при помощи анализа поверхностного плазменного резонанса (SPR)

Рекомбинантный ИЛ4Rα иммобилизировали на СМ5 сенсорном чипе. Процесс иммобилизации осуществляли путем активирования карбоксиметилированного декстранового матрикса при помощи 35 мкл активирующего раствора с последующей инъекцией белка в 10 мМ раствор ацетата натрия (рН 5,0). После желаемый титр белка иммобилизовали путем введения 35 мкл деактивирующего раствора с целью деактивировать любые свободные карбоксиметилированные группы в декстрановом матриксе. Для контроля одна проточная кювета всегда была пустой. Каждое анализируемое вещество (рекомбинантный ИЛ-4 или полученные из ИЛ-4 пептиды) растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) и вводили при скорости тока 10 мкл/мин. Полученные данные анализировали, выполняя нелинейную обработку кривых при помощи программного обеспечения BIAevaluation v.4 от Biacore. Кривые были подобраны до 1:1 по модели связывания Ленгмюра, которая описывает взаимодействие двух молекул в 1:1 комплексе. Аффинную константу (K_D) вычисляли исходя из константы скорости ассоциации (k_a) и константы скорости диссоциации (k_d). Вычисление выполняли при помощи следующей формулы, где L представляет собой иммобилизованный лиганд, А - аналит и LA представляет собой комплекс аналит-лиганд:

Модель Ленгмюра 1:1:

$$L+A\frac{k_a\to }{\leftarrow k_d}LA$$

Скорость снижения концентрации лиганда: $$\frac{d[L]}{dt}=-\left(k_a*[L]*[A]-k_d*[LA]\right)$$

Скорость повышения концентрации продукта: $$\frac{d[LA]}{dt}=k_a*[L]*[A]-k_d*[LA]$$

В состоянии равновесия: $$\frac{d[LA]}{dt}=0$$

$$\Rightarrow k_a*[L]*[A]-k_d*[LA]=0$$

$$\Rightarrow \frac{[L]*[A]}{[LA]}=\frac{k_d}{k_a}{K}_D$$

Результаты:

Было изучено связывание между Ph2 (SEQ ID NO:3) и ИЛ4rα и между Ph3 (SEQ ID NO:1) и ИЛ4rα. Результаты приведены на фигурах 8 и 11 соответственно.

Ссылки

Agnello D, Lankford CS, Bream J, Morinobu A, Gadina M, O'Shea JJ, Frucht DM. Cytokines and transcription factors that regulate Т helper cell differentiation: new players and new insights. J Clin Immunol. 2003, 23, 147-61.

Hage Т, Sebald W, Reinemer P. Crystal structure of the interleukin-4/receptor α chain complex reveal s a mosaic binding interface. Cell 1999, 97, 271-281.

He BP, Wen W, Strong MJ. Activated microglia (BV-2) facilitatation of TNF-α-mediated motor meuron death in vitro. J Immunol. 2002, 128, 31-38.

Izuhara K, Arima K, Yasunaga S. IL-4 and IL13: Their patological roles in allergic diseases and their potencial in developing new therapies. Curr Drug Targets-Inflam Allergy 2002, 1 263-269.

Leach MW, Mary Ellen Rybak ME,, Rosenblum IY. Safety Evaluation of Recombinant Human lnterleukin-4. Clin Immunol Immunopathol. 1997, 83, 12-14.

Martin R. Interleukin 4 treatment of psoriasis: are pleiotropic cytokines suitable therapies for autoimmune diseases? TRENDS Pharmacol Sci. 2003, 24, 613-616.

Martinez FO, Sica A, Mantovani A, Locati M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 2008, 13, 453-61.

Muller Т, Oehlenschlager F, Buehner M. Human interleukin-4 and variant R88Q: phasing X-ray diffraction data by molecular replacement using X-ray and nuclear magnetic resonance models. 1995, 247, 360-372.

Neiiendam J, Kohler L, Christensen C, Li S, Pedersen MV, Ditlevsen D, Kornum M, Kiselyov V, Berezin V, Bock E. An NCAM-derived FGF-receptor agonist, the FGL-peptide, induces neurite outgrowth and neuronal survival in primary rat neurons. J.Neurochem. 2004, 91, 920-935.

