ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA FICARIA B 3n ГКМ ВИЗР N 101 ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 C12N1/26 C12R1/425 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов, и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, см. патент РФ N 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ N 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г., применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде. Однако эти штаммы недостаточно эффективны.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются штаммы Pseudomonas putida ПИК₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИК_y-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при температуре Т = 10^oC - 40^oC, см. патент РФ N 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.

Недостатком данных штаммов является относительно низкая нефтеокисляющая активность при пониженной температуре окружающей среды.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой нефтеокисляющей активностью в широком диапазоне температур, в т.ч. при низкой температуре.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий ч. Serratia ficaria В 3n, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температуры окружающей среды (от 3 до 45^oC), в т.ч. при низкой температуре.

Штамм бактерий Serratia ficaria В 3n депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 101 от 12.03.99 г. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1980 г.).

Штамм бактерий Serratia ficaria В 3n выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы, в поселке Кишкенай (Литовская республика) на территории Клайпедского филиала АО "ТОГ". Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов.

Штамм отселектирован и стабилизирован по признаку углеводородокисляющей активности в отношении нефти и нефтепродуктов.

Культурально-морфологические признаки штамма.

В мазках 24-часовых колоний, выросших на МПА, обнаруживаются подвижные палочковидные клетки с перитрихиальным жгутикованием размером (0,7 - 0,8) х 2,0 х 3,0) мкм. Клетки расположены одиночно или образуют короткие цепочки. Споры не образуют. На МПА культура образует прозрачные желтовато-кремовые блестящие колонии с ровным краем, хорошо снимающиеся с поверхности агара.

Штамм растет и размножается в диапазоне температуры от (2-5)^oC до (40-42)^oC, оптимальная температура роста и размножения - (26-35)^oC; pH среды: минимальный - 4, максимальный - 8,5, оптимальный - 6-7,5. Хранят штамм в лиофилизированном состоянии или на косяках МПА при (2-5)^oC.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Штамм факультативный аэроб, с дыхательным и ферментативным типом метаболизма. Грамм-отрицательный (по щелочи), в факторах роста не нуждается. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный, флюоресцирующий пигмент не образует. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Штамм обладает нитратредуцирующей способностью, сероводород и индол не образует, уреазу не разрушает. Оргинин декарбоксилаза, аргинин дигидролаза, лизин декарбоксилаза отсутствуют. Триптофандеаминаза отсутствует. Гидролизует желатину, ферментирует глюкозу, маннозу, инозитол, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин, арабинозу.

Для выращивания штамма и получения биопрепарата использовали посевную и ферментационную среду следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄ • 7Н₂O - 0,5 г/л
FeCl₃ • 6Н₂O - 0,05 г/л
CaCl₂ • 2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода - до 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V = 100 л при Т = 28^oC, pH = 6,8 - 7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть. Затем глубинную культуру микроорганизма (10%) вносили в стерильный торф одновременно с минеральными добавками и проводили доращивание при Т = 3^oC в течение 120 часов.

В качестве минеральных добавок использовали:
карбамид - 0,6 мас.%;
двойной суперфосфат - 0,3 мас.%;
сульфат калия - 1,5 мас.%
Титр полученного биопрепарата -1 • 10¹² КОЕ/г.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2 по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах почвы.

Пример 1.

Биопрепарат на основе штамма бактерий Serratia ficaria В 3n вносили в стеклянные сосуды, наполненные почвой с pH от 4,5 до 8,0 с содержанием мазута 45,0 - 48,2 г/кг. Количество внесенного биопрепарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3 до 45^oC в течение 90 суток. Содержание мазута в почве контролировали 1 раз в 45 дней, опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2.

Во втором примере биопрепарат на основе штамма бактерий Serratia ficfria В 3n был внесен в стеклянные сосуды, наполненные почвой с содержанием минерального масла 44,5 - 46,2 г/кг (pH колебалось от 4,5 до 8,2). Количество внесенного биопрепарата - 1 г на 1 кг почвы. Содержание мазута контролировали один раз в 30 дней. Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 2.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность препарата на основе заявленного штамма (до 97%), в том числе и при низкой температуре (до 92% при 3^oC). При этом штамм эффективен в широком диапазоне pH (pH = 4,5 - 8,0).

Штамм бактерий Serratia ficaria В 3n может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Изобретение относится к биотехнологии, очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Штамм бактерий Serratia ficaria В 3n выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы, депонирован под номером 101. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, мелассу, при 28^oС в течение 72 ч в аэробных условиях. Глубинную культуру микроорганизма (10%) вносят в стерильный торф с минеральными добавками и доращивают при 3^oС в течение 120 ч. Деструктивная активность препарата на основе данного штамма против углеводородов нефти и нефтепродуктов при рабочей концентрации 0,1% составила от 87 до 97% в широком диапазоне температур (3 - 45^oС), в том числе от 87 до 92% при низкой температуре (3^oС), в широком диапазоне рН (рН 4,5 - 8,0). 2 табл.

Штамм бактерий Serratia ficaria B 3n ГКМ ВИЗР 101 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов.