КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТЕРОКИНАЗЫ В ДРОЖЖАХ Российский патент 2015 года по МПК C12N9/50 C12N9/64 

Данная заявка претендует на приоритет в соответствии с 35 U.S.С. §119(e) предварительной заявки на патент США №61/416622, поданной 23 ноября 2010 г., которая включена в полном объеме путем ссылки.

Энтерокиназа (ЭK, также известная как энтеропептидаза (ЭП); ЕС 3.4.21.9) - это гетеродимерный гликопротеин, продуцируемый клетками двенадцатиперстной кишки. Являясь членом химотрипсинового семейства сериновых протеаз, она секретируется кишечными железами (либеркюновыми криптами) вслед за входом заглатываемой пищи, проходящей из желудка, и присутствует в слизистой оболочке двенадцатиперстной и тощей кишок. Вовлеченная в переваривание диетических протеинов, ЭK катализирует расщепление N-концевого кислого пептидного фрагмента трипсиногена, превращая этот зимоген в его активную форму трипсин. Активация трипсина инициализирует каскад протеолитических реакций, приводящих к активации многих панкреатических зимогенов, включая химотрипсиногены, проэластазы, прокарбоксипептидазы и некоторые пролипазы.

Энтерокиназа может быть клонирована из нескольких млекопитающих источников, включая, например, человека, крупный рогатый скот, крыс и мышей. Структурно ЭK является сериновой протеазой, содержащей, приблизительно, 82-140 кДа тяжелой цепи, которая прикрепляет энтерокиназу к пограничной мембране кишечной щетки, и, приблизительно, 35-62 кДа легкой цепи, которая содержит каталитическую субъединицу. Легкая цепь прикреплена к тяжелой цепи через единичный дисульфидный мостик. В дополнение к этому единичному междоменному дисульфидному мостику легкая цепь содержит добавочные восемь цистеиновых остатков для образования специфических внутридоменных дисульфидных связей. Энтерокиназная легкая цепь содержит каталитическую активность и является достаточной для расщепления. ЭK и ее каталитически активные фрагменты являются высокоспецифичными к пентапептидной последовательности Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID №1), расщепляя неустойчивую химическую связь, находящуюся за лизиновым остатком (DDDDK^↓).

Из-за высокой степени специфичности ЭK применяют в качестве подходящего реагента в биохимических и биотехнологических прикладных технологиях. Например, слитый протеин, содержащий С-концевой очистительный тег (такой как поли-His), присоединенный с помощью этой последовательности к сайту расщепления, может быть расщеплен с помощью ЭK для удаления очистительного тега с целью получения конечного протеина после протеиновой очистки. Альтернативно, N-концевая про-последовательность протеаз, которая должна быть расщеплена перед активацией, может быть мутирована для разрешения активации энтерокиназой.

Рекомбинантная энтерокиназа (rЭK) успешно продуцируется бактериями, подобными Escherichia coli, и дрожжами, подобными Pichia pastoris, используя ген, продуцирующий 28 кДа протеин, охватывающий только каталитический домен легкой цепи. Однако, остаются затруднения с точки зрения экспрессии этого рекомбинантного энзима в дрожжах в достаточных количествах для коммерческого использования. Данное описание раскрывает улучшенную экспрессонную конструкцию, полезную для рентабельного продуцирования рекомбинантной энтерокиназы в количествах, полезных для коммерческого использования.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Варианты данного описания раскрывают полинуклеотидные молекулы, кодирующие энтерокиназу. Раскрытые полинуклеотидные молекулы, кодирующие энтерокиназу, включают SEQ ID №4, SEQ ID №6, их нуклеотидные варианты, их усеченные варианты и/или их комплимент, не ограничиваясь названными. Полинуклеотид, раскрытый в данном описании, может дополнительно содержать дрожжевой вектор экспрессии. Другие варианты изобретения раскрывают дрожжевой экспрессиионный конструкт, содержащий дрожжевой вектор экспрессии и полинуклеотидную молекулу, кодирующую энтерокиназу.

Другие аспекты данного изобретения раскрывают дрожжевые клетки, содержащие дрожжевой экспрессиионный конструкт, включающий молекулу полинуклеотида, кодирующего энтерокиназу. Раскрытый дрожжевой экспрессиионный конструкт может временно содержаться в дрожжевой клетке или содержаться в дрожжевой клетке стабильно. Дрожжевые клетки включают клетки штамма Pichia pastoris, клетки штамма Pichia methanolica, клетки штамма Pichia angusta, клетки штамма Schizosaccharomyces pombe, клетки штамма Saccharomyces cerevisiae или клетки штамма Yarrowia lipolytica, не ограничиваясь перечисленными.