LaPorte SL, Juo ZS, Vaclavikova J, Coif LA, Qi X, Heller NM, Keegan AD, Garcia KC. Molecular and structural basis of cytokine receptor pleiotropy in the interleukin-4/13 system. Cell 2008, 132, 259-272.

Ronn LCB, Ralets I, Hartz B, Bech M, Berezin A, Berezin V, Moller A, Bock, E A simple procedure for quantification of neurite outgrowth based on stereological principles. J.Neurosci.Methods 2000, 100, 25-32.

Ryan LK, Colenbock DT, Wu J, Vermeulen MW, Characterization of proinflammatory cytokine production and CD14 expression by murine alveolar macrophage cell lines. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1997, 33, 647-653.

Soroka V, Kiryushko D, Novitskaya V, Ronn LC, Poulsen FM, Holm A, Bock E and Berezin V. Induction of neuronal differentiation by a peptide corresponding to the homophilic binding site of the second Ig module of NCAM. J. Biol. Chem. 2002, 277, 24676-24683.

Szegedi A, Aleksza M, Gonda A, Irinyi B, Sipka S, Hunyadi J, Antal-Szalmas P. Elevated rate of Thelper1 (T(H)1) lymphocytes and serum IFN-gamma levels in psoriatic patients. Immunol Lett. 2003, 86, 277-80.

Whitehead RP, Unger JM, Goodwin JW, Walker MJ, Thompson JA, Flaherty LE, Sondak VK. Phase II trial of recombinant human interleukin-4 in patients with disseminated malignant melanoma: a Southwest Oncology Group study. J Imminother. 1998, 21, 440-446.

Изобретение относится к биохимии. Описаны небольшие пептиды, являющиеся производными цитокина, интерлейкина-4 (ИЛ-4), способные связывать рецепторы ИЛ-4 и ингибировать активацию макрофагов и таким образом предотвращать начало воспалительного ответа. Кроме того, изобретение относится к применению указанных пептидов для изготовления лекарственного средства для лечения различных патологических состояний, при которых значительную роль играет ИЛ-4. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения различных патологических состояний, при которых значительную роль играет ИЛ-4. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 пр.

1. Применение пептида, состоящего из 8-25 последовательных аминокислотных остатков, где указанный пептид содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
AQFHRHKQLIRFLKRA (SEQ ID NO:1),
ARFLKRLDRNLWGG (SEQ ID NO:3),
LQEIKTLN (SEQ ID NO:5),
KRLQQNLFGG (SEQ ID NO:6) и
RNKQVIDSLAKFLKR (SEQ ID NO:19),
или его варианта или фрагмента, где указанный вариант включает консервативную аминокислотную замену в положениях 1, 2 или 3, и где указанный фрагмент имеет от 8 последовательных аминокислотных остатков в длину,
где указанный пептид или его вариант, или фрагмент способны уменьшать высвобождение макрофагами фактора некроза опухоли α (TNF-α) в ответ на стимуляцию липополисахаридами (ЛПС), для лечения воспалительных заболеваний или состояний.

2. Применение пептида, состоящего из 8-25 последовательных аминокислотных остатков, где указанный пептид содержит или состоит из по меньшей мере одной пептидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
AQFHRHKQLIRFLKRA (SEQ ID N0:1),
ARFLKRLDRNLWGG (SEQ ID NO:3),
LQEIKTLN (SEQ ID NO:5),
KRLQQNLFGG (SEQ ID NO:6) и
RNKQVIDSLAKFLKR (SEQ ID NO:19),
или ее варианта или фрагмента, где указанный вариант включает консервативную аминокислотную замену в положениях 1, 2 или 3, и где указанный фрагмент имеет минимальную длину 8 последовательных аминокислотных остатков,
где указанный пептид, или его вариант, или фрагмент способны уменьшать высвобождение фактора некроза опухоли α (TNF-α) в ответ на стимуляцию липополисахаридами (ЛПС),
для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний или состояний.

3. Применение по п.1 или применение по п.2, где указанный пептид содержит или состоит из AQFHRHKQLIRFLKRA (SEQ ID NO:1) или ее фрагмента или варианта, где указанный вариант имеет консервативную аминокислотную замену в положениях 1, 2 или 3, и указанный фрагмент имеет от 8 последовательных аминокислотных остатков в длину.

