ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К ФНО-α, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ (Fab) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2015 года по МПК C07K16/24 C12N15/13 A61K39/395 A61P37/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам к фактору некроза опухоли-α человека (ФНО-α), их антигенсвязывающим фрагментам (Fab) и применению указанных антител и фрагментов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Развитие и прогрессирование аутоиммунных заболеваний является сложным процессом, который возникает как следствие нарушенного равновесия в регуляции многих активных цитокинов. Было показано, что фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) играет важную роль в иммунной регуляции множества цитокинов. Однако было продемонстрировано, что его сверхэкспрессия является одной из основных причин аутоиммунных и других заболеваний. Соответственно, применение биофармацевтических препаратов, подавляющих активность ФНО-α, становится одним из наиболее успешных способов лечения таких заболеваний. Показания, которые были одобрены для таких препаратов, включают главным образом ревматоидный артрит, болезнь Крона, бляшечный псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит и юношеский идиопатический артрит, а многие сходные заболевания в настоящее время изучаются в клинических исследованиях.

В настоящее время на рынке Европы и Америки появились фармацевтические антитела против ФНО-α и лекарственные средства на основе антитело-подобных гибридных белков Fc, такие как Ремикейд. Однако Ремикейд обладает меньшим периодом полувыведения in vivo, который составляет приблизительно 9 дней. Кроме того, хотя Ремикейд обладает высоким сродством связывания, биологической активностью и клинической эффективностью, поскольку он является химерным антителом, содержащим 1/3 последовательностей от мыши и 2/3 последовательностей от человека, приблизительно у 10%-47% пациентов после введения Ремикейда возникает иммунный ответ, обычно приводящий к образованию антимышиных антител человека (HAMA), которые плохо влияют на активность и длительность применения указанного антитела. Соответственно, существует большая потребность в разработке антитела против ФНО-α с высокой степенью гуманизации и максимально сниженной долей последовательностей, полученных от мыши, чтобы уменьшить процент материала мышиного происхождения и обеспечить безопасное применение при лечении заболеваний у человека. Обычным способом гуманизации антител является прививка частей гипервариабельных областей (CDR) вариабельных областей (V_H, V_K) антитела, полученного от мыши, в каркасную область ранее отобранного антитела человека. Образующееся антитело содержит в основном последовательности, полученные от человека, и может сохранять селективность исходного антитела мышиного происхождения в отношении того же антигена. Однако указанный способ, как правило, влечет за собой потерю сродства указанного антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одна из задач настоящего изобретения состоит в обеспечении гуманизированных антител к фактору некроза опухоли-α человека (ФНО-α) и их антигенсвязывающих фрагментов (Fab), сродство которых к фактору некроза опухоли-α человека сопоставимо или даже выше, чем у Ремикейда - химерного антитела человека/мыши.

Гуманизированные антитела к фактору некроза опухоли-α человека (ФНО-α) или Fab, предложенные в настоящем изобретении, содержат вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи показана в SEQ ID №:1 или 3 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи показана в SEQ ID №:15, 9, 11, 7, 13 или 5 в перечне последовательностей, и первым остатком аминокислоты в SEQ ID №:1 является Glu или Gln.

Указанное антитело выбирают, в частности, из одного из следующих a)-l):

a) KS10, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH08 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:15;

b) KS03, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH05 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:9;

c) KS06, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH06 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:11;

d) KS12, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH08 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:15;

e) KS04, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH05 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:9;

f) KS07, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH06 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:11;

g) KS02, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH03 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:5;

h) KS08, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH04 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:7;

i) KS11, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:3, и вариабельную область легкой цепи SH07 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:13;

j) KS01, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH03 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:5;

k) KS05, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH04 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:7;

l) KS09, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:1, и вариабельную область легкой цепи SH07 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:13;

причем первым остатком аминокислоты в SEQ ID №:1 является Glu или Gln.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении антигенсвязывающего фрагмента (Fab) гуманизированного антитела к фактору некроза опухоли-α человека. Указанный Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи, последовательность аминокислот которой соответствует положениям 1-20 в SEQ ID №:27 или SEQ ID № DQ25 в перечне последовательностей, и вариабельную область легкой цепи, последовательность аминокислот которой соответствует положениям 1-109 в SEQ ID №:31 или SEQ ID №:29 в перечне последовательностей.

Антитело, предложенное в настоящем изобретении, состоит из тяжелой цепи, в которой последовательность аминокислот константной области идентична последовательности аминокислот тяжелой цепи антитела человека, и легкой цепи, в которой последовательность аминокислот константной области идентична последовательности аминокислот легкой цепи антитела человека.

Константная область тяжелой цепи описываемого антитела может быть полученной от человека константной областью любого класса (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) или подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2), а константная область легкой цепи описываемого антитела может быть полученной от человека константной областью легкой цепи любого класса (κ или λ) или подкласса (λ1, λ2, λ3, λ4), или аллотипа (κm (1), κm (2), κm (3)).

Последовательность аминокислот константной области тяжелой цепи указанного антитела, в частности, показана в SEQ ID №:17 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот константной области легкой цепи, в частности, показана в SEQ ID №:19 в перечне последовательностей.

Последовательность аминокислот указанной тяжелой цепи показана в SEQ ID №:21 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот указанной легкой цепи, в частности, показана в SEQ ID №:23 в перечне последовательностей. Остатки аминокислот в положениях 1-120 SEQ ID №:21 соответствуют вариабельной области тяжелой цепи, а остатки аминокислот в положениях 121-450 той же последовательности соответствуют константной области тяжелой цепи. Остатки аминокислот в положениях 1-109 SEQ ID №:23 соответствуют вариабельной области легкой цепи, а остатки аминокислот в положениях 110-214 той же последовательности соответствуют константной области легкой цепи. Первым остатком аминокислоты в SEQ ID №:21 является Glu или Gln.

Фрагмент Fab, предложенный в настоящем изобретении, состоит из фрагмента Fd тяжелой цепи и легкой цепи; причем указанный фрагмент Fd тяжелой цепи включает V_H и CH1, а указанная легкая цепь включает V_K и константную область легкой цепи; причем последовательность аминокислот указанной CH1 идентична CH1 константной области тяжелой цепи антитела человека, а последовательность аминокислот указанной константной области легкой цепи идентична константной области легкой цепи антитела человека.

CH1 указанного фрагмента Fd описанного выше Fab может быть CH1 константной областью, полученной от человека, любого класса (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) или подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1, IgA2); а константная область легкой цепи описанного выше Fab может быть константной областью легкой цепи, полученной от человека, любого класса (κ или λ) или подкласса (λ1, λ2, λ3, λ4), или аллотипа (κm (1), κm (2), κm (3)).

Последовательность аминокислот CH1 показана в SEQ ID №:33 в перечне последовательностей; последовательность аминокислот константной области указанной легкой цепи показана в SEQ ID №:19 в перечне последовательностей.

Согласно конкретным вариантам реализации настоящего изобретения, указанный Fab является одним из следующих b1)-b3):

b1) KS-7F: последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №:27 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот легкой цепи показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей;

b2) KS-7A: последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №:25 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей;

b3) KS-2E: последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи показана b SEQ ID №:25 в перечне последовательностей; а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №:29 в перечне последовательностей.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении антигенсвязывающего фрагмента A или антигенсвязывающего фрагмента B, причем указанный антигенсвязывающий фрагмент A представляет собой Fab, Fab′, F(ab′)₂, Fv (фрагменты вариабельных областей антитела), вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области тяжелой цепи, или фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области легкой цепи, которые получают из указанного антитела; антигенсвязывающий фрагмент B представляет собой Fab′, F(ab′)₂, Fv, вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области тяжелой цепи, или фрагменты полипептида, выбираемые из вариабельной области легкой цепи, которые получают из указанного Fab.

Упоминаемый выше F(ab′)₂ состоит из пары легких цепей и пары тяжелых цепей (обозначается как Fd′), которые несколько крупнее, чем Fd. Гидролиз молекул IgG под действием пепсина может приводить к получению указанного фрагмента F(ab′)₂, который содержит два Fab, и таким образом, может связываться с двумя антигенными эпитопами. Fd′ содержит около 235 остатков аминокислот, которые охватывают V_H, CH1 и шарнирную область. Fv состоит из вариабельной области легкой цепи (V_L) и вариабельной области тяжелой цепи (V_H), которые соединены вместе нековалентными связями. Fv обладает молекулярной массой приблизительно в шесть раз больше, чем молекула интактного антитела, и содержит единственный антигенсвязывающий сайт. Fv включает ScFv (одноцепочечные антитела), DsFv (стабилизированные дисульфидными связями антитела) и др. ScFv представляет собой одну пептидную цепь, экспрессируемую с V_H и V_L, соединенных вместе фрагментом подходящего олигонуклеотида (линкера). DsFv представляет собой иммобилизованный дисульфидными связями фрагмент Fv, образованный путем соответствующего введения одного цистеина в легкую цепь и вариабельную область тяжелой цепи в соответствующем сайте. Было показано, что DsFv превосходит ScFv как по сродству связывания, так и по стабильности.

Также в объем изобретения входит ген, кодирующий любой из белков A)-C):

(A) указанное антитело; B) указанный Fab; C) антигенсвязывающий фрагмент A или B.

Последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей как указанного антитела, так и антигенсвязывающего фрагмента A, показаны в SEQ ID №:2 или 4 в перечне последовательностей. Последовательности, кодирующие вариабельные области легких цепей как указанного антитела, так и антигенсвязывающего фрагмента A, выбирают из SEQ ID №:16, 10, 12, 8, 14 и 6 в перечне последовательностей. Последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей как указанного Fab, так и антигенсвязывающего фрагмента B, соответствуют положениям 1-360 в любой из последовательностей SEQ ID №:2, 4, 28 и положениям 1-360 SEQ ID №:26 в перечне последовательностей. Последовательности, кодирующие вариабельные области легких цепей как Fab, так и антигенсвязывающего фрагмента B, соответствуют положениям 1-327 в любой из последовательностей SEQ ID №:16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 и положениям 1-327 последовательности SEQ ID №:30 в перечне последовательностей.

Среди перечисленных выше последовательностей как SEQ ID №:2, так и SEQ ID №4 содержат 360 нуклеотидов, а все последовательности SEQ ID №:6, 8, 14, 10, 12 и 16 содержат 327 нуклеотидов.

Последовательность, кодирующая константную область тяжелой цепи указанного антитела, показана в SEQ ID №:18 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая константную область легкой цепи указанного антитела, показана в SEQ ID №:20 в перечне последовательностей.

Последовательность, кодирующая область CH1 указанного Fab, показана в SEQ ID №:34 в перечне последовательностей; последовательность, кодирующая константную область легкой цепи указанного Fab, показана в SEQ ID №:20 в перечне последовательностей.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующая тяжелую цепь указанного антитела, показана, в частности, в SEQ ID №:22 в перечне последовательностей; последовательность, кодирующая легкую цепь указанного антитела, показана, в частности, в SEQ ID №:24 в перечне последовательностей.

Последовательность, кодирующая указанный Fab, является одной из следующих c1-c3):

c1) KS-7F: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab показана в SEQ ID №:28 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №:32 в перечне последовательностей;

c2) KS-7A: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab показана в SEQ ID №:26 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №:32 в перечне последовательностей;

c3) KS-2E: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab показана в SEQ ID №:26 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №:30 в перечне последовательностей.

Тогда как нуклеотиды в положениях 1-360 и 360-1350 последовательности SEQ ID №:22 соответствуют нуклеотидам упомянутой вариабельной области тяжелой цепи и нуклеотидам константной области тяжелой цепи, соответственно; нуклеотиды в положениях 1-327 и 328-642 последовательности SEQ ID №:24 соответствуют нуклеотидам упомянутой вариабельной области легкой цепи и нуклеотидам константной области легкой цепи, соответственно.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении следующего генетического материала: рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии,

рекомбинантной линии клеток; рекомбинантного вируса или кассеты экспрессии, содержащей ген, описанный выше.

Указанный рекомбинантный вектор представляет собой вектор экспрессии у прокариот или эукариот для экспрессии указанного антитела, Fab или антиген-связывающего фрагмента. Указанная рекомбинантная бактерия представляет собой Escherichia coli, содержащую ген, описанный выше. Указанная рекомбинантная линия клеток представляет собой трансгенную линию клеток или гибридную линию клеток, причем указанная трансгенная линия клеток может представлять собой линию клеток млекопитающих, в которых трансфецировали указанный ген, кодирующий гуманизированное антитело к фактору некроза опухоли-α человека, или Fab, или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, предпочтительно линия клеток CHO (яичника китайского хомячка), или линия клеток 293 и ее сублинии; указанная гибридная линия клеток представляет собой клетки гибридомы, которые могут секретировать указанное гуманизированное антитело к фактору некроза опухоли-α человека, упоминаемое в настоящем изобретении. Указанный рекомбинантный вирус представляет собой рекомбинантный аденовирус или рекомбинантный адено-ассоциированный вирус и др., которые содержат ген, описанный выше. Указанная кассета экспрессии представляет собой молекулу ДНК, которая включает три фрагмента в направлении протекания транскрипции в следующем порядке: промотор; ген, кодирующий указанное антитело или Fab, или его антигенсвязывающий фрагмент, транскрипция которого инициируется с указанного промотора; и терминатор.

Если клетку-хозяина трансфецируют или трансформируют рекомбинантным вектором, содержащим ген, кодирующий указанное антитело, Fab или антигенсвязывающий фрагмент, могут экспрессироваться соответствующие белки, и таким образом можно получать указанное антитело, Fab или антигенсвязывающий фрагмент. Указанная клетка-хозяин может быть клеткой эукариот, а может быть клеткой прокариот, включая, но не ограничиваясь клетками млекопитающих, бактерий, дрожжей, насекомых и др. Для масштабной экспрессии белков применим широкий спектр клеток млекопитающих, таких как клетки 293, CHO, SP20, NS0, COS, BHK или PerC6 и др. Существуют разные способы трансфекции клетки, включая без ограничений электропорацию, опосредуемую липосомами трансфекцию, опосредуемую фосфатом кальция трансфекцию и др.

Предпочтительный способ экспрессии указанного антитела, Fab или антигенсвязывающего фрагмента следующий: проведение амплификации гена при помощи рекомбинантного вектора в стабильно трансфецированной клетке-хозяине с целью увеличения уровня экспрессии указанного рекомбинантного белка. Например, дефицитную по DHFR клетку-хозяина стабильно трансфецируют рекомбинантным вектором, содержащим ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), а затем в питательную среду для культивирования клеток можно добавлять метотрексат (МТХ) в концентрации, достаточной для увеличения числа копий указанного рекомбинантного вектора в клетке-хозяине.

После экспрессии указанного Fab или IgG, содержащего сочетание кодирующих последовательностей гена, для определения концентрации белка в питательной среде можно применять твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или другие виды анализа. Для указанных фрагментов Fab можно проводить очистку при помощи аффинной хроматографии с применением белка G; белки IgG можно очистить при помощи аффинной хроматографии с применением белка A.

Также в объем настоящего изобретения попадает применение указанного антитела, или Fab, или антигенсвязывающего фрагмента, или указанного гена, или указанного генетического материала при:

d1) получении лекарственного средства для профилактики и/или лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли-α человека, или

d2) получении продукта для нейтрализации фактора некроза опухоли-α человека, или

d3) получении набора для качественного и количественного определения фактора некроза опухоли-α человека.

Причем заболеванием, ассоциированным с фактором некроза опухоли-α человека, является заболевание, вызванное повышением уровня фактора некроза опухоли-α человека, предпочтительно ревматоидный артрит, аутоиммунный увеит, болезнь Крона, бляшечный псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит или юношеский идиопатический артрит.

Еще одна задача настоящего изобретения состоит в обеспечении фармацевтической композиции, содержащей вспомогательные вещества и активные ингредиенты, причем указанные активные ингредиенты включают по меньшей мере одно из следующих веществ: антитело, Fab, антигенсвязывающий фрагмент, ген и генетический материал, описанные выше; а указанное вспомогательное вещество представляет собой фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Указанными активными ингредиентами в фармацевтической композиции может быть только один любой из указанных Fab или антител, описываемых выше, или любой один из антигенсвязывающих фрагментов, описываемых выше, или любой один из генов, описываемых выше, или любой один из генетических материалов, описываемых выше.

Также в объем настоящего изобретения попадает применение любого из следующих веществ для лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли-α человека: указанного антитела, Fab, антигенсвязывающего фрагмента, указанного гена, генетического материала и фармацевтической композиции, описываемых выше.

Указанное заболевание, ассоциированное с фактором некроза опухоли-α человека, вызвано увеличением уровня фактора некроза опухоли-α человека, и предпочтительно является аутоиммунным увеитом, ревматоидным артритом, болезнью Крона, бляшечным псориазом, псориатическим артритом, анкилозирующим спондилитом, язвенным колитом или юношеским идиопатическим артритом.

Описание прилагаемых чертежей:

На Фиг.1 показано определение биологической активности указанного гуманизированного Fab в отношении подавления ФНО-α при помощи ELISA.

На Фиг.2 показано определение биологической активности указанного гуманизированного Fab в отношении нейтрализации ФНО-α в эксперименте по оценке цитотоксичности L929.

На Фиг.3 показан анализ связывания KS10 с антигенным ФНО-α из разных видов.

На Фиг.4 показаны баллы, оценивающие лечение KS10 у экспериментальных крыс, страдающих ревматоидным артритом. Слева направо показаны - здоровая группа, отрицательный контроль, модельная группа, группа, получающая 5 мг/кг KS10, группа, получающая 10 мг/кг KS10, и группа, получающая 20 мг/кг KS10.

На Фиг.5 показано действие KS10 на уровень IL-1β (интерлейкина-1β) в синовиальной жидкости/ткани суставов экспериментальных крыс, страдающих ревматоидным артритом. Слева направо показаны - здоровая группа, отрицательный контроль, модельная группа, группа, получающая 5 мг/кг KS10, группа, получающая 10 мг/кг KS10, и группа, получающая 20 мг/кг KS10.

На Фиг.6 показано действие KS10 на уровень IL-6 в синовиальной жидкости/ткани суставов экспериментальных крыс с ревматоидным артритом. Слева направо показаны - здоровая группа, отрицательный контроль, модельная группа, группа, получающая 5 мг/кг KS10, группа, получающая 10 мг/кг KS10, и группа, получающая 20 мг/кг KS10.

Примеры

Следующие примеры представлены для обеспечения более полного представления о настоящем изобретении, но не для ограничения изобретения. Если не указано другое, экспериментальные способы, упоминаемые ниже, соответствуют традиционным экспериментальным способам. Если не указано другое, экспериментальные материалы, применяемые в данных примерах, все могут быть приобретены в обычных компаниях, производящих биомедицинские реактивы. Количественный анализ в следующих примерах проводили в трех параллельных определениях, и за результат брали средние значения.

