RGD-ПОДОБНЫЕ ПЕПТИДЫ Российский патент 2010 года по МПК C07K5/23 C07K5/11 C07K7/06 A61K38/07 A61K38/08 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине, в частности к синтезу фармакологически активных соединений.

Проблема профилактики и лечения тромбоэмболических осложнений продолжает оставаться актуальной для современной медицины. В течение последнего десятилетия была установлена ключевая роль тромбоцитов в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Выяснение столь важного значения тромбоцитов стимулировало разработку большого количества лекарственных препаратов. Антитромбоцитарные средства уже давно являются неотъемлемой частью лечения больных инфарктом миокарда (ИМ), сердечной недостаточности, ишемической болезни сердца (ИБС).

Вопросы профилактики и лечения данных заболеваний сохраняют свою актуальность, поскольку они остаются основной причиной смерти как мужского, так и женского населения развитых и развивающихся стран. Эти вопросы имеют первостепенное значение для отечественного здравоохранения, так как в отличие от США и большинства европейских государств в России не удалось добиться снижения заболеваемости ИБС, ИМ за последние два десятилетия. Для каждого врача давно стало аксиомой, что ключом к решению данной проблемы является борьба с факторами риска возникновения болезни, среди которых основное значение имеет атеротромбоз.

Атеротромбоз - тромбообразование на поверхности поврежденной атеросклеротической бляшки, является основным патогенетическим механизмом ее роста и причиной развития осложнений атеросклероза. Тромботические осложнения атеросклероза, прежде всего инфаркт миокарда (ИМ) и инсульт, занимают ведущее место в структуре общей смертности в большинстве развитых стран. В России ситуация выглядит особенно неблагоприятной: на долю сердечно-сосудистых заболеваний приходится большинство случаев смерти - 55,4%, при этом атеротромбоз является причиной смертности в 30% случаев.

Антитромботическая терапия признана основой патогенетического лечения как острых, так и хронических форм ИБС. Основными направлениями антитромботической терапии являются: ингибирование функции тромбоцитов, воздействие на систему гемокоагуляции, восстановление проходимости сосуда при его тромботической окклюзии (тромболизис).

Учитывая распространенность и прогрессирующее увеличение патологий системы кровообращения в мире, а также сравнительно высокий процент смертности больных, разработка принципиально новых антитромботических препаратов является особо актуальным вопросом.

Наибольшее внимание специалистов в последнее время привлечено к антиагрегантам, блокирующим агрегацию тромбоцитов и эритроцитов. К антиагрегантам относятся препараты различного механизма действия и принадлежащие к разным группам химических соединений.

Пептиды, принадлежащие к классу RGD (Arg-Gly-Asp)-стимуляторов, являются мощными ингибиторами агрегации тромбоцитов. Антиагрегантное действие RGD-пептидов обусловлено их способностью предупреждать связывание фибриногена, фактора Виллебранда и других адгезивных лигандов с гликопротеиновыми llb/llla рецепторами тромбоцитов.

В патенте US №5,292,756; Granted: March 8, 1994 был проведен скрининг природных белков, обладающих антиагрегантной активностью, получены синтетические пептиды аналогичного действия, проведены их идентификация и анализ. Разработаны инъекционные лекарственные формы синтетических пептидов антитромбического действия.

Вместе с тем, анализируя данные, следует отметить, что полученные лекарственные формы не обладают удовлетворительной стабильностью, что, возможно, связано с наличием примесей, неизбежно присутствующих в препаратах, полученных в лабораторном синтезе.

В патенте RU 2119354, А61К 47/48, 1998 описан направленный транспорт лекарств, который заключается в связывании in vivo молекул-носителей фармакоактивных соединений с форменными элементами крови, принимающими участие в патологическом процессе. Для связывания синтезированы оригинальные производные фармакологических агентов и пептида, содержащего RGD (карбоксиметил-5-фторурацил-ацетамидометил-цистеинил-аргинил-глицил-аспартил-ацетамидометил-цистеин и ацетиларгинилглицил-аспартил-S-нитрозоцистенин).

Следует отметить, что в вышеописанном патенте аминокислотный состав пептида отличается от предложенного и не рассматривается антитромбическое действие. Синтезированный пептид используется лишь как носитель фармакоактивных соединений к местам повышенной адгезии тромбоцитов.

