СОСТАВ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭШЕРИХИЙ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 A61K39/108 C12N1/20 C12R1/185 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микробиологии, и может быть использовано для выращивания культур эшерихий на простом и дешевом составе без потери его эффективности.

Выделение эшерихий, продуцирующих энтеротоксины, позволяет устанавливать диагноз на колибактериоз при бактериологическом исследовании патматериала. Кроме того, при конструировании вакцин против колибактериоза необходимо учитывать наличие энтеротоксигенных штаммов, вызывающих колиэнтеротоксимию.

Известен состав для выращивания культуры эшерихий (а.с. СССР N 1472495, кл. МКИ C 12 N 1/20, опуб. 15.04.89.), содержащий гидролизат казеина, фильтрат культуральной жидкости пекарских дрожжей, глюкозу, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, очищенный агар-агар и водопроводную воду.

Однако данный состав из-за наличия в нем агар-агара плотный и вследствие этого пригоден только для накопления адгезивных антигенов К-99. Кроме того, процесс приготовления состава предусматривает растворение солевых компонентов непосредственно в лабораториях, что может привести к получению растворов, не соответствующих стандартам.

Известен состав для культивирования эшерихий и получения токсиносодержащего материала (см. А.С. Лабинская "Микробиология с техникой микробиологических исследований". М. , изд. "Медицина", 1978, с. 350-351), содержащий пептон и бульон Мартена. Для приготовления состава используют компонент животного сырья (свиные желудки, мясо "вырезка"), из которых затем готовят соответственно пептон и бульон. Процесс приготовления очень трудоемкий и длительный - до 7-ми суток.

Известен также состав для культивирования эшерихий ( а. с. СССР N 1750690, кл. МКИ A 61 K 39/108, опубл. 30.07.92), содержащий перевар Хоттингера, сернокислый магний, однозамещенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, глюкозу и воду.

Однако для приготовления данного состава необходимо использование животного сырья из мышечных тканей и поджелудочной железы. Способ предусматривает длительный этап приготовления первичного компонента среды-перевара Хоттингера (более 10-ти суток).

Таким образом, способ, также как и предыдущие аналоги, трудоемок и длителен по времени.

Наиболее близким к заявляемому составу является состав Finkelstein et al. (см. Методические рекомендации по получению, очистке энтеротоксинов эшерихий и изготовлению антитоксических сывороток, Харьков, 1993, с. 14-15), содержащий двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na₂HPO₄), сернокислый натрий (Na₂SO₄), двузамещенный фосфорнокислый калий (K₂HPO₄), хлористый аммоний (NH₄Cl), хлористый магний (MgCl₂), хлористое железо (FeCl₃), гидролизат казеина, дистиллированную воду и глюкозу (C₆H₁₂O₆).

Процесс приготовления состава заключается в следующем.

Растворяют минеральные компоненты в дистиллированной воде, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, вносят гидролизат казеина и глюкозу. Стерилизуют автоклавированием.

Основным недостатком данного состава является дефицит белка, что приводит к снижению скорости роста культуры эшерихий. Кроме того, процесс приготовления состава предусматривает изготовление растворов из минеральных веществ самим экспериментатором, что может привести к риску приготовления некондиционных растворов.

Изобретение направлено на решение задачи создания простого в изготовлении состава, обеспечивающего как полноценное развитие эшерихий, так и максимальное продуцирование им токсинов.

Поставленная задача решается с помощью состава, содержащего, мас.%:
Аминокровин - 5 - 20
Пептон - 0,6 - 1,5
Хлористый аммоний - 0,08- 0,18
Хлористый натрий - 0,09 - 0,11
Гидролизат казеина - 9 - 20
Питательная среда "ИГЛА" - 52 - 61
Дистиллированная вода - Остальное
В известных заявителю источниках патентной и научно-технической литературы не описано составов для получения экзо- и эндотоксинов E. coli на основе смеси среды ИГЛА, гидролизата казеина, аминокровина, пептона и хлористого аммония, что позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом объекте изобретения критерия "новизна".

Кроме этого, неизвестно использование среды ИГЛА в качестве компонента состава для выращивания эшерихий. Обычно среду ИГЛА используют в качестве питательного субстрата для выращивания культур клеток в вирусологии (см., например, Справочник по микробилогическим и вирусологическим методам исследований, под. ред. М.О.Биргера. М., Медицина, 1973).

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия "изобретательский уровень".

Полусинтетическая среда ИГЛА представляет собой смесь аминокислот, витаминов, минеральных солей (см. , например, "Ускоренная микробиологическая диагностика инфекционных болезней животных". М. Россельхозиздат, 1966, с. 89-90).

