N-КАРБ(АРГИНИЛ)ОКСИМЕТИЛИМИДАЗО[4,5-е]БЕНЗО[1,2-с;3,4-с']ДИФУРОКСАН, ИНГИБИРУЮЩИЙ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2015 года по МПК C07D498/14 A61K31/4245 A61P7/02 

Описание патента на изобретение RU2549355C1

Изобретение относится к фармации, в частности к синтезу фармакологически активных соединений.

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти населения в России. Наиболее часто в основе сердечно-сосудистых заболеваний лежит атеротромбоз - процесс патологического тромбообразования, ведущий к инфаркту миокарда и инсульту. Поэтому разработка новых классов лекарственных препаратов с антиагрегационной активностью является актуальной.

К антиагрегантам относятся препараты различного механизма действия, принадлежащие к разным группам химических соединений.

Известно, что в результате взаимодействия оксида азота (NO) с тромбоцитами и лейкоцитами снижается их агрегация и адгезия на стенках кровеносных сосудов, что приводит к ингибированию процессов тромбообразования. Нарушения, связанные с нормальным протеканием вышеуказанных реакций, лежат в основе патофизиологических процессов, характерных для развития различных заболеваний сердечно-сосудистой системы. При таких заболеваниях наблюдаются множественные нарушения синтеза эндогенного NO, его рецепции растворимой формой гуанилатциклазы (рГД), а также регуляции уровня циклических нуклеотидов и ионов кальция [Dessy С., Ferron О. Pathophysiological Roles of Nitric Oxide: In the Heart and the Coronary Vasculature. Current Medical Chemistry - Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry. 2004. Vol.3. P.207-216].

К настоящему времени доказано образование оксида азота в результате биотрансформации нитроглицерина и других нитратов, которые используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в качестве антиишемических и антиангинальных препаратов. Однако их существенным недостатком является возникновение толерантности и других побочных эффектов при длительном применении [Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарственных средств: монография. - М.: Вузовская книга. 2004, 360 с.].

В связи с этим проводится поиск новых соединений, способных образовывать NO в живом организме неэнзиматическим путем. Данный подход рассматривается как актуальное и перспективное направление создания новых, более эффективных в сравнении с известными ранее антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов, обладающих антиангинальной и антиишемической активностью.

Один из классов химических соединений, производные которого являются донорами оксида азота, - фуроксаны. Фуроксаны рассматриваются как пролекарства, реализующие свою биологическую активность через рГЦ-цГМФ-путь [Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарственных средств: монография. - М.: Вузовская книга. 2004, 360 с.; Граник В.Г., Каминка М.Э., Григорьев М.Б., Северина И.С., Калинкина М.А., Макаров В.А., Левина В.И. Фуроксанопиримидины как экзогенные доноры оксида азота // Хим. Фарм. Журнал. 2002, Том 36, №10, стр.7-11].

В патенте US №2012/021007 2012 г. был проведен скрининг фуроксанов, однако их антиагрегационная активность не исследовалась.

В патентах RU 2123046 1998 г. и RU 2139932 1998 г. описаны фуроксаны как доноры оксида азота и активаторы рГЦ, но данные по их антиагрегационной активности не представлены.

В патенте US №7838023 2010 г. упоминается, что биологически активные производные фуроксана обладают антиагрегационной активностью, однако никаких данных по исследованиям не приведено.

Задачей настоящего изобретения является создание новых эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов.

Поставленная задача решается N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксаном, ингибирующим агрегацию тромбоцитов.

Синтез целевого соединения

Синтез N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана был выполнен на твердой фазе в условиях автоматического пептидного синтезатора ABI 433А PeptideSynthesizer (AppliedBiosystems, США), используя FastMoc 0.25-стратегию. Стратегия FastMoc 0.25 подразумевает последовательное присоединение остатков аминокислот к нерастворимой полимерной подложке. Базовая лабильная группа Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил - используется для защиты N-групп каждого аминокислотного остатка. Остатки, которые имеют потенциально реактивные боковые цепи, защищены кислотонеустойчивыми группами.

После удаления группы Fmoc пиперидином следующая защищенная аминокислота добавляется, используя или реактив сцепления, или предварительно активированное производное аминокислоты.

В качестве активатора первой аминокислоты в Fmoc-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступает дициклогексилкарбодиимид (DCC). Реакция протекает в присутствии 4-диметиламинопиридина (DCC/DMAP), который играет роль катализатора процесса.

В качестве активатора второй и последующих аминокислот в Fmoc-стратегии выступает 1-гидроксибензотриазол в дициклогексилкарбодиимиде (HOBt/DCC). Реакция протекает с образованием активированной аминокислоты и N,N′-дициклогексилмочевины (DCU).

Все вышеперечисленные операции протекают в пептидном синтезаторе.

Для снятия пептида со смолы в вытяжном шкафу в полипропиленовой пробирке готовили смесь со следующим соотношением компонентов: TAN - 2.5%, TIPS - 2.5%, EDT - 5%, TFA - 90%. Приготовленную смесь помещали на лед до остывания на 20-30 мин. Затем в холодную смесь для снятия пептида помещали пептид-смолу и перемешивали. Помещали пробирку с пептид-смолой в полипропиленовую пробирку, закрывали и выдерживали на качалке в течение 4 часов.

Экстракция пептида со смолы проводилась на стеклянном фильтре-воронке в вытяжном шкафу. Воронка предварительно ополаскивалась дважды МТВЕ (метилтретбутиловый эфир). По окончании снятия сливали смесь со смолой и пептидом на фильтр Шотта. Промывали пробирку, в которой шла реакция TFA, смыв сливали на фильтр. Фильтровали при небольшом вакууме до осушения смолы. Добавляли холодный МТВЕ, тщательно промывали смолу и фильтровали до осушения. Промывали пробирку, в которой находилась пептид-смола, трижды холодным МТВЕ и добавляли смыв к основному сливу. Тщательно перемешивали взвесь, оставляли не менее, чем на 1 час при -20°C. Осадок отфильтровывали, сушили.

Очистку пептида осуществляли с помощью высокоэффективного препаративного жидкостного хроматографа PuriFlash 450 (InterChim).

Условия ВЭЖХ: картридж Interchim PF-C18(20g), 15 мкм. Могут использоваться другие обращенные картриджи C18 или C8.

a. Детекторная ячейка: препаративная

b. Скорость потока - 20.0 мл/мин

c. Длина волны: диапазон 200 - 400 нм

d. Диапазон детектирования: 2 AUFS

e. Величина петли: 2 мл (объем инжекции 1.5-1.8 мл образца)

f. Элюент A: 5.0% ацетонитрила, 0.1% трифторуксусной кислоты в воде

g. Элюент B: 0.1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле

h. Градиент: 10-90% B в течение 12 мин

Строение синтезированного соединения подтверждено методами ЯМР 1H и хромато-масс-спектроскопии. Спектры ЯМР 1H регистрировали на приборе Bruker Avance 600 mhz; химические сдвиги измеряли относительно сигнала растворителя (ДМСО-d6, δH 2.5 м.д.).

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Waters MSD SQD - ESI с УФ- и масс-спектрометрическими детекторами: длина волны 220 нм, температура пробоотборника 15°C, температура термостата колонок 40°C. MSD - параметры: температура источника 130°C, температура газа 400°C, напряжение на капилляре 3kV; колонка Waters Acquity 1,7 µm 2.1·50 mm. Градиент от 5 до 100% B за 4 мин (A: 0.1% муравьиной кислоты в воде; B: 0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле).

Спектр ЯМР 1H (δ, м.д.) 1,52 (м, 2H, C(22)H2); 1,74 (м, 2H, C(21)H2); 3,10 (м, 2H, C(23)H2); 4,28 (м, 1H, C(20)H); 5,31 (с, 2H, C(16)H2); 7,23 (уш. д, 5H, N(19)H, N(24)H, N(26)H, N(29)H2); 8,89 (м, 1H, C(11)H); 9,02 (с, 1H, COOH).

Масс-спектр [MS (ES)] m/z 449.35 [M+H]+

Фармакологическое действие.

Оценку специфической активности антиагрегационного действия N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана проводили in vitro с использованием крови здоровых доноров. Взятие крови проводили непосредственно перед исследованием, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия (3.8%). Соотношение антикоагулянт:кровь соответствовало 1:9.