Гетеродимер GPIIb/IIIa (другое название - интегрин α_IIb/β₃) является поверхностным рецептором тромбоцитов. В процессе Са²⁺-зависимой активации комплекс претерпевает ряд конформационных изменений, которые обеспечивают возможность связывания тромбоцита с фибриногеном.

Механизм функционирования IIb/IIIa-рецептора заключается в его способности узнавать две характерные аминокислотные последовательности. Первая состоит из аминокислот Arg-Gly-Asp, она обнаружена в фибронектине, факторе Виллебранда, витронектине, а также и в α-цепях молекул фибриногена, причем на каждую половину молекулы фибриногена приходится по две ключевых последовательности Arg-Gly-Asp. Следует подчеркнуть, что «ключевая» последовательность Arg-Gly-Asp узнаваема большинством представителей семейства интегринов. Детальные механизмы взаимодействия IIb/IIIа рецепторов с адгезивными молекулами до конца не изучены, но очевидно, что пептиды или мелкие молекулы, содержащие ключевую последовательность аминокислот Arg-Gly-Asp, могут являться потенциальными ингибиторами взаимодействия IIb/IIIa рецепторов тромбоцитов с фибриногеном.

GPIIb состоит из находящейся на поверхности тромбоцита тяжелой цепи с массой 116 кД, ковалентно связанной одной дисульфидной связью с легкой (22 кД) цепью, которая является трансмембранным белком. GPIIIa-субъединица - гликозилированный полипептид с массой 90 кД, который состоит из трех доменов - большого внеклеточного региона на N-конце, трансмембранного домена и короткого цитоплазматического сегмента на С-конце.

Блокаторы IIb/IIIa-рецепторов тромбоцитов являются самой молодой группой из всего класса антитромбических препаратов, используемых в кардиологии. Механизм действия средств этой группы заключается в торможении общего конечного этапа агрегации тромбоцитов - процесса построения тромба посредством образования мостиков между соседними активированными тромбоцитами из молекул фибриногена. Активация тромбоцитов различными веществами (АДФ, тромбин, тромбоксан А2, коллаген) приводит к изменению формы (активации) тромбоцитов и активации GP IIb/IIIa. В результате активации тромбоцитов конфигурация IIb/IIIa-рецепторов изменяется, что повышает их способность к фиксации фибриногена и других адгезивных белков. Связывание молекул фибриногена с IIb/IIIa рецепторами различных тромбоцитов приводит к соединению пластинок друг с другом - агрегации. Этот процесс не зависит от типа активатора и является конечным и единственным механизмом агрегации тромбоцитов. Ингибиторы рецептора GPIIb/IIIa также связываются с GPIIb/IIIa, блокируя связывание с фибриногеном, и таким образом предотвращают агрегацию тромбоцитов.

Задачей является создание новых пептидов.

Поставленная задача решается пептидами:

Lys-β-Ala-Asp-Trp

Arg-Aminovaleric acid-Asp-Trp

Lys-Gly-Gly-Asp-Trp

Arg-Gly-Gly-Asp-Trp

Arg-β-Ala-Asp-Trp

Основываясь на ранее полученных данных [Pollina E. Design and sinthesis of RGD mimetics as potent inhibitors of platelet aggregation // J. Undergrad. Sci. - 1996. - 3: 119-126; Ojima I., Chakravarty S., Dong Q. Antithrombotic agents: from RGD to peptide mimetics // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 1995. - Vol.4. - P. 337-360; Мельник О.В., Мартинович В.П., Голубович В.П. Связь структуры и антиагрегационной активности в ряду аналогов Arg-Gly-Asp // Биоорганическая химия. 2006, том 32, №2, стр.137-143], можно предположить, что в качестве промежуточного участка предпочтительно использовать β-аланин, валериановую кислоту или комбинацию глицин-глицин. Такие фрагменты молекулы позволят получить желаемую конформацию и повысить биологическую активность молекулы пептида. В качестве гидрофобного участка, вероятно, следует использовать триптофан. Именно для веществ с такой гидрофобной группой получены наилучшие результаты [Pollina E. Design and sinthesis of RGD mimetics as potent inhibitors of platelet aggregation // J. Undergrad. Sci. - 1996. - 3: 119-126]. Участки, представленные аргинином и аспарагиновой кислотой, имеет смысл оставить в неизменном виде.