Прививка CDR тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела к ФНО-α, сайт-направленный мутагенез при помощи ПЦР (полимеразно-цепной реакции) и скрининг в библиотеке мутантных генов, описанные в настоящем изобретении, проводили в соответствии с традиционными технологиями рекомбинации генов и иммунологическими способами, основанными на взаимодействии атиген-антитело, а подробные экспериментальные способы и этапы задокументированы в "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 3rd edition, by Joseph Sambrook, Science Press, и similar experiment handbooks. EC₅₀ (концентрация, обеспечивающая 50% от максимального эффекта) в следующих примерах получали путем введения значений оптической плотности (OD₄₅₀) в программу GraphPad Prism 5, и генерирования итоговых графиков.

Пример 1: Экспрессия Fab гуманизированного антитела к ФНО-α и определение его активности

В данном примере применяют три Fab гуманизированных антител к ФНО-α (указанный Fab состоит из Fd фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи указанного антитела), а именно KS-2E, KS-7A, и KS-7F.

1. Конструирование векторов экспрессии для KS-2E, KS-7A и KS-7F

(1) Получение последовательностей легких и тяжелых цепей

Клетки гибридомы получали от мышей, вакцинированных ФНО-α человека (R&D Co., каталожный номер: 210-ТА-050) и подвергали их скринингу на продуцентов моноклональных антител, а затем полную РНК экстрагировали и применяли в качестве матрицы, с которой амплифицировали последовательности нуклеотидов для вариабельной области тяжелой цепи при помощи ПЦР с применением обычных праймеров Р1: 5′-GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′, Р2: 5′-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3′; а последовательности нуклеотидов для вариабельной области легкой цепи амплифицировали при помощи ПЦР с применением обычных праймеров Р3: 5′-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3′, P4: 5′-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3′. Срезы геля, содержащие рассматриваемые полосы, вырезали для дальнейшего восстановления. Продукты амплификации тяжелых и легких цепей указанного антитела индивидуально встраивали в вектор pMD18-T (TaKaRa Co., каталожный номер: D101C). Одиночные колонии по отдельности извлекали и секвенировали с целью идентификации последовательностей нуклеотидов вариабельных областей легких и тяжелых цепей указанного антитела.

(2) Конструирование гуманизированного Fab

Проводили сравнение сходства последовательностей аминокислот между полученной вариабельной областью легкой цепи и вариабельной областью легкой цепи гуманизированного антитела, между полученной вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью тяжелой цепи гуманизированного антитела. Поиск сходства последовательностей проводили по отдельности в IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) и IMGT (ImMunoGeneTics, IMGT: http://www.imgt.org). На основании результатов поиска в качестве матрицы для получения гуманизированного антитела выбирали антитело с более высоким процентом сходства последовательностей в отношении как легких, так и тяжелых цепей. Полученную вариабельную область тяжелой цепи VH прививали в каркасную область антитела человека IGHV3-15*07 (Номер доступа: М99406), обладающего более высоким процентом сходства последовательностей, а полученную вариабельную область легкой цепи VK прививали в каркасную область антитела человека IGKV6-21*01 (Номер доступа: Х63399), обладающего более высоким процентом сходства последовательностей.

После множественных циклов мутагенеза в исходных фрагментах тяжелых цепей (Fd) и легких цепях человека сочетания разных легких цепей и фрагментов тяжелых цепей (Fd) встраивали в вектор pTLR (модифицированный pET22b (+) вектор). Более конкретно, готовили разные ДНК для легких цепей с сайтами рестрикции BamHI и EcoRI, соответственно, на каждом конце, и разные ДНК для фрагментов тяжелых цепей (Fd) с сайтами рестрикции NotI и XhoI соответственно, на каждом конце. Две группы ДНК по отдельности клонировали в вектор pTLR (модифицированый pET22b (+) вектор) между соответствующими сайтами рестрикции, то есть, разные ДНК для указанных легких цепей встраивали между сайтами рестрикции BamHI и EcoRI, разные ДНК для указанных фрагментов тяжелых цепей (Fd) встраивали между сайтами рестрикции NotI и XhoI, что привело к получению нескольких векторов экспрессии Fab (включая три вектора экспрессии Fab, с которых экспрессируются KS-2E, KS-7A и KS-7F, соответственно).

Разные сочетания указанных легких цепей и указанных фрагментов тяжелых цепей, упоминаемых выше, включают три указанных Fab, KS-2E, KS-7F, и KS-7A. Последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи KS-2E показана в SEQ ID №:25 в перечне последовательностей, его последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:26, а последовательность аминокислот легкой цепи KS-2E показана в SEQ ID №:29 в перечне последовательностей, ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:30. Последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи KS-7A показана в SEQ ID №:25 в перечне последовательностей, его последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:26, а последовательность аминокислот легкой цепи KS-7A показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей, ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:32. Последовательность аминокислот фрагмента тяжелой цепи KS-7F показана в SEQ ID №:27 в перечне последовательностей, его последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:28, а последовательность аминокислот легкой цепи KS-7F показана в SEQ ID №:31 в перечне последовательностей, ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:32.

Более подробно, способ модификации вектора pET22b (+) с целью получения упоминаемого выше вектора pTLR был следующим: сначала искусственным путем синтезировали сегмент ДНК (сокращенно - последовательность ДНК T-L-R, показанная в SEQ ID №:35 в перечне последовательностей), который содержал последовательность промотора Р7, оператор лактозного оперона и сайт связывания с рибосомой (RBS), с сайтами рестрикции SalI и NotI, расположенными на каждом конце; затем по отдельности расщеплению подвергали вектор pET22b (+) (продукт компании «Novage Co.», США) и последовательность ДНК T-L-R рестриктазами SalI и NotI, затем сшивали вместе при помощи ДНК-лигазы Т4 и трансформировали; и в конце - традиционным способом отбирали отдельную колонию и проводили последующий скрининг на правильно модифицированный вектор.

2. Экспрессия KS-2E, KS-7A и KS-7F у прокариот

Штамм E. coli Top 10 трансформировали по отдельности сконструированными, как упоминалось выше, векторами экспрессии Fab (включая три вектора экспрессии Fab, которые экспрессируют KS-2E, KS-7A и KS-7F, соответственно), а затем его помещали в планшет 2-YT (пептон 1,6%, экстракт дрожжей 1%, NaCl 0,5%, и агар в порошке 1,5%) с хлорамфениколом. На следующий день выбирали планшет с подходящей плотностью колонии для отбора нескольких одиночных колоний. Для каждой позитивной колонии отбирали восемь одиночных колоний и помещали в планшет с 96 глубокими лунками, затем индуцировали экспрессию при помощи IPTG (изопропилтиогалактозид). Каждую одиночную колонию добавляли в пробирку с 6 мл жидкой среды 2-YT YT (пептон 1,6%, экстракт дрожжей 1%, NaCl 0,5%), содержащей хлорамфеникол, и взбалтывали при 250 об/мин при 37°C в течение 12 часов. 0,2 мкл указанной суспензии бактерий отбирали пипеткой из каждой пробирки и переносили на планшет с 2-YT с хлорамфениколом для хранения. 5 мл указанной суспензии бактерий засевали на 500 мл жидкой среды 2-YT, содержащей хлорамфеникол, и культивировали при 33°C, 300 об/мин до тех пор, пока OD₆₀₀ не достигала 0,6. Затем в указанную среду добавляли IPTG в конечной концентрации 50 мкл, чтобы индуцировать экспрессию разных Fab, с временем индукции 3 часа. После того, как индуцированная экспрессия завершалась, указанную питательную среду центрифугировали при 5100 об/мин и 10°C в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливали, а осадок с бактериями полностью повторно суспендировали в 40 мл предварительно охлажденного раствора TES (Трис-(гидроксиметил)-метил-2-аминоэтансульфоновая кислоты); 66 мл предварительного охлажденного разбавленного 20% раствора TES с H₂O добавляли повторно в повторно суспендированный раствор бактерий и инкубировали на льде в течение 40 минут, после чего центрифугировали при 13000 об/мин, 4°C в течение 10 минут. После центрифугирования отбирали надосадочную жидкость, которая представляет собой периплазматический экстракт, содержащий белки Fab (белки KS-2E, KS-7A или KS-7F). Указанный периплазматический экстракт обессоливали путем пропускания через колонку G-25 («GE Co.», 17-0034-01). Готовили колонку, заранее заполненную белком G («GE Co.», 17-0618-04), уравновешивали ее раствором для уравновешивания (20 мМ фосфатного буфера, pH 6,5), а затем загружали на нее указанную пробу белка. После загрузки указанной пробы колонку последовательно промывали раствором для уравновешивания, а затем проводили десорбцию непосредственно при помощи раствора для десорбции (0,1 М Gly-HCl, pH 2,5). Элюируемые фракции отбирали, и pH элюируемых фракций быстро корректировали до 7,0, заранее добавляя 1,0М Трис-HCl буфер (pH 9,0) в пробирки для отбора фракций перед их отбором, причем отношение объемов Трис-буфера и элюируемых фракций составляло 1:9. Отобранная жидкость содержит рассматриваемые белки. Чистоту указанного белка оценивали при помощи SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия), и оценивали концентрацию белка в указанных пробах белка. В итоге, указанную пробу белка упаковывали и хранили при -80°C, получая в результате белки Fab с более высокой степенью чистоты (включая три белка KS-2E, KS-7A и KS-7F).

