СПОСОБ ИНТРАОПЕРАЦИОННОЙ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕРВОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к реконструктивной микрохирургии, и предназначено для интраоперационной оценки состояния периферических нервов.

Оценка состояния периферических нервов, банкированных фрагментов нервов представляет значительный интерес для нейрохирурга, т.к. исход восстановительных и реконструктивных операций напрямую зависит от жизнеспособности подшиваемых нервов. Оценить, есть ли в нерве прорастание нервных волокон, сохранен ли в поврежденном нервном стволе обмен медиатора, есть ли аксональный ток, невозможно без применения специальных морфологических методов.

Известны электрофизиологические методы оценки проводимости по нерву: электростимуляция нерва, электромиография (Одинак М.М., Живолупов С.А. Заболевания и травмы периферической нервной системы (обобщение клинического и экспериментального опыта): руководство для врачей. - М.: СпецЛит, 2009, 384 с). Импульс, вызванный электростимуляцией нерва, направляется по двигательным, чувствительным и смешанным нервам, и характеристики проведения импульса оцениваются с помощью записи потенциалов с мышц, либо непосредственно с нерва. Если нерв поврежден и еще не произошло восстановления контакта с мишенями иннервации, то значение этих методов резко снижается. Кроме того, они не могут использоваться во время восстановительных и реконструктивных микрохирургических операций из-за сложности определения проекции тонких ветвей нервов.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) предлагаемого способа является метод Karnovsky M.J., Roots L. (Karnovsky M.J., Roots L., 1964 A ′′direct-coloring′′ Thiocholine method for cholinesterase, J. Histochem. Cytochem., 12, 219-22), который используется для выявления положительной активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в нервной ткани, определения системной принадлежности нервных проводников и изучения особенностей постсинаптической мембраны в нервно-мышечных синапсах соматических мышц (Николаев Г.М. Изменение активности ацетилхолинэстеразы в моторных окончаниях поперечнополосатой мускулатуры при гипоксической гипоксии / Г.М. Николаев // Архив патологии, - 1970. - №3, - с.61-65).

Фермент ацетилхолинэстераза образуется в соме нейрона и транспортируется по аксону к пресинаптическим нервным окончаниям или к нейромышечным синапсам (Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, пер. с англ., т.I, М., 1982, с.363-364). Позитивная реакция на АХЭ является признаком сохранения синтетических и транспортных процессов в соме нейрона и его отростках. Позитивная реакция может проявляться только в осевых цилиндрах проводников и не зависит напрямую от состояния миелиновых оболочек. Негативная реакция на АХЭ свидетельствует о том, что в данном фрагменте нерва еще нет прорастающих волокон.

Определение активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) по Карновскому-Рутс выполняется следующим образом: забирают материал, затем изготавливают замороженные срезы, фиксируют образцы в 10% формалине до суток, промывают в двух порциях натрий-малеатного буфера по 5 минут в каждой, инкубируют в специальной среде: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, ингибитор неспецифической холинэстеразы (1,0 мл 10-4 М изо-ОМФА) при температуре 4°С, рН 6,0-24 часа, промывают дистиллированной водой, заключают в бальзам, микроскопируют. Общая длительность реакции составляет 18-24 часа.

Этот метод является специфичным для выявления определенной фракции ацетилхолинэстеразы.

Недостатки этого метода следующие: сложность и длительность процедуры, вследствие чего невозможность использования его интраоперационно.

Целью предлагаемого способа является упрощение процедуры и сокращение времени определения состояния периферического нерва.

Поставленная цель достигается тем, что изменяется режим инкубации: время инкубации от 30 до 60 мин, и состав инкубационной среды: отсутствует ингибитор неспецифической холинэстеразы, рН среды составляет от 7,4 до 7,6, температура от 50 до 55°C.

Предлагаемый способ оценки состояния периферических нервов по активности АХЭ позволяет за короткий промежуток времени провести исследование их жизнеспособности, что дает возможность использовать его интраоперационно.

Новизна предлагаемого способа заключается в том, что значительно сокращается время инкубации, инкубационная среда имеет более простой состав: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, а ее рН составляет от 7,4 до 7,6; температура от 50 до 55°C.

Технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого нами способа, не выявлены, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: во время операции забирают фрагмент нерва, затем изготавливают криостатные срезы. Полученные срезы наклеивают на предметные стекла, промывают в двух порциях малеатного буфера, помещают в инкубационную среду следующего состава: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, при температуре от 50 до 55°C, рН 7,4-7,6. Время инкубации 30-60 минут. После инкубации проводят микроскопию срезов для выявления активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ). Если реакция на ацетилхолинэстеразу позитивна, нерв считается жизнеспособным; если негативна - нерв оценивается как нежизнеспособный. Срезы обезвоживают, заключают в бальзам, фотографируют для документирования.

Пример 1. Пациент Т. 27 лет, диагноз: частичный левосторонний паралич лицевого нерва. Во время операции для определения состояния ствола лицевого нерва был взят отрезок нерва длиной 0,3 см. Отрезок нерва доставили в лабораторию, приготовили криостатные срезы 40 мкм, промывали их в двух порциях малеатного буфера, помещали в инкубационную среду с рН 7,4, температурой 52°C, время инкубации 45 мин. Через 45 минут срезы промыли в дистиллированной воде и произвели микроскопирование. В результате было установлено, что активность ацетилхолинэстеразы в стволе положительна, ствол нерва жизнеспособный. Затем произвели восстановление поврежденного лицевого нерва с помощью нервного аутотрансплантата, вшитого между стволом лицевого нерва и его скуловой ветвью. В качестве нервного аутотрансплантата был использован икроножный нерв. Достигнуто восстановление мимики левой стороны лица.

Пример 2. Больной М. 35 лет поступил в клинику с диагнозом: повреждение правого плечевого сплетения. Выполнялась операция по восстановлению целостности поврежденных нервов. Во время операции было обнаружено повреждение срединного нерва и неврома на протяжении. Была удалена часть нерва, которая содержала неврому. После удаления части поврежденного нерва возникла необходимость пластики нерва икроножными нервными аутотрансплантатами, так как был дефект нерва 7 см. После чего возник вопрос: не поврежден ли нерв проксимальнее? Для оценки состояния проксимальной части срединного нерва была взята часть нерва 0,3 см для интраоперационной гистохимической оценки состояния. Данный образец был доставлен в лабораторию, где образцы нерва замораживали в криостате и изготавливали криостатные срезы, 40 мкм. Срезы промывали в двух порциях буферного раствора (0,1М Na-малеатный буфер, рН=7,6). Далее срезы помещались в инкубационную среду с рН=7,6. Инкубировали в термостате при температуре 55°C в течение 30 минут. Через 30 минут срезы промывали в дистиллированной воде и производили микроскопирование. В результате было установлено, что нерв на данном уровне имеет положительную ацетилхолинэстеразную активность, что дало возможность сократить расстояние между поврежденными нервами и тем самым уменьшить размеры икроножных нервных аутотрансплантатов для замещения дефекта нерва. В результате оперативного вмешательства появилась подвижность правой кисти.

Предлагаемый способ использовался в хирургической клинике при операциях аутотрансплантации периферических нервов.

Изобретение описывает способ интраоперационной оценки состояния периферических нервов путем выявления положительной активности ацетилхолинэстеразы. Способ заключается в изготовлении криостатных срезов нерва, промывании их в двух порциях малеатного буфера, инкубации в инкубационной среде. Инкубацию производят в течение 30-60 минут и инкубационная среда имеет следующий состав: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл; рН среды составляет от 7,4 до 7,6 и температура от 50 до 55°C. Способ по изобретению позволяет в короткое время оценить жизнеспособность периферических нервов, что необходимо во время реконструктивно-восстановительных и высокотехнологичных нейрохирургических операций. 2 пр.

Способ интраоперационной оценки состояния периферических нервов путем выявления положительной активности ацетилхолинэстеразы, заключающийся в изготовлении криостатных срезов нерва, промывании их в двух порциях малеатного буфера, инкубации в инкубационной среде, отличающийся тем, что инкубацию производят в течение 30-60 минут в инкубационной среде, которая имеет следующий состав: ацетилхолин иодид 10 мг; 0,1М Na-малеатный буфер 2 мл; 0,1М цитрат натрия 4 мл; 0,03М сульфат меди 4 мл; 0,005М феррицианид калия 4 мл, pH от 7,4 до 7,6 и температуру от 50 до 55°C.