Антиагрегационная активность полученного соединения изучалась на богатой тромбоцитами плазме с использованием аденозиндифосфата (АДФ) в качестве индуктора агрегации тромбоцитов.

Дня приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь сразу после получения центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин для получения бестромбоцитарной плазмы. Все процедуры проводили в полистирольной посуде, обладающей тромборезистентными свойствами. В течение всего периода исследования богатая и бестромбоцитарная плазма находились при комнатной температуре, а запись агрегации тромбоцитов осуществляли при 37°C.

Для исследования специфической антиагрегационной активности N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана руководствовались требованиями к доклиническим исследованиям фармакологических веществ данного класса, утвержденными Фармакологической службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.

Агрегацию тромбоцитов изучали с использованием турбидиметрического метода Борна (Born, 1962), основанного на изменении пропускания света (540 нм) через исследуемую плазму при ее постоянном перемешивании (1000 об/мин). В качестве образца сравнения использовали бестромбоцитарную плазму. Светопропускание через бестромбоцитарную плазму принимали за 100%, а светопропускание через богатую тромбоцитами плазму принимали за 0%. Концентрацию тромбоцитов доводили в богатой тромбоцитами плазме до 2.5·10-8 клеток/мл с помощью разведения бедной тромбоцитами плазмой.

Для проведения исследования применяли двухканальный лазерный анализатор агрегации тромбоцитов/счетчик 230LA-2 (НПФ «Биола»). Объем пробы составлял 300 мкл. Время проведения измерения - 8 мин. В качестве индуктора использовали АДФ в концентрации 50 мкМ. Получаемые агрегограммы представляют собой зависимость степени агрегации от времени, прошедшего после добавления индуктора агрегации. Изучаемое соединение (в виде водного раствора, при необходимости, содержащего ДМСО до 0.2%) в разных концентрациях (0.1·10-6, 0.2·10-6, 0.3·10-6, 0.4·10-6, 0.5·10-6 М) добавляли в пробу до внесения индуктора агрегации (АДФ). Результаты исследований на крови здоровых доноров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследования специфической антиагрегационной активности N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана

Концентрация N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана, M % агрегации в присутствии N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана 0 48.1 0.1·10-6 39.2 0.2·10-6 30.5 0.3·10-6 20.4 0.4·10-6 14.7 0.5·10-6 10.1

При исследовании ингибирующего действия N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана на агрегацию тромбоцитов здоровых доноров был обнаружен эффект ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов. Зависимость агрегации тромбоцитов от концентрации соединения представлена на рис.1.

Соединение ингибировало АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с IC50 0.25 мкМ, что демонстрирует выраженный антиагрегационный эффект. Проявленная соединением антиагрегационная активность выше антиагрегационной активности аналогичного соединения, описанного в патенте RU 2502739 2012 г. (IC50 0.41 мкМ).