3. Определение биологической активности KS-2E, KS-7A и KS-7F

1) Анализ связывания гуманизированных Fab к ФНО-α методом ELISA

Белки Fab, которые связываются с ФНО-α, подвергали скринингу посредством следующих этапов: планшет для ELISA в качестве субстрата покрывали 100 нг полученного от человека ФНО-α («R&D Co.», каталожный номер: 210-ТА-050) на лунку; добавляли 2-кратные серийные разведения 40 нМ белков Fab (приготовленные на 2 этапе, включая три белка KS-2E, KS-7A и KS-7F), и затем инкубировали; добавляли вторичное козье античеловеческое антитело С-Каппа, меченное пероксидазой хрена («Sigma Co.», каталожный номер: K3502) и в итоге добавляли ТМВ (тетраметилбензидин) для развития реакции и 2 М серной кислоты для остановки реакции; таким образом, определяли связывание белков Fab с ФНО-α. В соответствии с таким способом скрининга были получены три Fab с более высокой активностью: KS-2E, KS-7F и KS-7A, указанные белки в общем содержат два разных VH (VH01 и VH02, причем последовательность аминокислот VH01 показана в SEQ ID №:25, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:26; последовательность аминокислот VH02 показана в SEQ ID №:27, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:28), и два разных VK (VK03 и VK05, причем последовательность аминокислот VK03 показана в SEQ ID №:29, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:30; последовательность аминокислот VK05 показана в SEQ ID №:31, а ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:32 (Таблица 1)).

Результат тестирования активности связывания гуманизированного Fab к ФНО-α методом ELISA проиллюстрирован на Фиг.1. Данный результат показывает, что три гуманизированных Fab, полученных, как описано выше, обладают сродством к антигену, близким к сродству, которым обладает фрагмент Fab Ремикейда - химерного антитела человека-мыши, причем EC₅₀ для связывания KS-7A и KS-7F с ФНО-α выше, чем для связывания фрагмента Fab химерного антитела человека-мыши Ремикейда (таблица 2).

Таблица 1 Fab гуманизированных антител к ФНО-α Фрагмент Fab VH VK KS-2E VH01 VK03 НП VH02 VK03 KS-7F VH01 VK05 KS-7A VH02 VK05 Примечание: «НП» обозначает, что фрагмент Fab не был охарактеризован из-за низкой активности.

В Таблице 2 приведены EC₅₀ для связывания фрагмента Fab гуманизированных антител к ФНО-α с ФНО-α при ELISA

Таблица 2 Проба EC₅₀ (нМ) Fab Ремикейда 3,324 KS-2E 6,659 KS-7A 3,027 KS-7F 2,740 Примечание: Данные в Таблице 2 приведены как средние значения для трехкратных экспериментов.

2. Определение биологической активности гуманизированных Fab при подавлении ФНО-α в эксперименте с цитотоксичностью L929.

Кроме того, биологическую активность трех гуманизированных Fab, указанных выше (KS-2E, KS-7F и KS-7A), в отношении нейтрализации ФНО-α проверяли в клеточно-биологическом эксперименте - в пробе на цитотоксичность L929. В данном эксперименте 1×10⁴ клеток L929 в логарифмической фазе роста засевали на среду DMEM (среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко) (10% эмбриональной бычьей сыворотки - ЭБС, «Gibco») в планшет на 96 лунок. Через 24 часа добавляли 0,5 нг/мл ФНО-α человеческого происхождения («R&D Co.», каталожный номер: 210-ТА-050) и 0,5 мкг/мл актиномицина D («Fluka»). Указанные клетки разделяли на четыре группы, и три гуманизированных Fab, упоминаемых выше, а также фрагмент Fab контрольного антитела Ремикейд индивидуально добавляли к каждой группе, указанные клетки культивировали еще в течение 24 часов. В итоге, жизнеспособность клеток анализировали при помощи набора CCK8 («Dojindo Laboratories»). Результат показан на Фиг.2 и он свидетельствует, что три гуманизированных Fab, упоминаемых выше, могут проявлять биологическую активность, эффективно нейтрализуя ФНО-α, причем биологическая активность KS-7A в отношении нейтрализации ФНО-α превосходит активность фрагмента Fab химерного антитела человека-мыши Ремикейда. Данные на Фиг.2 представлены как среднее ± стандартное отклонение для трехкратных экспериментов.

Пример 2: Конструирование библиотеки «созревания сродства» для CDR3 Fab гуманизированного антитела к ФНО-α

Чтобы еще больше увеличить сродство фрагментов Fab упоминаемого выше гуманизированного антитела к ФНО-α к антигену, отдельно создавали библиотеки «созревания сродства» для CDR3 тяжелой цепи VH02 и для CDR3 легкой цепи VK05 в векторе экспрессии Fab гуманизированного антитела к ФНО-α. Поскольку области CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи являются наиболее важными областями для связывания антитела с антигеном, для получения антитела с более высоким сродством можно проводить сайт-насыщающий мутагенез области CDR3, а затем скрининг. Для конструирования библиотеки сайт-насыщающего мутагенеза для CDR3 тяжелой и легкой цепей, разрабатывали серии праймеров для сайт-направленного мутагенеза и применяли их в ПЦР. Полученные продукты, амплифицированные в ходе ПЦР, смешивали с сериями праймеров в равных отношениях вырожденности и клонировали в вектор экспрессии для Fab гуманизированного антитела к ФНО-α. Конструирование библиотеки сайт-направленного мутагенеза для CDR3 легкой цепи проводили следующим образом: проведение ПЦР с серией праймеров 5 и с обратным праймером 6 для легкой цепи (5′-CGGAATTCCGTACGTTTCACTTCCAGATTGG-3′), а также с применением ДНК легкой цепи в качестве матрицы для получения рассматриваемых продуктов ДНК, затем - клонирование указанных продуктов ДНК в вектор экспрессии Fab, проведение электроблоттинга и инкубация в планшетах для получения библиотеки сайт-направленного мутагенеза для CDR3 легкой цепи. Серия праймеров 5 содержит мутантный сайт в CDR3, и всего в нее входит 19 праймеров, перечисленных в Таблице 3. Конструирование библиотеки сайт-направленного мутагенеза для CDR3 тяжелой цепи проводили следующим образом: проведение ПЦР с серией праймеров 7 и с обратным праймером 8 для тяжелой цепи (5′-CCGCTCGAGGCGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCCTG-3′), а также с применением ДНК тяжелой цепи в качестве матрицы для получения рассматриваемых продуктов ДНК, затем - клонирование указанных продуктов ДНК в плазмиду экспрессии Fab, проведение электроблоттинга и инкубация в планшетах для получения библиотеки сайт-направленного мутагенеза для CDR3 тяжелой цепи. Серия праймеров 7 содержит мутантный сайт в CDR3, и всего в нее входит 22 праймера, перечисленных в Таблице 4. Из полученной в итоге библиотеки мутагенеза для легких и тяжелых цепей Fab выбирали Fab гуманизированного антитела к ФНО-α с более высокой способностью связывания антигена ФНО-α («R&D Co.») на основании результатов ELISA. Скрининг мутантов тяжелых цепей для получения двух вариабельных областей тяжелых цепей с более высокой активностью, а именно SH01 и SH02; и скрининг мутантов легких цепей для получения шести вариабельных областей легких цепей с более высокой активностью, а именно SH03, SH04, SH05, SH06, SH07 и SH08.

Таблица 3 Серия праймеров 5 для сайт-направленного мутагенеза в CDR3 легкой цепи Обозначение Последовательность Праймер 5-1Q1 GCAACCTACTACTGCNBKCAGAGCCATAGCTGG Праймер 5-1Q2 GCAACCTACTACTGCDAKCAGAGCCATAGCTGG Праймер 5-1Q3 GCAACCTACTACTGCCATCAGAGCCATAGCTGG Праймер 5-2Q1 GCAACCTACTACTGCCAGNBKAGCCATAGCTGGCCG Праймер 5-2Q2 GCAACCTACTACTGCCAGDAKAGCCATAGCTGGCCG Праймер 5-2Q3 GCAACCTACTACTGCCAGCATAGCCATAGCTGGCCG Праймер 5-3S1 GCAACCTACTACTGCCAGCAGBDKCATAGCTGGCCGTTC Праймер 5-3S2 GCAACCTACTACTGCCAGCAGVCTCATAGCTGGCCGTTC Праймер 5-3S3 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAWKCATAGCTGGCCGTTC Праймер 5-4Н1 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCNBKAGCTGGCCGTTCACC Праймер 5-4Н2 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCDAKAGCTGGCCGTTCACC Праймер 5-4Н3 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCAGAGCTGGCCGTTCACC Праймер 5-5S1 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATBDKTGGCCGTTCACCTTC Праймер 5-5S2 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATVCTTGGCCGTTCACCTTC Праймер 5-5S3 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAWKTGGCCGTTCACCTTC Праймер 5-6W1 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCHNKCCGTTCACCTTCGGC Праймер 5-6W2 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCHGTCCGTTCACCTTCGGC Праймер 5-6Р1 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCTGGNDKTTCACCTTCGGCAGC Праймер 5-6Р2 GCAACCTACTACTGCCAGCAGAGCCATAGCTGGDCTTTCACCTTCGGCAGC