Другие варианты данного изобретения раскрывают способы продуцирования энтерокиназы, используя дрожжевой экспрессиионный конструкт. Раскрытые способы включают этап экспрессии в дрожжевой клетке дрожжевого экспрессонного конструкта, раскрытого в данном описании. Другой вариант изобретения охватывает способы продуцирования энтерокиназы, включающие этапы введения дрожжевого экспрессонного конструкта, раскрытого в данном описании, в дрожжевую клетку и экспрессрования экспрессонного конструкта в дрожжевой клетке.

Другие варианты данного изобретения раскрывают способы расщепления полипептида, содержащего энтерокиназный сайт расщепления, с использованием энтерокиназы. Раскрытые способы включают этап контактирования полипептида, включающего энтерокиназный сайт расщепления, с энтерокиназой, где контактирование полипептида с энтерокиназой приводит к специфическому расщеплению энтерокиназного сайта расщепления. Использованная энтерокиназа может быть энтерокиназой, кодируемой молекулой полинуклеотида, раскрытой в данном описании, продуцируемой с использованием дрожжевого экспрессонного конструкта, раскрытого в данном описании, и/или продуцируемой с помощью экспрессии в дрожжевой клетке, раскрытой в данном описании.

Другие варианты данного изобретения раскрывают способы получения полипептида, содержащего энтерокиназный сайт расщепления, с использованием энтерокиназы. Раскрытые способы включают этап контактирования полипептида, включающего энтерокиназный сайт расщепления, с энтерокиназой, где контактирование полипептида с энтерокиназой приводит к специфическому расщеплению энтерокиназного сайта расщепления. Использованная энтерокиназа может быть энтерокиназой, закодированной молекулой полинуклеотида, раскрытой в данном описании, продуцируемой с использованием дрожжевого экспрессонного конструкта, раскрытого в данном описании, и/или продуцируемой с помощью экспрессии в дрожжевой клетке, раскрытой в данном описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

ФИГ. 1 показывает график средней ферментной активности энтерокиназы, полученной из шести разных клеточных линий дрожжей, содержащих интегрированную кассету ЭK, раскрытых в данном описании.

ОПИСАНИЕ

Дрожжевые системы экспрессии дают несколько преимуществ в качестве системы продуцирования геторологического полипептида. Во-первых, дрожжевые клетки могут давать значительную биомассу при выращивании на ферментерах (>300 г/л влажной клеточной массы), обеспечивая плотные культуры для продуцирования желательного полипептида в больших количествах. Во-вторых, в отличие от прокариотических экспрессонных систем дрожжевые системы экспрессии могут корректно управлять пост-трансляционным фолдингом и другими модификациями, специфичными для эукариотического полипептида, тем самым обеспечивая сохранение биологической активности, функции и стабильности гетерологического пептида. В-третьих, дрожжевые системы экспрессии являются подвижными и гибкими, предлагая 1) внехромосомную или геномную экспрессю; 2) конститутивный или индуцибельный контроль экспрессии, и 3) возможность направлять экспрессю геторологического полипептида в специфический клеточный или внеклеточный компартмент для облегчения выделения и очистки.

Данное описание раскрывает улучшенную экспрессонную конструкцию, полезную для рентабельного продуцирования рекомбинантной энтерокиназы в достаточно больших количествах, полезных для коммерческого использования. Эти результаты могут быть достигнуты использованием любой раскрытой генетически сконструированной полинуклеотидной молекулы, кодирующей энтерокиназу. Клонированные в дрожжевой вектор экспрессии и введенные в дрожжевую клетку, эти сконструированные молекулы могут продуцировать значительно большие количества энтерокиназы, чем возможно на сегодняшний день.

Таким образом, особенности данного описания охватывают, в частности, полинуклеотидную молекулу. Полинуклеотидная молекула, раскрытая в данном описании, может быть одноцепочечной или двуцепочечной ДНК, выделенной из генома организма, рекомбинантно полученной кДНК, химически синтезированной молекулой ДНК. Кроме того, "выделенная" полинуклеотидная молекула, как правило, является по существу свободной от других клеточных материалов, когда ее выделяют из геномного источника или получают с помощью рекомбинантных способов, или по существу свободной от химических предшественников или других химических веществ, когда ее химически синтезируют.