Синтез пептидов был выполнен на твердой фазе с использованием пептидного синтезатора Applied Biosystems 433A, используя Fmoc-стратегию. Она основана на последовательном присоединении остатков аминокислот к нерастворимой полимерной подложке. Базовая лабильная группа Fmoc используется для защиты N-групп каждого аминокислотного остатка. Те остатки, которые имеют потенциально реактивные боковые цепи, защищены кислотонеустойчивыми группами, типа третбутила.

После удаления группы Fmoc пиперидином, следующая защищенная аминокислота добавляется, используя или реактив сцепления или предварительно активированную производную аминокислоты.

В качестве активатора первой аминокислоты в Fmoc-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступает дициклогексилкарбодиимид

В качестве активатора первой аминокислоты в Fmoc-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступает дициклогексилкарбодиимид (DCC). Реакция протекает в присутствие 4-диметиламинопиридина (DCC/DMAP), который играет роль катализатора процесса. В результате образуется активированная аминокислота.

В качестве активатора второй и последующих аминокислот в Fmoc-стратегии выступает 1-гидроксибензотриазол в дициклогексилкарбодиимиде (HOBt/DCC). Реакция протекает согласно с образованием активированной аминокислоты и N,N'-дициклогексилмочевины (DCU).

Все вышеперечисленные операции протекают в пептидном синтезаторе.

Для снятия пептида со смолы в вытяжном шкафу в полипропиленовой пробирке готовили смесь со следующим соотношением компонентов: TAN - 2,5%, TIPS - 2,5%, EDT - 5%, TFA - 90%. Приготовленную смесь помещали на лед до остывания на 20-30 мин. Затем в холодную смесь для снятия пептида помещали пептид-смолу и мягко перемешивали. Помещали пробирку с пептид-смолой в полипропиленовую пробирку, закрывали и выдерживали на качалке в течение 4 часов.

Экстракция пептида со смолы проводилась на стеклянной фильтре-воронке в вытяжном шкафу. Воронка предварительно ополаскивалась дважды МТВЕ (метилтретбутиловый эфир). По окончанию снятия сливали смесь со смолой и пептидом на фильтр Шотта. Промывали пробирку, в которой шла реакция TFA, смыв сливали на фильтр. Фильтровали при небольшом вакууме до осушения смолы. Добавляли холодный МТВЕ, тщательно промывали смолу и фильтровали до осушения. Промывали пробирку, в которой находилась пептид-смола, трижды холодным МТВЕ и добавляли смыв к основному сливу. Тщательно перемешивали взвесь. Оставляли смесь приблизительно на 2 минуты. Затем отбирали 100 (дл полученного раствора для анализа. (Температура хранения 4°С до проведения анализа). Оставшуюся смесь оставляли не менее чем на 1 час при -20°С. Центрифугировали смесь при 1500 g 6 мин, отделяли супернатант. К осадку добавляли МТВЕ, растирали шпателем и замораживали на 2 часа. Операцию замораживания - оттаивания повторяли дважды.

Сублимационную сушку пептида осуществляли из 0,01 М фосфатно-солевой буфера после растворения полученного после экстракции осадка.

Очистку проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Условия ВЭЖХ: колонка Waters DeltaPak, C18, 5 мкм, 100 Å, 3,9×150 мм. Могут использоваться другие обращенофазные колонки C18 или С8.

а. Детекторная ячейка: аналитическая

b. Скорость потока - 1.0 мл/мин

с. Длина волны: 214 нм

d. Диапазон детектирования: 0,5 AUFS

е. Величина петли: 100 мкм (петля заполняется 150 [±10] мл образца, то есть, объем впрыска = 100 мл)

f. Элюент А: 5.0% ацетонитрила, 0.1% трифторуксусной кислоты, в воде.

g. Элюент В: 60% ацетонитрила, 0.085% трифторуксусной кислоты, в воде.

h. Градиент: 0-60% В в течение 60 мин.

Для подтверждения структуры полученных пептидов применялся ядерно-магнитный резонанс (ЯМР). Проводилась одномерная ЯМР-спектроскопия по протонам (¹Н) и углероду (¹³С). Для проведения ¹H и ¹³С ЯМР навеску пептида растворяли в DMSO-d6 с изотопной чистотой 99,9% D. Спектр ЯМР ¹Н получали на спектрометре «Evans-300» с резонансной частотой 300 МГц. Концентрационные измерения протонных химических сдвигов выполняли при температуре 296.6 К. Все ЯМР измерения выполняли в условиях быстрого обмена взаимодействующих молекул во временном масштабе ЯМР. Химический сдвиг определяли относительно внутреннего стандарта тетраметилсилана (TMS). Полученная картина химических сдвигов и интенсивностей сигналов подтверждают состав веществ.