Таблица 4 Серия праймеров 7для сайт-направленного мутагенеза в CDR3 тяжелой цепи Обозначение Последовательность Праймер 7-1N1 GTATTACTGCAGCCGTNBKTACTACGGCAGCACC Праймер 7-1N2 GTATTACTGCAGCCGTBAKTACTACGGCAGCACC Праймер 7-1N3 GTATTACTGCAGCCGTAAATACTACGGCAGCACC Праймер 7-2Y1 GTATTACTGCAGCCGTAATNBKTACGGCAGCACCTACG Праймер 7-2Y2 GTATTACTGCAGCCGTAATVAKTACGGCAGCACCTACG Праймер 7-3Y1 GTATTACTGCAGCCGTAATTACNBKGGCAGCACCTACGATTAC Праймер 7-3Y2 GTATTACTGCAGCCGTAATTACVAKGGCAGCACCTACGATTAC Праймер 7-4G1 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACNHKAGCACCTACGATTACTG Праймер 7-4G2 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACHGKAGCACCTACGATTACTG Праймер 7-5S1 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCBDKACCTACGATTACTGGGC Праймер 7-5S2 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCVCTACCTACGATTACTGGGC Праймер 7-5S3 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAWKACCTACGATTACTGGGC Праймер 7-6Т1 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCNDKTACGATTACTGGGCCC Праймер 7-6Т2 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCBCTTACGATTACTGGGCCC Праймер 7-7Y1 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCNBKGATTACTGGGGCCAGG Праймер 7-7Y2 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCVAKGATTACTGGGGCCAGG Праймер 7-8D1 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACNBKTACTGGGGCCAGGGC Праймер 7-8D2 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACHAKTACTGGGGCCAGGGC Праймер 7-8D3 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGAATACTGGGGCCAGGGC Праймер 7-9Y1 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGATNBKTGGGGCCAGGGCACC Праймер 7-9Y2 GTATTACTGCAGCCGTAATTACTACGGCAGCACCTACGATVAKTGGGGCCAGGGCACC

Пример 3: Экспрессия Fab гуманизированного антитела к ФНО-α с высоким сродством и анализ активности

Данный пример относится к двум Fab гуманизированного антитела к ФНО-α, которые обозначают FA01 и FA02, соответственно. Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи FA01 показана в SEQ ID №:15 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:16 в перечне последовательностей), а последовательность аминокислот константной области легкой цепи показана в SEQ ID №:19 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:20 в перечне последовательностей), последовательность аминокислот вариабельной области фрагмента Fd ее тяжелой цепи показана в SEQ ID №:1 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:2 в перечне последовательностей), а последовательность аминокислот константной области тяжелой цепи CH1 показана в SEQ ID №:33 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:34 в перечне последовательностей). Последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи FA02 показана в SEQ ID №:9 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:10 в перечне последовательностей), последовательность аминокислот константной области ее легкой цепи показана в SEQ ID №:19 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:20 в перечне последовательностей), последовательность аминокислот вариабельной области фрагмента Fd тяжелой цепи показана в SEQ ID №:1 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:2 в перечне последовательностей), последовательность аминокислот константной области легкой цепи ее CH1 показана в SEQ ID №:33 в перечне последовательностей (ее последовательность нуклеотидов показана в SEQ ID №:34 в перечне последовательностей).

1. Конструирование и экспрессия Fab гуманизированного антитела к ФНО-α с высоким сродством

Способ конструирования двух Fab указанного гуманизированного антитела к ФНО-α был аналогичен способу в примере 1. ДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи двух Fab гуманизированного антитела к ФНО-α, упоминаемых выше, по отдельности встраивали в соответствующие сайты в векторе pTLR, получая векторы экспрессии pFA01Fab для FA01 и pFA02Fab для FA02. Белки FA01 и FA02 с более высокой степенью чистоты получали в соответствии с протоколом, приведенным в примере 1.

2. Определение биологической активности Fab гуманизированного антитела к ФНО-α с высоким сродством

При помощи эксперимента с цитотксичностью L929 два Fab гуманизированного антитела к ФНО-α (FA01 и FA02), упоминаемые выше, анализировали с целью оценки биологической активности. Более подробно, способ совпадал со способом, описанным в примере 1. Получаемые в результате значения OD450 вводили в программу GraphPad Prism 5 и рассчитывали EC₅₀. Результаты приведены в таблице 5, и они показывают, что активность FA01 и FA02 более высокая, чем активность у фрагмента Fab антитела Ремикейд.

Таблица 5 Биологическая активность гуманизированных Fab в отношении нейтрализации ФНО-α Группа EC₅₀ (нМ) Fab Ремикейда 3,184 FA01 2,582 FA02 2,870 Примечание: Данные в таблице 5 представлены как средние значения для трехкратных экспериментов.

Пример 4: Экспрессия IgG гуманизированного антитела к ФНО-α и определение его активности

1. Конструирование рекомбинантного вектора экспрессии IgG гуманизированного антитела к ФНО-α

Фрагменты ДНК, кодирующие два указанных фрагмента Fd тяжелых цепей (включая SH01 и SH02 соответственно) и шести легких цепей (включая SH03, SH05, SH04, SH06, SH07 и SH08, соответственно), полученные в примере 1 и 2, взаимно совмещали таким образом, как показано в таблице 6, собирая их вместе с фрагментом ДНК для константной области Fc IgG1 посредством ПЦР с перекрывающимся удлинением, затем встраивали в плазмиду экспрессии pcDNA3.1(+) посредством рекомбинации. Сконструированными таким образом плазмидами экспрессии трансфецировали клетки CHO, и экспрессировали полноразмерные гуманизированные антитела.

Более подробно протокол можно представить следующим образом: (1) фрагменты ДНК для указанных легких цепей встраивали непосредственно в вектор экспрессии эукариот pcDNA3.1(+) путем рекомбинации. Были разработаны следующие праймеры 5′-TGAAAGCTTATGGAAATTGTGCTGACTCAGTCTC-3′ (подчеркнут сайт рестрикции HindIII); 5′-AATCTCGAGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3′ (подчеркнут сайт рестрикции XhoI), и их применяли при амплификации посредством ПЦР. Амплифицированные продукты подвергали двойному расщеплению с участием рестриктаз HindIII (R0104L, продукт компании «NEB Co.») и XhoI (R0146L, продукт компании «NEB Со.»), сшивали с крупными фрагментами pcDNA3.1(+), которые подвергли двойному расщеплению с участием ДНК-лигазы Т4. (2) фрагменты ДНК для указанных тяжелых цепей требовалось собрать вместе с фрагментом ДНК для константной области Fc IgG1 посредством ПЦР с перекрывающимся удлинением, и их встраивали в pcDNA3.1 (+) посредством рекомбинации. 5′-ACTGGTACCATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGG-3′ (подчеркнут сайт рестрикции KpnI); 5′-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3′; 5′-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCGGAGCTCACGGTCAGGGTGGTGCCC-3′; 5′-AATCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3′ (подчеркнут сайт рестрикции XhoI). Собранные вместе продукты ПЦР подвергали двойному расщеплению с участием рестриктаз KpnI (R0142L, продукт компании «NEB Co.») и XhoI (R0146L, продукт компании «NEB Co.»), затем встраивали в плазмиду экспрессии pcDNA3.1 (+), которую подвергли двойному расщеплению с участием тех же ферментов, посредством рекомбинации, и идентифицировали посредством рестрикционного анализа и секвенирования, получая нужные рекомбинанты.

Векторы экспрессии для 18 антител в таблице 7 получали согласно способу, описанному выше. Все последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей KS01 (Glu), KS03 (Glu), KS05 (Glu), KS06 (Glu), KS09 (Glu) и KS10 (Glu) показаны в SEQ ID №:2 в перечне последовательностей (последовательность нуклеотидов в положениях 1-3 является GAG), и кодируют вариабельные области тяжелых цепей, показанные в SEQ ID №:1 (первой аминокислотой является Gln); все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелых цепей KS01 (Gln), KS03 (Gln), KS05 (Gln), KS06 (Gln), KS09 (Gln) и KS10 (Gln), показаны в SEQ ID №:2 в перечне последовательностей, в которой последовательность нуклеотидов в положении 1-3 была заменена на CAG, и кодируют вариабельные области тяжелых цепей, показанные в SEQ ID №:1 (первой аминокислотой является Gln); все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области тяжелых цепей KS02, KS04, KS07, KS08, KS11 и KS12, показаны в SEQ ID №:4 в перечне последовательностей и кодируют вариабельные области тяжелых цепей, показанные в SEQ ID №:3; все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области легких цепей KS01 (Glu), KS01 (Gln) и KS02, показаны в SEQ ID №:6 в перечне последовательностей и кодируют вариабельные области легких цепей, показанные в SEQ ID №:5; все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области легких цепей KS03 (Glu), KS03 (Gln) и KS04, показаны в SEQ ID №:10 в перечне последовательностей и кодируют вариабельные области легких цепей, показанные в SEQ ID №:9; все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области легких цепей KS05 (Glu); KS05 (Gln) и KS08, показаны в SEQ ID №:8 в перечне последовательностей и кодируют вариабельные области легких цепей, показанные в SEQ ID №:7; все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области легких цепей KS06 (Glu), KS06 (Gln) и KS07 показаны в SEQ ID №:12 в перечне последовательностей и кодируют вариабельные области легких цепей, показанные в SEQ ID №:11; все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области легких цепей KS09 (Glu), KS09 (Gln) и KS11, показаны в SEQ ID №:14 в перечне последовательностей и кодируют вариабельные области легких цепей, показанные в SEQ ID №:13; все из последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области легких цепей KS10 (Glu), KS10 (Gln) и KS12, показаны в SEQ ID №:16 в перечне последовательностей и кодируют вариабельные области легких цепей, показанные в SEQ ID №:15. Последовательность ДНК, кодирующая константную область тяжелой цепи восемнадцати указанных антител, показана в SEQ ID №:18 в перечне последовательностей, и кодирует константную область тяжелой цепи, показанную в SEQ ID №:17; последовательность ДНК, кодирующая константную область тяжелой цепи восемнадцати указанных антител, показана в SEQ ID №:20 в перечне последовательностей, и кодирует константную область легкой цепи, показанную в SEQ ID №:19.

