ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СУСПЕНЗИОННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2015 года по МПК C12N5/07 C12N5/02 C12R1/91 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток, в частности суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка.

Известна питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, содержащая натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат, противогрибковый препарат и дистиллированную воду (Патент РФ №2300563, Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, МПК C12N 5/06, Бюл. №16, 2007).

Однако известное техническое решение недостаточно эффективно.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения клеток млекопитающих при суспензионном их культивировании.

Поставленная задача решается в питательной среде для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, содержащей натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат, противогрибковый препарат и дистиллированную воду тем, что в качестве противогрибкового препарата содержит нистатин с активностью от 6×10⁴ до 6,5×10⁴ ЕД/л и дополнительно содержит холина хлорид и янтарную кислоту, причем бензилпенициллин натриевая соль используется с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵, а канамицина сульфат - с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵, при следующем содержании компонентов, г/л:

Нистатин с активностью от 6×10⁴ до 6,5×10⁴ ЕД/л 0,0098-0,0102 Бензилпенициллина натриевая соль с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵ 0,05-0,07 Канамицина сульфат с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵ Ед/л 0,14-0,16 Глюкоза 3,5-3,7 Кальций пантотенат 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,07 Калий хлористый 0,3-0,5 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,10-0,20 Кальций хлористый 0,26-0,30 Ферментативный гидролизат лактальбумина 1,15-1,30 Ферментативный гидролизат мышечных белков 1,15-1,30 L-аргинин 0,040-0,044 L-глутамин 0,58-0,60 L-тирозин 0,018-0,022 L-триптофан 0,018-0,022 Магний сернокислый 0,15-0,25 Мезо-инозит 6,4×10^-3-7,0×10^-3 Натрий двууглекислый 0,30-0,40 Натрий хлористый 7,5-8,5 Никотинамид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Пиридоксаль HCl 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Рибофлавин 3,2×10^-4-3,5×10^-4 Тиамин 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Фолиевая кислота 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Холина хлорид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Кислота янтарная 0,065-0,095 Вода дистиллированная Остальное

Нистатин - противогрибковый препарат полиенового ряда, используется в терапии кандидозов («Механизм действия антибиотиков», под редакцией Г.Ф. Гаузе, изд. «Мир», М., 1969 г., стр.125, 127, 131, 144).

Холина хлорид - гидроокись 2-оксиэтилтриметиламмония, [(СН₃)3N+CH₂CH₂OH]OH, используется для лечения заболеваний печени и при атеросклерозе (В.А. Сергеев «Репродукция и выращивание вирусов животных», изд. «Колос», М., 1976, стр.49, 50, 67).

Кислота янтарная - (бутандиовая кислота, этан-1,2-дикарбоновая кислота) - двухосновная предельная карбоновая кислота, используется для получения пластмасс, смол, лекарственных препаратов (в частности, хинолитина), для синтетических целей, а также в аналитической химии. В пищевой промышленности используется в качестве пищевой добавки Е363 (В.А. Сергеев «Репродукция и выращивание вирусов животных», изд. «Колос», М., 1976, стр.68, 75).

Нами впервые установлено, что использование предлагаемого технического решения в заявляемых режимах позволяет повысить производство клеток млекопитающих при суспензионном их культивировании. Анализ известной литературы свидетельствует о соответствии заявленного технического решения критерию «новизна».

Сравнение заявленного способа с известными показывает, что они для специалиста не следуют явным образом из уровня техники, что свидетельствует о соответствии заявленного технического решения критерию «изобретательский уровень».

Заявленное техническое решение является промышленно применимым, т.к. в настоящее время используется на ряде экспериментальных установках.

Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Получают составы 1-4 согласно прописи таблицы.

Растворение компонентов питательной среды ведут в дистиллированной воде, имеющей температуру 35-40°C, при непрерывном перемешивании. В начале растворяют антибиотики и навески солей поочередно (хлористый натрий, хлористый калий, кальций пантотенат, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный до полного растворения предыдущей навески, далее вносят навеску глюкозы). Дополнительно к механическому перемешиванию осуществляют перемешивание сжатым воздухом, т.е. барботированием в течение 10-15 минут. После растворения навесок убирают барботирование. В глюкозосолевой раствор осторожно, тонкой струйкой при механическом перемешивании вносят хлористый кальций в виде 40%-ного раствора и вновь барботируют. Из указанного в таблице количества гидролизата мышечных белков ферментативного сухого и гидролизата лактальбумина ферментативного готовят 10-12%-ный раствор и вносят его в полученный глюкозосолевой раствор, и растворяют в течение 10-15 минут перемешиванием и барботированием.