Оценку специфической активности антиагрегационного действия пептидов проводили in vitro с использованием крови здоровых доноров и больных с гиперагрегацией тромбоцитов. Взятие крови проводили непосредственно перед исследованием, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия (3,8%). Соотношение антикоагулянт: кровь соответствует 1:9. Антиагрегационная активность полученных соединений изучалась на богатой тромбоцитами плазме с использованием ADP в качестве индуктора агрегации тромбоцитов.

Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь сразу после получения центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток центрифугировали в течение 20 мин. При 3000 об/мин для получения безтромбоцитарной плазмы. Все процедуры проводили в полистерольной посуде, обладающей тромборизестентными свойствами. В течение всего периода исследования богатая и бестромбоцитарная плазма находились при комнатной температуре, а запись агрегации тромбоцитов осуществляли при 37°С.

Для исследования специфической антиагрегационной активности пептида руководствовались требованиями к доклиническим исследованиям фармакологических веществ данного класса, утвержденными Фармакологической службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.

Исследование агрегации проводили по методу G.G.V.Bom. Исследование проводили на приборе LA230-2 («Биола», Россия). Объем кюветы - 200 мкл. В качестве индуктора использовали АДФ в концентрации 10^-7М. Количество тромбоцитов фиксировалось прибором. Пептид исследовали в концентрации 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6 М и добавляли непосредственно перед добавлением АДФ. В качестве стандарта использовали раствор «Eptifibatide» в таких же концентрациях. Результаты представлены в табл.2.

При исследовании ингибирующего действия на агрегацию тромбоцитов здоровых доноров был обнаружен доза-зависимый эффект ингибирования агрегации тромбоцитов для всех шести соединений, однако наиболее активным ингибитором оказался пентапептид Arg-Gly-Gly-Asp-Trp.Это соединение ингибировало ADP - индуцированную агрегацию тромбоцитов с IC₅₀ 6,3 мкМ (табл.1).

При изучении действия пептида на тромбоциты больных с гиперагрегацией было обнаружено появление фазы дезагрегации, которая отсутствует в контрольной группе, что свидетельствует о прекращающемся агрегационном действии АДФ. Таким образом, было обнаружено ингибирование агрегации под действием пептида обеих групп крови, что демонстрирует выраженный антиагрегационный эффект.

Табл. 1 Влияние RGD-пептидов на ингибирование ADP -индуцированной агрегации тромбоцитов in vitro Соединение IC₅₀, мкМ (ADP, 1,5 мкМ) Lys-β-Ala-Asp-Trp 590,0 Arg-Aminovaleric acid-Asp-Trp 19,8 Lys-Gly-Gly-Asp-Trp 238,4 Arg-Gly-Gly-Asp-Trp 6,3 Arg-β-Ala-Asp-Trp 14,3

Табл. 2 Исследование специфической антиагрегационной активности пептида Arg-Gly-Gly-Asp-Trp Концентрация пептида Агрегация тромбоцитов Пептид Arg-Gly-Gly-Asp-Trp Стандарт «Eptifibadide» % от контрольной % ингибирования % от контрольной % ингибирования 10^-6 М 69,8±5,0 30,2±2,5 87,4±6,9 12,6±1,1 10^-5 М 48,3±3,9 51,7±3,1 83,0±6,1 17,0±1,1 10^-4 М 30,1±2,2 69,9±4,9 81,2±7,1 18,8±1,3 10^-3 М 20,3±2,0 79,7±5,9 78,5±6,9 21,5±1,5

Предложены новые синтетические RGD- подобные пептиды, обладающие способностью к доза-зависимому ингибированию агрегации тромбоцитов. 2 табл.

RGD-пептиды, выбранные из группы:
Lys-β-Ala-Asp-Trp,
Arg-Aminovaleric acid-Asp-Trp,
Lys-Gly-Gly-Asp-Trp,
Arg-Gly-Gly-Asp-Trp,
Arg-β-Ala-Asp-Trp.