2. Экспрессия и очистка полноразмерного IgG гуманизированного антитела к ФНО-α

Рекомбинантные плазмиды для легкой цепи и рекомбинантные пламиды для тяжелой цепи, полученные на 1 этапе, совместно трансфецировали в клетки CHO, чтобы экспрессировать полноразмерные гуманизированные антитела. После совместной стабильной трансфекции сочетания соответствующих плазмид, как показано в таблице 6, в клетки CHO при помощи традиционных способов, в надосадочную жидкость питательной среды секретировались двенадцать соответствующих рекомбинантных полноразмерных антител. Указанную надосадочную жидкость очищали, получая соответствующий IgG полноразмерных антител. Более подробно, этапы очистки были следующие:

1) Наполнитель для хроматографирования

Mabselect Sure (продукт компании «GE Co.»), Супердекс 200 (продукт компании «GE Со.»)

2) Буфер

Равновесный буфер для аффинной хроматографии (ФСБ): 0,2 М вторичный кислый фосфат натрия: 82,5 мл/л 0,2 М первичного кислого фосфата натрия: 17,5 мл/л хлорида натрия; 2М хлорид натрия: 75 мл/л; добавляют воды сверхвысокой чистоты, полностью перемешивают и тщательно смешивают, корректируют pH 1 М гидроксидом натрия или 1М соляной кислотой до 7,1-7,3.

Элюирующий буфер для аффинной хроматографии: NaCl 2,922 г/л, безводного натрия ацетата 0,49 г/л, добавляют 2,9 мл/л ледяной уксусной кислоты, pH 3,4-3,6.

Регенерирующий буфер для аффинной хроматографии: 5,8 мл/л ледяной уксусной кислоты, pH 3,0.

Буфер для очистки на месте (CIP) для аффинной хроматографии: 1М гидроксид натрия 100 мл/л.

Раствор для гельфильтрации (ФСБ): 0,2 М вторичный кислый фосфат натрия: 82,5 мл/л; 0,2 М первичного кислого фосфата натрия: 17,5 мл/л хлорида натрия; 2М хлорид натрия: 75 мл/л; добавляют воды сверхвысокой чистоты, полностью перемешивают и тщательно смешивают, корректируют pH 1 М гидроксидом натрия или 1М соляной кислотой до 6,8.

3) Приготовление пробы (осветляющее фильтрование)

Центрифугирование: указанную пробу центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 10-15 мин.

Фильтрация: после центрифугирования, надосадочную жидкость из указанной пробы фильтровали при помощи фильтра Н7 (0,45+0,2 мкм).

4) Аффинная хроматография

Устанавливают систему очистки AKTA и колонку для аффинной хроматографии (Mabselect или Mabselect Sure). Промывают 2 объемами колонки сверхчистой воды. Промывают 5 объемами колонки равновесного буфера для аффинной хроматографии до тех пор, пока исходный уровень не станет стабильным, и вводят пробу. После введения пробы промывают 5-10 объемами колонки равновесного буфера для аффинной хроматографии. Затем проводят десорбцию содержимого колонки элюирующим буфером для аффинной хроматографии, фракции, соответствующие главному пику поглощения на 280 нм, отбирают, проводят дальнейшую десорбцию 1 объемом колонки. Проводят десорбцию содержимого колонки 3 объемами колонки регенерирующего буфера для аффинной хроматографии. Промывают равновесным буфером для аффинной хроматографии до нейтральной pH. Проводят очистку на месте 5 объемами колонки буфера Mabselect CIP buffer или Mabselect Sure CIP. Промывают 3 объемами колонки равновесного буфера для аффинной хроматографии до тех пор, пока исходный уровень не станет стабильным. Промывают 3 объемами колонки сверхчистой воды до тех пор, пока исходный уровень не станет стабильным. Промывают 3 объемами колонки 20% этанола и хранят колонку для аффинной хроматографии.

5) Гельфильтрация

Устанавливают систему очистки AKTA с анализатором и колонку для гельфильтраций Superdex 200. Корректируют скорость потока до 5 мл/мин, промыть 1 объемом колонки сверхчистой воды и промывают 2 объемами колонки равновесным раствором для Superdex 200. Корректируют скорость потока до 2,5 мл/мин, в отобранных фракциях, соответствующих пикам аффинной хроматографии, корректируют pH и проводят их введение прямо в указанную колонку. После введения пробы проводят десорбцию содержимого колонки равновесным раствором для Superdex 200, и отбирают рассматриваемый пик на 280 нм. Продолжают промывать 1 объемом колонки. Указанную хроматографическую колонку хранят с 0,01 М NaOH.

3. Определение активности IgG гуманизированного антитела к ФНО-α

12 IgG гуманизированных антител к ФНО-α, полученных на 2 этапе, подвергали тестированию, чтобы определить их биологическую активность в отношении нейтрализации ФНО-α в эксперименте с цитотоксичностью L929 (подробно манипуляции описаны в примере 1), получали итоговые значения OD₄₅₀, и их вводили в программу GraphPad Prism 5 для расчета EC₅₀. Значения EC₅₀ для двенадцати указанных IgG гуманизированных антител к ФНО-α, показывающих подавление биологической активности ФНО-α, приведены в таблице 7. Полученные результаты показывают, что биологическая активность указанных гуманизированных антител к ФНО-α существенно повышена, и что KS10 обладает самой высокой активностью. Таким образом, дальнейшее исследование активности антител проводили главным образом в отношении KS10.

Таблица 6 Гуманизированные антитела к ФНО-α с высоким сродством Антитело IgG VH VK KS01 SH01 SH03 KS02 SH02 SH03 KS03 SH01 SH05 KS04 SH02 SH05 KS05 SH01 SH04 KS06 SH01 SH06 KS07 SH02 SH06 KS08 SH02 SH04 KS09 SH01 SH07 KS10 SH01 SH08 KS11 SH02 SH07 KS12 SH02 SH08

Таблица 7 Биологическая активность полноразмерного гуманизированного антитела к ФНО-α в отношении нейтрализации ФНО-α Группа ЕС₅₀ (нМ) KS01 (Glu) 0,081 KS01 (Gln) 0,087 KS02 0,109 KS03 (Glu) 0,087 KS03 (Gln) 0,093 KS04 0,126 KS05 (Glu) 0,051 KS05 (Gln) 0,064 KS06 (Glu) 0,059 KS06 (Gln) 0,068 KS07 0,100 KS08 0,113 KS09 (Glu) 0,036 KS09 (Gln) 0,032 KS10 (Glu) 0,028 KS10 (Gln) 0,025 KS11 0,059 KS12 0,136 Remicade 0,174

Пример 5 Кинетический анализ связывания KS10 (Glu) с чФНО-α

чФНО-α («R&D Co.», 210-TA-050) и NHS-LCLC-биотин (каталожный номер: 21338, приобретенный у компании «Thermo-fisher Co.») смешивали до однородного состояния в соотношении 1:3 и хранили при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем оставшийся NHS-LCLC-биотин удаляли при помощи обессоливающей колонки PD-10 (каталожный номер: 17-0851-01, приобретенной у компании «GE Со.»). Итоговые продукты конъюгации включали 50 мкг/мл биотин-чФНО-α.

Кинетические параметры связывания KS10 с чФНО-α определяли при помощи системы Octet RED 96 («ForteBio Co.») на технологической платформе Octet, причем экспериментальный способ настраивали в соответствии с инструкцией по эксплуатации указанного инструмента. 50 мкг/мл биотин-чФНО-α связывался с биосенсором на основе стрептавидина (SA) посредством загрузки; соответствующий диапазон концентраций указанного антитела определяли в пробном испытании, и он составил: 6000 нМ, 2000 нМ, 666,7 нМ, 222,2 нМ, 74,1 нМ и 24,7 нМ. В качестве положительного контроля применяли Ремикейд, а в качестве пустой пробы применяли ФСБ (pH 7,4). Результат (в таблице 8) показывает, что значение KD (константы диссоциации) KS10 меньше, чем у Ремикейда, что указывает на то, что сродство KS10 к чФНО-α выше, чем сродство химерного антитела человека-мыши - Ремикейда.

Кроме того, определяли сродство связывания KS10 с ФНО-α шимпанзе (с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №:36 и последовательностью нуклеотидов, показанной в SEQ ID №:37), макаки-резус (с последовательностью аминокислот, показанной SEQ ID №:38 и последовательностью нуклеотидов, показанной в SEQ ID №:39), мыши (мФНО-α) (каталожный номер: CYT-252, приобретаемого у компании «PROSPEC») и ФНО-β человека (каталожный номер: CYT-224, приобретаемого у компании «PROSPEC»). В соответствии с критериями оценки сродства, заложенными в системе Octet RED 96, расстояние замены световой волны вследствие связывания антигена с антителом косвенно отражает сродство между двумя веществами, и чем больше расстояние замены световой волны, тем выше сродство. Результат (Фиг.3) показывает, что KS10 очень сильно связывается с ФНО-α человека, также значительно связывается с ФНО-α шимпанзе, слабо связывается с ФНО-α макаки-резус, непрочно с ФНО-α мыши и с ФНО-β человека. Следовательно, подтверждено, что антитела, предложенные в настоящем изобретении, обладают способностью к специфическому связыванию после гуманизации.

