Способ гистохимического выявления аденилатциклазы в нервной ткани Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Од 00 00 йзобретение относится к биологии а именно к гистохимии, и может быть использовано для определения активности аденилатциклазы. Цель изобретения - повышение то ности способа. При осуществлении способа гистохи мического выявления аденилатциклазы в нервной ткани биологический матери ал подготавливают к электронномикроскопическому выявлению аденилатцикл зы поэтапно, причем на первом этапе инкубируют в среде без субстрата с ингибиторами фосфогидролаз в течени 1,5-2 Чэ а на втором --инкубируют в среде с АТФ в течение 30-40 мин. Способ подготовки биологического материала к гистохимическому выявлению активности аденилатциклазы с использованием АТФ в качестве субстра осуществляют следующим образом. Исследуемый материал подвергают префиксации перфузией холодного 1%-ного раствора глютара-льдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 20 мин. Фосфатному буферу отдают предпочтение перед другими, так как он способствует угнетению ак тивности фосфогидролаз. По этой же причине избран глютаральдегид в качестве фиксатора. Затем материал отмывают на холоде в течение 16-18 ч в 0,1 М трис-малеатном буфере (рН 7,4) с 8% сахарозы и 1,5-2 ч в 0,1 М трис-малеатном буфере (рН 7,4) с 5 мМ теофиллина, 10 мМ фторида натрия, 10 мМ бубаина, 10 мМ парахЛормеркурийбензоата, кбто рые угнетают активность фосфодиэстеразы, циклического аденозинмонофосфата, фосфогидролаз. Указанное время отмывки необходимо для максимально полного удаления фиксирующего раствора и частичного восстановления активности аденилатциклазы. Минимальное время инкубации с ингибиторами составляет 1,5-2 ч. Этого времени достаточно для проникновения ингибиторов в наружный слой кусочка ткани и осуществления внем своего ингибирующего действия Как известно, гистохимическая реакция циклизации АТФ, катализируемая аденилатциклазой, проходит именно в этом -наружном слое кусочка. После инкубации с ингибиторами материал переносят в среду инкубации следующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); теофиллин 2; ацетат магния 2; нитрат свинца 2} АТФ 0,5, Инкубацию проводят 30-40 мин при 37°С, после чеГо материал обрабатывают по общепринятой электронномикроскопической методике и заливают в эпон-аралдит. Указанная длительность инкубации (30-40 мин) минимальна и достаточна для появления хорошо идентифи-цируемого продукта реакции. Более длительная инкубация сопряжена с появлением процессов диффузии, которые затрудняют оценку реакции. Пример 1, Мозг фиксируют перфузией холодного 1%-ного раствора глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 20 мин. Затем иссекают кусочки мозга около 1 мм в объеме, промывают их 2 ч в 0,1 М трис-малеатном буфере на холоде и инкубируют 30 мин при 37°С в- среде следующего состава,мм: трис-малеатньй буфер 80 (рН 7,4); ацетат магния 2; ацетат свинца 2; АТФ 0,5. Продукт .реакции : в виде обиль- , ного грубого преципитата локализован на конденсированном хроматине ядер, плазматических мембранах, эндоплазматическом ретикулуме, что не характерно для аденилатциклазы и характерно для фосфогидролазной активности. На результате реакции не отражается введение в инкубационную среду ингибитора аденилатциклазы аллоксана. Пример 2. Головной мозг фиксируют перфузией холодного 1%-ного раствора глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 20 мин. Затем иссекают кусочки мозга около 1 мм в объеме, после чего проводят преинкубацию кусочков 1,5 ч на хододе в среде следующего состава: 0,1 М трисмалеатный буфер (рН 7,4) 5 мМ теофиллин, 10 мМ Фторид натрия, 10 мМ бубаина, 10 мМ парахлормеркурий бензонат. Затем проводят инкубацию 30 мин при в среде следующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); ацетат магния 2; свинец 2; АТФ 95. Продукт реакции локализуется в ви- де тонкого преципитата на постсинаптических окончаниях и на плазматических мембранах. Неспецифичёского 311 отложения продукта реакции не наблюдается. Аллоксаном реакция предотвращается, что свидетельствует о специфичности реакции. Пример 3. Всю обработку проводят аналогично примеру 2, но преинкубацию осуществляют 2 ч. Результат такой же, как в примере 2. Пример 4. Всю обработку проводят аналогично примеру 2, но переин кубация длится 2,5 ч. Количество продукта реакции значительно уменьшено по сравнению с примером -2, кроме того, появилось неспецифическое выпадение продукта реакции не связанное с мембранными структурами. П.р и м е р 5. Вся обработка аналогична примеру 2, но преинкубацию проводят 1ч. Распределение продукта реакции характерно для фосфогидсолазной ак19тивности и не изменяется при введении в инкубационную среду ингибиФора аденнлатциклазы аллоксана. Пример 6. Мозг фиксируют и отмывают аналогично примеру 1, Затем без преинкубации с ингибиторами кусочки инкубируют в среде следующего состава, мм: трис-малеатный буфер 80 (рН 7,4); теофиллин 2; ацетат магния 1, ацетат свинца магния 1, ацетат свинца 2; аденилилимидодифосфат 0,5. Продукт реакции в виде тонкого преципитата маркирует активность аденилатциклазы в плазматических мембранах и на постсинаптических окончаниях, но наряду с этим грубьй преципитат выявляется на других клеточных структурах и в ударах клеток, что обусловлено гидролизом эндогенного субстрата, активностью фосфогидролаз.

СПОСОБ ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ В НЕРВНОЙ ТКАНИ, включающий ее фиксацию и инкубацию в субстрате, содержащем АТФ, от л ич ающ ийс я тем, что, с целью повьшения точности способа, перед инкубацией т.кань обрабатывают в течение 1,5-2 ч в среде с ингибиторами фосфогидролаз.