А - аминокислоты, мМ/мл:
Триптофан - 0,01
Гистидин - 0,02
Цистин - 0,03
Тирозин - 0,03
Метионин - 0,03
Фенилаланин - 0,05
Аргинин - 0,05
Лейцин - 0,1
Треонин - 0,1
Валин - 0,1
Изолейцин - 0,1
Б - витамины, г/л:
Парааминобензойная кислота - 10^-7
Биотин - 10^-6
Холин - 10^-6
Никотиновая кислота - 10^-6
Никотинамид - 10^-6
Пиродоксаль - 10^-6
Пиродоксин - 10^-6
Рибофлавин - 10^-7
Пантотенат кальция - 10^-6
Тиамин - 10^-6
Фолиевая кислота - 10^-6
В - минеральные и прочие составные части среды ИГЛА,%:
Хлористый натрий (NaCl) - 0,68
Хлористый калий (KCl) - 0,04
Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na₂HPO₄ • 2H₂O) - 0,014
Питьевая сода (NaHCO₃) - 0,02
Хлористый кальций (CaCl₂) - 0,02
Хлористый магний (MgCl₂) - 0,0076
Азотнокислое железо (FeNO₃) - 0,00001
Глюкоза - 0,1
Сыворотка человеческая - 5-10
Глютамин - 2
а также, мг/мл:
Фенолрот - 5
Гидролизат казеина представляет собой раствор аминокислот и пептидов, получаемый путем гидролиза полноценного белка казеина. Содержит 0,7 - 0,95% общего азота, аминный азот об общего составляет 40-60%. 1 литр гидролизата содержит 5,5 г натрия хлорида, 0,4 г калия хлорида, 0,4 кальция хлорида и 0,005 магния хлорида, pH раствора - 5,7 - 6,7.

Аминокровин - представляет собой неполный гидролизат крови (эритроцитарной массы и сгустков крови) человека. Содержит все свободные аминокислоты (в 100 мл раствора 4 г аминокислот, что в пересчете на азот составляет 0,7 г). В состав аминокровина входят также глюкоза (5%) и минеральные соли. Реакция раствора нейтральная.

Пептон - порошок желто-кремового цвета, специфического запаха. Пептон - препарат, полученный в результате неполного ферментативного гидролиза белков. Содержит более 80% полипептидов, в том числе и высокомолекулярные. Необходим как источник белкового питания микроорганизмов.

Хлористый аммоний представляет собой белый кристаллический, несколько гигроскопический порошок без запаха, солоноватого вкуса, хорошо растворимый в воде. Применяется как уникальный источник азота.

Хлористый натрий - представляет собой белые кубические кристаллы, без запаха, соленого вкуса, хорошо растворяется в воде. Необходим для поддержания осмотического давления в растворах.

Состав готовят следующим образом.

Берут 22 мл дистиллированной воды, добавляют навески солей: NH₄Cl - 0,09 г, NaCl - 0,1 г и 0,66 г пептона. Полученную смесь нагревают и перемешивают до полного растворения компонентов. Приготовленный раствор автоклавируют 30 мин при 121^oC. Полученный стерильный раствор охлаждают до 40^oC. Затем смешивают готовые компоненты: среда ИГЛА - 57 мл, гидролизат казеина - 14 мл и аминокровин - 7 мл и вносят простерилизованный раствор хлористого аммония и пептона. Полученную среду (pH 7,2-7,6) разливают в стерильные пробирки или колбы.

При бактериологическом изучении состава, приготовленного согласно предлагаемому способу, проводили сравнительные посевы на среду Мартена, Финкельштейна и на заявляемый состав.

В качестве посевного материала использовали 2 токсигенных штамма E. coli, продуцирующие термостабильный (ТС) и термолобильный (ТЛ) токсины. Посевы инкубировали в течение 7-ми суток при 37^oC. Затем полученные суспензии подвергали центрифугированию при 6000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочная жидкость являлась энтеротоксигенным материалом. Нативные токсины вводили внутрибрюшинно белым мышам весом 12-14 г в объеме 0,5 мл. Результаты представлены в таблице.

Продуцирование токсигенными штаммами E. coli как ТС- так и ТЛ-токсинов на заявляемом составе несколько превосходит продуцирование на общепризнанных средах (Мартена и Финкельштейна).

Количественный состав ингредиентов подобран как экспериментальным путем, так и с учетом литературных данных, исходя из анализа питательной потребности эшерихий.

Таким образом, заявляемый состав прост в изготовлении, обеспечивает полноценное развитие эшерихий и продуцирование ими как ТС-, так и ТЛ-токсинов.

Изобретение предназначено, в частности, для выращивания культур эшерихий на среде простого состава без потери его эффективности. Состав содержит, мас.%: аминокровин 5-20, пептон 0,6-1,5, хлористый аммоний 0,08-0,18, хлористый натрий 0,09-0,11, гидролизат казеина 9-20, питательную среду "ИГЛА" 52-61, дистиллированную воду - остальное. Изобретение обеспечивает как полноценное развитие эшерихий, так и максимальное продуцирование ими токсинов. 1 табл.

Состав для культивирования эшерихий, содержащий хлористый аммоний, гидролизат казеина, дистиллированную воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит аминокровин, пептон, хлористый натрий и питательную среду "ИГЛА" при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Аминокровин - 5 - 20
Пептон - 0,6 - 1,5
Хлористый аммоний - 0,08 - 0,18
Хлористый натрий - 0,09 - 0,11
Гидролизат казеина - 9 - 20
Питательная среда "ИГЛА" - 52 - 61
Дистиллированная вода - Остальное