Таблица 8 кинетические параметры связывания KS10 с чФНО-α Класс антитела KD (M) kon (l/Ms) kdis (l/s) Ремикейд 8,12Е-12 1,95Е+04 1,58Е-07 KS10 2,18Е-12 4,69Е+04 1,02Е-07 Примечание: KD - константа сродства; kon - константа связывания; a kdis - константа диссоциации.

Пример 6: Эффект KS10 (Glu) на индуцированный ФНО-α человека ревматоидный артрит в модели на крысах

Применяли семьдесят две крысы Спраг-Доули (лицензия на работу с лабораторными животными: SCXK (Sichuan) 2008-24) в возрасте 4-6 недель, степени SPF, половина из которых были самки, а половина - самцы, с массой тела 140-180 г. Указанных крыс подвергали акклиматизации в течение одной недели, а затем рандомизировали в шесть групп по 12 крыс на группу, а именно, группа здоровых крыс, группа отрицательного контроля, группа контроля модели, группа, получающая 5 мг/кг KS10, группа, получающая 10 мг/кг KS10, и группа, получающая 20 мг/кг KS10. В начале эксперимента крыс каждой группы подвергали анестезии при помощи 10% хлоральгидрата (350 мг/кг), за исключением крыс здоровой группы. Перед получением модели крысам из групп, получающих лекарственный препарат, через хвостовую вену вводили три разных дозы KS10 (5 мг/кг, 10 мг/кг и 20 мг/кг), а крысам из группы отрицательного контроля и группы контроля модели вводили в хвостовую вену эквивалентные объемы физиологического раствора. Через пятнадцать минут вводили 0,5 мг/мл чФНО-α («R&D Co.», каталожный номер 210-ТА-050) (растворенный в 1% БСА, с вводимым объемом 60 мкл/крысу) вводили при помощи шприца на объем 1 мл в суставную полость левого голеностопного сустава крыс из трех групп, получавших KS10, и крысам из группы контроля модели, чтобы индуцировать острый артрит (моделирование в одной стопе), а крысам из группы отрицательного контроля в суставную полость левого голеностопного сустава вводили эквивалентный объем 1% БСА. На успешность инъекции указывал постепенно развивающийся отек с обеих сторон на впадинах суставной полости. Крыс из здоровой группы не подвергали никаким указанным выше инъекциям.

Через 18 часов после создания указанной модели степень отека левого голеностопного сустава крыс в каждой группе оценивали индивидуально в баллах в соответствии с модифицированными критериями оценки 0-4, следующим образом: 0: нет покраснения и отека; 1: покраснение и/или отек только в голеностопном суставе; 2: покраснение и/или отек в голеностопном суставе и отек подошвы стопы; 3: покраснение и/или отек в голеностопном суставе и на подошве; 4: покраснение и/или отек в голеностопном суставе, на подошве и на поверхности стопы [Ссылка: R О Williams, M Feldmann, и R N Maini. Anti-tumor necrosis factor ameliorates joint disease in murine collagen-induced arthritis. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 October 15; 89 (20): 9784-9788]. Через 20 часов после создания указанной модели отбирали синовиальную жидкость из сустава. Мягкие ткани, окружающие указанный сустав, отделяли, гомогенизировали, центрифугировали и замораживали вместе при -70°C. Уровень IL-1β и IL-6 определяли при помощи набора на основе ELISA (IL-1β приобретен у компании «R&D Co.», каталожный номер: RLB00; IL-6 приобретен у компании «R&D Co.», каталожный номер: R6000B).

На основании баллов (Фигура 4) показано, что три указанные дозы KS10 могут существенно облегчать вызываемые чФНО-α покраснение и отек суставов у крыс и в значительной степени противодействовать развитию вызываемого чФНО-α ревматоидного артрита. В пробе с указанными цитокинами показано, что три указанные дозы KS10 могут значительно снижать уровень IL-1β (Фиг.5) и IL-6 (Фиг.6) в синовиальной жидкости и в мягких тканях, окружающих сустав, что указывает на то, что KS10 может полностью блокировать повышение уровня IL-1β и IL-6, вызываемое ФНО-α, и служит прямым доказательством действия KS10 против ФНО-α человека.

Пример 7: Терапевтический эффект KS10 (Glu) на увеит, вызываемый ФНО-α человека, в модели на крысах

40 здоровых крыс линии Льюис рандомизировали в нормальную группу, модельную группу, группу отрицательного контроля и группу, получающую KS10. Указанным крысам вводили внутрибрюшинно 10% хлоральгидрат (доза - 0,35 мг/кг). После проведения анестезии крысам вводили 10 мкл физиологического раствора (при помощи иглы 30 G1/2) в стекловидное тело через плоскую часть ресничной мышцы каждой крысе из группы контроля модели и группы отрицательного контроля, 10 мкл раствора KS10 в концентрации 4 мг/мл (в смеси с ФСБ) вводили тем же путем каждой крысе из группы KS10. Через тридцать минут каждой крысе из группы контроля модели и группы KS10 в стекловидное тело вводили 10 мкл чФНО-α (приблизительно 0,5 мг/мл), а каждой крысе в группе отрицательного контроля в стекловидное тело вводили 10 мкл 1% БСА. Через 24 часа и 48 часов после создания указанной модели путем первого введения крыс подвергали анестезии, проводили обследование под щелевой лампой, и оценивали в баллах, соответственно. Критерии оценки были заимствованы из литературы [Fleisher LN, Ferrell JB, Smith MG, McGahan MC. Lipid mediators of tumor necrosis factor-α-induced uveitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1991 Jul; 32 (8): 2393-9.] и несколько пересмотрены: 0-2: гиперемия радужной оболочки 0-2 (0: нет гиперемии, 1: легкая гиперемия; 2: тяжелая гиперемия); сужение зрачка 0-1 (0: нормальный зрачок; 1: суженный зрачок); экссудация в передней камере 0-2 (0: нет экссудации в передней камере; 1: легкая экссудация в передней камере; 2: сильная экссудация в передней камере), замутнение зрачка или задняя синехия 0-2 (0: нет синехии; 1: синехия в одном из участков; 2: синехия в обоих участках).

Результат оценки в баллах показан в таблице 9 и указывает на то, что KS10 может значительно снижать балл по критериям оценки увеита, что соответствует уменьшению гиперемии радужной оболочки, экссудации фибрина и помутнения зрачка или задней синехии, повышению прозрачности внутриглазных сред. Таким образом, было показано, что KS10 проявляет значительное антагонистическое действие в отношении вызываемого чФНО-α увеита.

Таблица 9 Баллы, соответствующие лечебному действию KS10 на вызываемый ФНО-α человека увеит в модели на крысах Группа Время после создания модели путем первого введения 24 ч 48 ч Здоровая 0,88±0,834 0,38±0,518 Отрицательный контроль 0,90±0,737 0,38±0,744 Модель 3,5±0,971 3,78±1,202 KS10 2,5±0,971* 1,55±2,422* Примечание: * указывает *P<0,05, по сравнению с модельной группой $$\left(\overline{X}\pm SD,n=10\right)$$

Промышленное применение

За счет мутагенеза антитела с привитыми CDR настоящее изобретение позволяет эффективно преодолеть тот недостаток, что сродство антитела обычно нарушается при традиционном способе гуманизации антитела (при котором гипервариабельную область (CDR) вариабельной области полученного от мыши антитела (VH, VK) напрямую прививают в каркасную область антитела человека), и в итоге получают гуманизированное антитело, сходное с исходным антителом. Fab и антитела IgG, предложенные в настоящем изобретении, обладает значительно повышенной степенью гуманизации (до 95% и выше) и экспериментально подтверждено, что они обладают сродством и биологической активностью, близкими или даже превышающими сродство и биологическую активность, химерного антитела человека-мыши Ремикейда, более выраженным нейтрализующим действием на ФНО-α человека и более эффективны при лечение заболеваний, ассоциированных с ФНО-α, предпочтительно ревматоидного артрита, аутоиммунного увеита, болезни Крона, бляшечного псориаза, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, язвенного колита или юношеского идиопатического артрита.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к гуманизированному антителу к фактору некроза опухоли опухоли-α или его антигенсвязывающему фрагменту Fab. Также раскрыты ген, кодирующий белок антитела или Fab, генетический материал, экспрессирующий указанное антитело или Fab-фрагмент. Раскрыты применение антитела или Fab для получения лекарственного средства для профилактики или лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли опухоли-α человека, и фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли опухоли-α человека, содержащая эффективное количество вышеуказанного антитела или Fab. Изобретение обладает сниженным иммунным ответом, по сравнению с фармацевтическим антителом Ремикейд, что позволяет эффективно лечить заболевания, ассоциированные с фактором некроза опухоли опухоли-α человека. 7 н. и 16 з.п. ф-лы, 5 ил., 9 табл., 7 пр.

1. Гуманизированное антитело к фактору некроза опухоли-α человека или антигенсвязывающий фрагмент Fab указанного антитела, для связывания с фактором некроза опухоли-α человека, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 1 или 3 в перечне последовательностей; последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи показана в SEQ ID №: 15, 9, 11, 7, 13 и 5 в перечне последовательностей, и первым остатком аминокислоты последовательности SEQ ID №: 1 является Glu или Gln.