4. Применение по п.1 или применение по п.2, где указанный пептид содержит или состоит из RNKQVIDSLAKFLKR (SEQ ID NO:19) или ее фрагмента или варианта, где указанный вариант имеет консервативную аминокислотную замену в положениях 1, 2 или 3, и указанный фрагмент имеет от 8 последовательных аминокислотных остатков в длину.

5. Применение по п.1 или применение по п.2, где указанный пептид представлен в форме мономера.

6. Применение по п.1 или применение по п.2, где указанный пептид представлен в форме мультимера, содержащего две или более копии одного и того же пептида.

7. Применение по п.1 или применение по п.2, где указанный пептид способен активировать В-клетки и/или активировать рост и выживание Т-клеток и/или снижать количество С5а и С3а рецепторов в моноцитах и дендритных клетках и/или ингибировать активацию макрофагов.

8. Применение по п.1 или применение по п.2, где воспалительное заболевание или состояние представляет собой аутоиммунное заболевание или состояние.

9. Применение по п.1 или применение по п.2, где воспалительное заболевание или состояние представляет собой ревматоидный артрит.

10. Применение по п.1 или применение по п.2, где воспалительное заболевание или состояние представляет собой ишемическое заболевание сердца.

11. Применение по п.1 или применение по п.2, где воспалительное заболевание или состояние представляет собой болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона или воспалительное заболевание центральной нервной системы, такое как менингит, энцефалит и воспалительная и токсическая нефропатия.

12. Применение по п.1 или применение по п.2, где воспалительное заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из астмы, острого рассеянного энцефаломиелита (ОРЭМ), болезни Аддисона, бокового амиотрофического склероза (БАС), анкилозирующего спондилита, антифосфолипидного синдрома (АФС), аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного гепатита, аутоиммунной болезни внутреннего уха, буллезного пемфигоита, целиакии, болезни Чагеса, хронического обструктивного заболевания легких, дерматомиозита, сахарного диабета типа 1, эндометриоза, болезни Гудпасчера, болезни Гравеса, синдрома Гийена-Барре (СГБ), тиреоидита Хашимото, гнойного гидраденита, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, интерстициального цистита, красной волчанки, ограниченной склеродермии, рассеянного склероза, миастении гравис, нарколепсии, нейромиотонии, обыкновенной пузырчатки, злокачественной анемии, полимиозита, первичного билиарного цирроза, ревматоидного артрита, шизофрении, склеродермии, синдрома Съегрена, системной красной волчанки (СКВ), темпорального артериита, васкулита, витилиго, синдрома Вегенера, хронического воспаления, хронического простатита, гломерулонефрита, гиперчувствительности, воспалительных заболеваний кишечника, воспалительных заболеваний тазовых органов, реперфузионного повреждения, отторжения трансплантата, васкулита, остеоартрита, тендовагинита и артрита.

13. Применение по п.1 или применение по п.2, где указанный пептид служит для подкожного, внутривенного, орального, назального, пульмонального, местного, парентерального и/или интраартикулярного введения.

14. Изолированный пептид, состоящий из любой из последовательностей
AQFHRHKQLIRFLKRA (SEQ ID NO:1),
ARFLKRLDRNLWGG (SEQ ID NO:3),
LQEIKTLN (SEQ ID NO:5),
KRLQQNLFGG (SEQ ID NO:6),
RNKQVIDSLAKFLKR (SEQ ID NO:19),
или его фрагмента, или варианта, где указанный вариант включает консервативную аминокислотную замену в положениях 1, 2 или 3, и где указанный фрагмент имеет от 8 последовательных аминокислотных остатков в длину, при условии, что фрагмент SEQ ID NO:1 имеет от 10 последовательных аминокислотных остатков в длину,
где указанный пептид, или его вариант, или фрагмент способны уменьшать высвобождение макрофагами фактора некроза опухоли α (TNF-α) в ответ на стимуляцию липополисахаридами (ЛПС).

15. Пептид по п.14, представленный в форме мономера.

16. Пептид по п.14, представленный в форме мультимера, содержащего две или более копии одного и того же пептида.

17. Применение пептида, выбранного из группы:
ARFLKRLDRNLWGG (SEQ ID NO:3),
LQEIKTLN (SEQ ID NO:5),
KRLQQNLFGG (SEQ ID NO:6),
RNKQVIDSLAKFLKR (SEQ ID NO:19),
для получения антитела.

18. Применение по п.17, где указанное антитело способно модулировать биологическую активность, опосредованную ИЛ-4.