Отдельно растворяют аминокислоты. Растворение навесок проводят последовательно согласно прописи питательной среды в таблице. L-тирозин растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды при нагревании до кипения с добавлением по каплям концентрированной соляной кислоты до полного просветления раствора.

Все витамины последовательно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры. При этом каждую последующую навеску растворяют только после полного растворения предыдущей. Рибофлавин и фолиевую кислоту растворяют отдельно в небольшом количестве дистиллированной воды комнатной температуры с добавлением по каплям 20-25%-ного раствора NaOH до полного растворения навесок. Сначала растворяют рибофлавин, затем фолиевую кислоту, при растворении которой необходимо вновь по каплям вносить 20-25%-ный раствор NaOH до полного просветления раствора.

В глюкозосолевой раствор вносят растворы аминокислот, витаминов, сыворотку, натрий двууглекислый и перемешивают. После внесения в среду всех необходимых компонентов добавляют янтарную кислоту и дистиллированную воду до необходимого объема, перемешивают, стерилизуют фильтрацией и вносят в реактор для культивирования клеток.

Питательные среды (составы 1-4) обеспечивали накопление клеток, при суспензионном культивировании перевиваемой линии ВНК-21 до (3,9-4,2)·10⁶ кл./см³ в сравнении с известным техническим решением, где максимальное накопление клеток составило 3,5·10⁶ кл./см³.

Таким образом заявленное техническое решение позволяет повысить выход культуры клеток млекопитающих на 11-20%.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве питательных сред для суспензионного культивирования клеток, в частности суспензионного культивирования клеток почки сирийского хомячка. Питательная среда содержит натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵, канамицина сульфат с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵, нистатин с активностью от 6×10⁴ до 6,5×10⁴ ЕД/л, холина хлорид, янтарную кислоту и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить качество получаемого продукта. 1 табл., 1 пр.

Питательная среда для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, содержащая натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий двууглекислый, L-аргинин, L-глутамин, L-тирозин, L-триптофан, пантотенат кальция, пиридоксаль HCl, тиамин, мезо-инозит, никотинамид, рибофлавин, фолиевую кислоту, глюкозу, ферментативный гидролизат мышечных белков, ферментативный гидролизат лактальбумина, бензилпенициллина натриевую соль, канамицина сульфат, противогрибковый препарат и дистиллированную воду отличающаяся тем, что в качестве противогрибкового препарата содержит нистатин с активностью от 6×10⁴ до 6,5×10⁴ ЕД/л и дополнительно содержит холина хлорид и янтарную кислоту, причем бензилпенициллин натриевая соль используется с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵, а канамицин сульфат - с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵, при следующем содержании компонентов, г/л:
Нистатин с активностью от 6×10⁴ до 6,5×10⁴ ЕД/л 0,0098-0,0102 Бензилпенициллина натриевая соль с активностью 0,09×10⁵ 0,05-0,07 1,1×10⁵ Канамицина сульфат с активностью 0,09×10⁵-1,1×10⁵ Ед/л 0,14-0,16 Глюкоза 3,5-3,7 Кальций пантотенат 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,07 Калий хлористый 0,3-0,5 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,10-0,20 Кальций хлористый 0,26-0,30 Ферментативный гидролизат лактальбумина 1,15-1,30 Ферментативный гидролизат мышечных белков 1,15-1,30 L-аргинин 0,040-0,044 L-глутамин 0,58-0,60 L-тирозин 0,018-0,022 L-триптофан 0,018-0,022 Магний сернокислый 0,15-0,25 Мезо-инозит 6,4×10^-3-7,0×10^-3 Натрий двууглекислый 0,30-0,40 Натрий хлористый 7,5-8,5 Никотинамид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Пиридоксаль HCl 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Рибофлавин 3,2×10^-4-3,5×10^-4 Тиамин 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Фолиевая кислота 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Холина хлорид 3,2×10^-3-3,5×10^-3 Кислота янтарная 0,065-0,095 Вода дистиллированная Остальное