2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что указанное антитело является одним из следующих а)-1):
a) KS10, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи SH08 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 15;
b) KS03, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи SH05 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 9;
c) KS06, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи SH06 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 11;
d) KS12, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 3, и вариабельную область легкой цепи SH08 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 15;
e) KS04, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 3, и вариабельную область легкой цепи SН05 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 9;
f) KS07, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 3, и вариабельную область легкой цепи SH06 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 11;
g) KS02, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 3, и вариабельную область легкой цепи SH03 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 5;
h) KS08, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 3, и вариабельную область легкой цепи SH04 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 7;
i) KS11, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH02 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 3, и вариабельную область легкой цепи SH07 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 13;
j) KS01, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи SH03 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 5;
k) KS05, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи SН04 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 7;
l) KS09, содержащее вариабельную область тяжелой цепи SH01 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи SH07 с последовательностью аминокислот, показанной в SEQ ID №: 13;
причем первым остатком аминокислоты в SEQ ID №: 1 является Glu или Gln.

3. Антитело по п. 1 или 2, отличающееся тем, что указанное антитело состоит из тяжелой цепи, в которой последовательность аминокислот константной области идентична последовательности аминокислот константной области тяжелой цепи антитела человека, и легкой цепи, в которой последовательность аминокислот константной области идентична последовательности аминокислот константной области легкой цепи антитела человека.

4. Антитело по п. 3, отличающееся тем, что последовательность аминокислот константной области указанной тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 17 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот константной области указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 19 в перечне последовательностей.

5. Антитело по п. 3, отличающееся тем, что последовательность аминокислот указанной тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 21 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 23 в перечне последовательностей, причем первым остатком аминокислоты в SEQ ID №: 21 является Glu или Gln.

6. Fab по п. 1, отличающийся тем, что указанный Fab состоит из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из вариабельной области указанной тяжелой цепи и константной области СН1 тяжелой цепи, а также легкой цепи, состоящей из вариабельной области указанной легкой цепи и константной области легкой цепи, причем последовательность аминокислот указанной СН1 идентична СН1 константной области тяжелой цепи антитела человека, а последовательность аминокислот указанной константной области легкой цепи идентична последовательности константной области легкой цепи антитела человека.

7. Fab по п. 6, отличающийся тем, что последовательность аминокислот указанной СН1 показана в SEQ ID №: 33 в перечне последовательностей, и последовательность аминокислот константной области в указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 19 в перечне последовательностей.

8. Fab по п. 6, отличающийся тем, что указанный Fab является одним из следующих b1)-b3):
b1) KS-7F: последовательность аминокислот указанного фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 27 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 31 в перечне последовательностей;
b2) KS-7A: последовательность аминокислот указанного фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 25 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 31 в перечне последовательностей;
b3) KS-2E: последовательность аминокислот указанного фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 25 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 29 в перечне последовательностей.

9. Антигенсвязывающий фрагмент Fab гуманизированного антитела к фактору некроза опухоли-α человека, содержащий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем последовательность аминокислот указанной вариабельной области тяжелой цепи соответствует положениям 1-120 в SEQ ID №: 27 или положениям 1-120 в SEQ ID №: 25 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной вариабельной области легкой цепи соответствует положениям 1-109 в SEQ ID №: 31 или положениям 1-109 в SEQ ID №: 29 в перечне последовательностей.

10. Fab по п. 9, отличающийся тем, что указанный Fab состоит из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из вариабельной области указанной тяжелой цепи и константной области СН1 тяжелой цепи, а также легкой цепи, состоящей из вариабельной области указанной легкой цепи и константной области легкой цепи, причем последовательность аминокислот указанной СН1 идентична СН1 константной области тяжелой цепи антитела человека, а последовательность аминокислот указанной константной области легкой цепи идентична последовательности константной области легкой цепи антитела человека.

11. Fab по п. 10, отличающийся тем, что последовательность аминокислот указанной СН1 показана в SEQ ID №: 33 в перечне последовательностей, и последовательность аминокислот константной области в указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 19 в перечне последовательностей.

12. Fab по п. 10, отличающийся тем, что указанный Fab является одним из следующих b1)-b3):
bl) KS-7F: последовательность аминокислот указанного фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 27 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 31 в перечне последовательностей;
b2) KS-7A: последовательность аминокислот указанного фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 25 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 31 в перечне последовательностей;
b3) KS-2E: последовательность аминокислот указанного фрагмента тяжелой цепи показана в SEQ ID №: 25 в перечне последовательностей, а последовательность аминокислот указанной легкой цепи показана в SEQ ID №: 29 в перечне последовательностей.

13. Ген, кодирующий любой из следующих белков А)-В), представленных ниже:
A) антитело по любому из пп. 1-5;
B) Fab по любому из пп. 1 и 6-12;

14. Ген по п. 13, отличающийся тем, что последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей антител по любому из пп. 1-5, показаны в SEQ ID №: 2 или 4 в перечне последовательностей; последовательности, кодирующие вариабельные области легких цепей антител по любому из пп. 1-5, показаны в любом из SEQ ID №: 16, 10, 12, 8, 14 и 6 в перечне последовательностей;
последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей Fab по любому из пп. 1 и 6-12, соответствуют положениям 1-360 в любой из последовательностей SEQ ID №: 2, 4, 28 и 26 в перечне последовательностей; последовательности, кодирующие вариабельные области легких цепей Fab по любому из пп. 1 и 6-12, соответствуют положениям 1-327 в любой из последовательностей SEQ ID №: 16, 10, 12, 8, 14, 6, 32 и 30 в перечне последовательностей.

15. Ген по п. 13 или 14, отличающийся тем, что последовательность, кодирующая константную область тяжелой цепи указанного антитела, показана в SEQ ID №: 18 в перечне последовательностей, а последовательность, кодирующая константную область легкой цепи указанного антитела, показана в SEQ ID №: 20 в перечне последовательностей;
последовательность, кодирующая CHI указанного Fab, показана в SEQ ID №: 34 в перечне последовательностей; а последовательность, кодирующая константную область легкой цепи указанного Fab, показана в SEQ ID №: 20 в перечне последовательностей.

16. Ген по п. 13 или 14, отличающийся тем, что последовательность, кодирующая тяжелую цепь указанного антитела, показана в SEQ ID №: 22 в перечне последовательностей, а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного антитела, показана в SEQ ID №: 24 в перечне последовательностей;
при этом последовательность, кодирующая Fab по любому из пп. 6-12 является одной из следующих c1)-с3):
cl) KS-7F: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab, показана в SEQ ID №: 28 в перечне последовательностей, а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №: 32 в перечне последовательностей;
с2) KS-7A: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab, показана в SEQ ID №: 26 в перечне последовательностей, а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №: 32 в перечне последовательностей;
с3) KS-2E: последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи указанного Fab, показана в SEQ ID №: 26 в перечне последовательностей, а последовательность, кодирующая легкую цепь указанного Fab, показана в SEQ ID №: 30 в перечне последовательностей.

17. Генетический материал для экспрессии указанного антитела или Fab-фрагмента, такой как описан далее: рекомбинантный вектор, рекомбинантная бактерия, рекомбинантная линия клеток; рекомбинантный вирус или кассета экспрессии, содержащие ген по любому из пп. 13-16.

18. Генетический материал по п. 17, отличающийся тем, что указанным рекомбинантным вектором является вектор экспрессии у прокариот или эукариот для экспрессии указанного Fab или антитела; указанной рекомбинантной бактерией является Escherichia coli, содержащая указанный ген; указанной рекомбинантной линией клеток является линия клеток млекопитающих, в которые трансфецировали указанный ген, предпочтительно линия клеток СНО (яичника китайского хомячка), или клетки 293 и их сублинии; рекомбинантным вирусом является рекомбинантный аденовирус или рекомбинантный адено-ассоциированный вирус, содержащий указанный ген.

19. Применение антитела по любому из пп. 1-5, или Fab по любому из пп. 1 и 6-12, или гена по любому из пп. 13-16, или генетического материала по п. 17 или 18 для получения лекарственного средства для профилактики или лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли-α человека.

20. Применение по п. 19, отличающееся тем, что указанным заболеванием, ассоциированным с фактором некроза опухоли-α человека, является заболевание, вызванное повышением уровня фактора некроза опухоли-α человека, предпочтительно ревматоидный артрит, аутоиммунный увеит, болезнь Крона, бляшечный псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит или юношеский идиопатический артрит.

21. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли-α человека, содержащая вспомогательные вещества и эффективное количество активных ингредиентов, причем указанные активные ингредиенты включают по меньшей мере одно из следующих веществ: антитело по любому из пп. 1-5, или Fab по любому из пп. 1 и 6-12, или ген по любому из пп. 13-16, и генетический материал по п. 17 или 18; а вспомогательным веществом является фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

22. Применение любого из следующих веществ для лечения заболеваний, ассоциированных с фактором некроза опухоли-α человека: антитело по любому из пп. 1-5, или Fab по любому из пп. 1 и 6-12, или ген по любому из пп. 13-16, и генетический материал по п. 17 или. 18; и фармацевтическая композиция по п. 21.

23. Применение по п. 22, отличающееся тем, что указанным заболеванием, ассоциированным с фактором некроза опухоли-α человека, является заболевание, вызванное повышением уровня фактора некроза опухоли-α человека, предпочтительно ревматоидный артрит, аутоиммунный увеит, болезнь Крона, бляшечный псориаз, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язвенный колит или юношеский идиопатический артрит.