Похожие патенты RU2549355C1

название год авторы номер документа
N-КАРБ(ГЛУТАМИНИЛ)ОКСИМЕТИЛИМИДАЗО[4,5-Е]БЕНЗО[1,2-С;3,4-С']ДИФУРОКСАН, ИНГИБИРУЮЩИЙ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ 2012
  • Алексеев Алексей Анатольевич
  • Брылев Максим Игоревич
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Лоторев Дмитрий Сергеевич
  • Батуев Евгений Андреевич
  • Павлова Людмила Анатольевна
  • Белушкина Наталья Николаевна
RU2502739C9
ГЕТЕРОМЕРНЫЕ ПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ ИМИДАЗО[4,5-е]БЕНЗО[1,2-с;3,4-с']ДИФУРОКСАНА, ИНГИБИРУЮЩИЕ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ 2014
  • Алексеев Алексей Анатольевич
  • Брылев Максим Игоревич
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Лоторев Дмитрий Сергеевич
  • Лизунов Антон Юрьевич
  • Павлова Людмила Анатольевна
  • Белушкина Наталья Николаевна
RU2550223C1
N-КАРБОКСИМЕТИЛИМИДАЗО[4,5-е]БЕНЗО[1,2-с;3,4-с']ДИФУРОКСАН 2014
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Топоров Владислав Владимирович
  • Даниленко Виталий Михайлович
  • Ившин Виктор Павлович
  • Алексеев Алексей Анатольевич
  • Павлова Людмила Анатольевна
RU2544547C1
Способ получения N-карбэтоксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксана 2017
  • Лоторев Дмитрий Сергеевич
  • Брылев Максим Игоревич
  • Алексеев Алексей Анатольевич
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Меркулова Наталья Леонидовна
  • Кудрявцева Татьяна Николаевна
RU2663846C1
Способ получения N-карбэтоксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана 2016
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Топоров Владислав Владимирович
  • Даниленко Виталий Михайлович
  • Ившин Виктор Павлович
  • Лоторев Дмитрий Сергеевич
  • Павлова Людмила Анатольевна
RU2618230C1
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИАГРЕГАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 2019
  • Пятигорская Наталья Валерьевна
  • Бркич Галина Эдуардовна
  • Береговых Валерий Васильевич
  • Аладышева Жанна Игоревна
  • Малин Сергей Александрович
  • Веретенников Евгений Александрович
  • Безчинский Ярослав Этальевич
  • Сальникова Татьяна Сергеевна
  • Свистунов Андрей Алексеевич
RU2709017C1
RGD-ПОДОБНЫЕ ПЕПТИДЫ 2009
  • Белушкина Наталья Николаевна
  • Ковтун Анатолий Леонидович
  • Косенко Сергей Иванович
  • Махлай Александр Александрович
  • Павлова Людмила Анатольевна
  • Кислова Юлия Владимировна
  • Ульянов Андрей Михайлович
  • Кулыгина Ирина Владимировна
  • Игнатова Анастасия Игоревна
RU2396271C1
Способ получения N-аллилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c']дифуроксана 2019
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Меркулова Наталья Леонидовна
  • Лоторев Дмитрий Сергеевич
  • Кузнецов Павел Евгеньевич
  • Максимов Владимир Алексеевич
  • Кудрявцева Татьяна Николаевна
RU2718905C1
Способ получения N-цианметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c']дифуроксана 2019
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Меркулова Наталья Леонидовна
  • Лоторев Дмитрий Сергеевич
  • Пивина Татьяна Степановна
  • Кузнецов Павел Евгеньевич
  • Максимов Владимир Алексеевич
  • Кудрявцева Татьяна Николаевна
RU2707296C1
Способ получения N-карбэтоксиметил-С-метилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c']дифуроксана 2020
  • Королев Вячеслав Леонидович
  • Меркулова Наталья Леонидовна
  • Лоторев Дмитрий Сергеевич
  • Кузнецов Павел Евгеньевич
  • Максимов Владимир Алексеевич
  • Кудрявцева Татьяна Николаевна
RU2725631C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 549 355 C1

Реферат патента 2015 года N-КАРБ(АРГИНИЛ)ОКСИМЕТИЛИМИДАЗО[4,5-е]БЕНЗО[1,2-с;3,4-с']ДИФУРОКСАН, ИНГИБИРУЮЩИЙ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ

Изобретение относится к N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксану формулы

Технический результат - N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксан, ингибирующий агрегацию тромбоцитов. 1 ил., 1 табл.

Формула изобретения RU 2 549 355 C1

N-карб(аргинил)оксиметилимидазо[4,5-e]бензо[1,2-c;3,4-c′]дифуроксан формулы

ингибирующий агрегацию тромбоцитов.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2549355C1

RU 2002134671 A, 27.06.2004
ДОНОР ОКСИДА АЗОТА И АКТИВАТОР РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ 1998
  • Пирогов С.В.
  • Хропов Ю.В.
  • Коц А.Я.
  • Украинцев К.Э.
  • Графов М.А.
  • Давыдова М.П.
  • Мельникова С.Ф.
  • Медведева Н.А.
  • Целинский И.В.
  • Буларгина Т.В.
RU2139932C1
US 7838023 B2, 23.11.2010
Колосоуборка 1923
  • Беляков И.Д.
SU2009A1

RU 2 549 355 C1

Авторы

Алексеев Алексей Анатольевич

Брылев Максим Игоревич

Королев Вячеслав Леонидович

Лоторев Дмитрий Сергеевич

Батуев Евгений Андреевич

Павлова Людмила Анатольевна

Белушкина Наталья Николаевна

Даты

2015-04-27Публикация

2014-02-17Подача