Способ выделения ацетилхолинэстеразы Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 

1

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам очистки ферментных препаратов - к способу выделения ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7) из яда сред}1еазиатской кобры.

Целевой продукт может быть использован в качестве лекарственного средетва, например, при лечении шоковых состояний, а также как компонент систе для определения низких концентраций фосфорорганических инсектицидов.

Известны способы выделения ацетилхолинэстеразы из животных тканей, например из ткани мозга tilИзвестен способ выделения ацетилхопинэстеразы (АХЭ) из яда среднеазиатской кобры путем двухступенчатой колоночной хроматографии на сульфоэтилпроизводном декстрана в буферных растворах 2.

Преимуществом этого способа является использование в качестве источника фермента яДа среднеазиатской кобры, отличающегося высоким содержанием АХЭ (около 200ОО Е/г сухого яда).

Непосгаткн известного способа состоят в низкой удельной активности по-лучаемого препарата (61 Е/мг белка) и в низком выходе 41ермента (13%). Эти недостатки обусловлены тем, что используемса р качестве ионообменного сорбента сильнокислое сульфоэтилпроизводное декстрана вызьшает в процессе вььделения значительную денатурацию фермента.

Целью предлагаемого способа является устранение недостатков известного способа, а именно получение из яда кобры АХЭ с высокой удельной активноЬтью и с высоким выходом. Другой целью является комплексное использование яда.

Согласно изобретению выделение фермента из яда кобры проводят ступеН чатой колоночной хроматографией с истгользованием на первом этапе слабокислого ионообменника, карбоксиметилпроизводного декстрана, в буферном растворе. На этом этапе наряду с АХЭ удается получить препараты пяти низкомолекулярных физиологически активных пептидов, что приводит к более полному использованию дефицитного сырья. Последующую очистку целевого продукта проводят последовательной хроматографией на колонках с диэтиламиноэтилпроизводным декстрана и с гранулированным гидроксиапатитом в буферных растворах, содержащих в качестве стабилизатора активности фермента глицерин- в количестве Ю вес.%.

Согласно изобретению предлагается способ выделения ацетилхолинэстеразы из яда среднеазиатской кобры с высокой удельной активностью фермента и высоки ВЫХОДОМ; при комплексном использовании сырья путем ступенчатой колоночной хроматографии с использованием на первой ступени карбоксиметилпроизводного декстрана, на второй ступени - диэтиламино- этилпроизводного декстрана, а на третьей - гидроксиапатита. Способ осуществляют в присутствии буферов и-предпочтительно при 2 - . Элюцию ацетилхолинэстеразы на первой ступени осуществляют обычно линейным градиентом, образованным смешиванием 0,01 М уксусно-аммонийного буфера рН 5,0 fc 1,0 М уксусно-аммонийным буфером рН 7,0. Злюцию АХЭ на второй ступени осуществляют обычно линейньщ градиентом, образованным смешиванием 0,01 М трис- HCft буфера рН 7,8 с 0,5 М раствором. NaCft в том же буфере.

Элюцию АХЭ на третьей ступени осуществляют обычно 0,5 М раствором NoOB в 0,01 М Л/а-фосфатном буфере рН 7,6

Буферные растворы на второй и третьей ступенях содержат глицерин; в количестве 10 вес.%.

Предпочтительно процесс выделения АХЭ проводят следующим образом.

Обессоленный яд среднеазиатской кобры наслаивают на колонку с карбоксиметилпроизводным декстрана, уравновешенным уксусно-аммонийным буфером рН 5,0. Элюцию связавшегося материала производят линейным (по молярности буферных растворов) градиентом, образованным смешением уравновешивающего буфера с 1,0 М уксусно-аммонийным буфером рН 7,0. При этом наряду с i препаратом t- АХЭ удается получить препараты пяти .низкомолекулярных физиологически активных пептидов. Использование на первом этапе очистки АХЭ слабокислого производного декстрана поз- вапяет снизить денатурацию фермента, наблюдаемую при использовании сильнокислого производного декстрана. Последующая очистка целевого продукта проводится на диэ.тиламиноэтилпроизводном декстрана. Для снижения денатурации АХЭ с этого этапа очистки в буфернью

растворы добавляют глицерин (10% по объему). Элюцию АХЭ с колонки с диэтиламиноэтилпроизводным декстрана, уравновешенным 0,01 М трис-НС4 буфером рН 7,8, содержащим 10% глицерина, проводят линейным градиентом, образованным смешением уравновешивающего буфера с 0,5 М НаСС э том же буфере. Последний этап .очистт состоит в хроматографии АХЭ на колонке с гранулированным гидроксиапатитом, уравновешенным 0,01 М Na -фосфатным буфером рН 7,6, содержащим 1.0% глицерина. Элюцию фермента проводят О,5 М

MnCd в том же буфере. Этот этап выделения позволяет в еще большой степени очистить и сконцентрировать целевой пропукт. Замена на этом этапе трис-НС( буфера на фосфатный облегчает определение концентрации белка методом

Лоури,

Полученный препарат АХЭ, как следует из результатов электрофоретического анализа, гомогенен. Молекулярный вес фе эмента 1ЮООО ± 1ОООО. Ферментгидролизует ацетилхолин АТХ (К 1,3х х1Ом), мехолин {К„-2,2х10 М) и практически не гидролизует бутирилхолин. Высокие концентрации ацетилхолина и мехолина угнетают активность фермента. Величины констант второго порядка взаимодействия препаратов АХЭ с фосфорорганическими ингибитопами АХЭ состав-1

-i

ляют (0,85-6,7) X

мин

что в 2 раза выше констант взаимодействия этих же соединений с препаратом АХЭ из эритроцитов человека (АХЭЧ). Разбавленный раствор фермента (1Е/ил) в забуференном растворе (0,02 М натрийфосфат рН 7,6) альбумина (0,2%) или глицерина (10%) инактивируется при на 10% за I ч, а при (4-6)°С на 10% за 1 сут. Температурный оптимум гидролиза АТХ ферментом, разбавленным 0,15 М NaCO, составляет 2О°С, а фермента, разбавленного раствором альбумина (0,2%) или глицерина (10%) .