Особенности данного описания охватывают, в частности, полинуклеотидную молекулу, кодирующую энтерокиназу. В данном описании, термин "энтерокиназа" является синонимом "ЭK" и обозначает любой полипептид, который может селективно распознавать и расщеплять пентапептидную последовательность Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID №1) при неустойчивой химической связи, находящейся за лизиновым остатком (DDDDK^↓). В данном описании, термин "селективно распознает и расщепляет", когда ссылка делается на энтерокиназу, обозначает избирательное взаимодействие энтерокиназы с молекулой, содержащей SEQ ID №1, и расщепление неустойчивой химической связи, находящейся за лизиновым остатком последовательности SEQ ID №1, хотя по существу не взаимодействует с любой другой пентапептидной последовательностью, находящейся в молекуле, и не расщепляет ее. Как таковая, энтерокиназа обозначает нативный гетеродимерный гликопротеин, содержащий, приблизительно, 82-140 кДа тяжелой цепи и, приблизительно, 35-62 кДа легкой цепи, присоединенной с помощью единичного дисульфидного мостика, а также каталитически активный фрагмент легкой цепи. Примеры создания полинуклеотидной молекулы, кодирующей энтерокиназу, описаны в Примерах 1, 2 и 4-6.

В одном варианте осуществления изобретения, полинуклеотидная молекула, кодирующая энтерокиназу, может представлять собой SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплемент.В данном описании, термин "комплемент" обозначает полинуклеотидную молекулу, которая является антисмысловой молекулой в смысле молекулы, кодирующей энтерокиназу. Полинуклеотидная молекула, кодирующая энтерокиназу, может включать полинуклеотидные участки, кодирующие другие типы полипептидных молекул, такие как, например, очистительные теги, сигналы клеточной секреции и/или сигналы субклеточной локализации. Образцом полинуклеотидной молекулы такого вида является SEQ ID №6. Полинуклеотидная молекула, кодирующая энтерокиназу, может также включать контрольные или регуляторные полинуклеотидные участки, которые направляют или облегчают, например, особенности транскрипции, трансляции и/или пост-трансляционной обработки.

В другом варианте осуществления изобретения, полинуклеотидная молекула, кодирующая энтерокиназу, может быть нуклеотидным вариантом SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементом, при условии, что нуклеотидное изменение SEQ ID №4 or SEQ ID №6 или их комплемента не изменит аминокислотную последовательность энтерокиназы, кодируемой полинуклеотидным вариантом. Как таковой, полинуклеотидный вариант SEQ ID №4, раскрытый в данном описании, кодирует энтерокиназу SEQ ID №5, и полинуклеотидный вариант SEQ ID №6, раскрытый в данном описании, кодирует энтерокиназу SEQ ID №7.

Согласно аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула полинуклеотидного варианта, кодирующего энтерокиназу, может быть, например, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной полинуклеотидной последовательности SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементу.

Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула полинуклеотидного варианта, кодирующего энтерокиназу, может иметь, например, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 10, от приблизительно, 1 до, приблизительно, 15, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 20, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 35, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 50, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 55, или, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 60 несмежных нуклеотидных замещений в сравнении с SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементом. Согласно дополнительным аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула полинуклеотидного варианта, кодирующего энтерокиназу, может иметь, например, приблизительно, от 1 до, приблизительно, 10, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 15, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 20, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 35, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 50, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 55 или от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 60 смежных нуклеотидных замещений в сравнении с SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементом.

Любой из множества способов выравнивания последовательностей может быть использован для идентификации полинуклеотида или полипептида, раскрытых в данном описании, включая глобальные способы, локальные способы и гибридные способы, такие как, например, способы сегментного подхода, не ограничиваясь названными. Протоколы для определения процента идентичности являются рутинными процедурами для специалиста в данной области техники и раскрыты в данном описании.

Глобальные способы выравнивают последовательности от начала до конца молекулы и определяют лучшее выравнивание путем добавления большого числа индивидуальных пар остатков и наложения гэповых штрафов. Способы включают, например, CLUSTAL W, смотри, например, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); и интерактивную рафинацию, смотри, например, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996), но не ограничиваются указанными.

Локальные способы выравнивают последовательности путем идентифицирования одного или более консервативных мотивов, общих для всех вводимых последовательностей. Способы включают, например, Match-box, смотри, например, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); Gibbs sampling, смотри, например, С.Ε. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, смотри, например, Ivo Van Walle et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics,: 1428-1435 (2004), но не ограничиваются перечисленными.

Гибридные способы объединяют функциональные особенности как глобальных, так и локальных способов выравнивания. Способы включают, например, сравнение сегмент-к-сегменту, смотри, например, Burkhard Morgenstern et al., Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based on Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996); T-Coffee, смотри, например, Cédric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, смотри, например, Robert С. Edgar, MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); и DIALIGN-T, смотри, например, Amarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005).

Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула полинуклеотидного варианта, кодирующего энтерокиназу, может представлять собой полинуклеотидный вариант, который гибридизирует с полинуклеотидной молекулой, содержащей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплемент, в жестких условиях. Такие жесткие условия известны специалистам в данной области техники и могут быть найдены, например, в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, включенных в полном объеме в данное описание путем ссылки. Неограничивающим примером жестких (например, строго жестких) условий гибридизации является гибридизация в 6х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при, приблизительно, 45°С, с последующим одноразовым или многоразовым промыванием 0,2×SSC, 0,1% SDS при 50-65°С.

Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула полинуклеотидного варианта, кодирующего энтерокиназу, может быть полинуклеотидным вариантом, раскрытым в Таблице 1. Эта таблица включает аминокислотную последовательность легкой цепи энтерокиназы, кодоны, содержащие открытую рамку считывания полинуклеотидного участка последовательностей SEQ ID №4 и SEQ ID №6, кодирующих фрагмент этой легкой цепи, варианты кодонов, которые могут замещать кодоны SEQ ID №4 и SEQ ID №6. Согласно аспектам данного варианта осуществления настоящего изобретения, молекула варианта полинуклеотида, кодирующего энтерокиназу, имеет, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 вариантных кодонов, показанных в Таблице 1, которые замещают соответствующие кодоны, присутствующие в SEQ ID №4 или SEQ ID №6. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула варианта полинуклеотида, кодирующего энтерокиназу, имеет, например, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 вариантных кодонов из Таблицы 1, которые замещают соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 или SEQ ID №6. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула вариантного полинуклеотида, кодирующего энтерокиназу, имеет, например, не менее чем 1, не менее чем 2, не менее чем 3, не менее чем 4, не менее чем 5, не менее чем 6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 11, не менее чем 12, не менее чем 13, не менее чем 14, не менее чем 15, не менее чем 16, не менее чем 17, не менее чем 18, не менее чем 19 или не менее чем 20 вариантных кодонов, показанных в Таблице 1, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 or SEQ ID №6.

Таблица 1. Нуклеиновокислотные последовательности энтерокиназы Аминокислота I V G G S D S R Ε G A W Кодон ATA GTT GGC GGC TCT GAC TCC AGA GAA GGT GCC TGG Вариант ATT АТС - GGT GGA GGT GGA - GAT TCT - - GGA GCT -

  Аминокислота Ρ W V V A L Y F D D Q Q Кодон CCA TGG GTC GTT GCC TTA TAC TTT GAT GAT CAA CAG Вариант ест - GTT - GCT TTG TAT - - - - CAA   Аминокислота V С G A S L V S R D W L Код он GTC TGT GGT GCT TCA CTT GTT TCT AGA GAT TGG TTG Вариант GTT - GGA - TCT TTG - - - - - -   Аминокислота V S A A H С V Y G R N M Кодон GTG ТСС GCA GCA CAT TGT GTG TAT GGT AGG AAT ATG Вариант GTT ТСТ GCT GCT - - GTT TAC GGA AGA CAA -   Аминокислота Ε Ρ S K W K A V L G L H Кодон GAG ест TCA AAG TGG AAA GCT GTA TTG GGG TTG CAT Вариант GAA CCA TCT - - AAG - GTT - GGT GGA - -   Аминокислота M A S N L Τ S Ρ Q I Ε Τ Кодон ATG GCC TCT AAC CTT АСА AGT CCA CAA ATT GAA ACT Вариант - GCT - - TTG ACT TCT CCT - АТС - -   Аминокислота R L I D Q I V I N Ρ Η Y Кодон AGA СТА ATT GAT CAA ATT GTT АТС AAT CCT CAT TAC Вариант - TTG АТС - - АТС - ATT AAC CCA - -   Аминокислота N K R R K N N D I A M M Кодон AAT AAG CGT AGG AAA AAC AAT GAC ATA GCA ATG ATG Вариант AAC - AGA AGA AAG - AAC GAT ATT GCT - -

                  АТС         Аминокислота H L Ε M K V N Y Τ D Y I Кодон САС TTG GAG ATG AAA GTT AAC TAC АСА GAC TAC АТС Вариант CAT - GAA - AAG - - - ACT GAT - ATT   Аминокислота Q Ρ I С L Ρ Ε Ε Ν Q V F Кодон CAA CCA ATA TGT TTG CCT GAG GAA AAT CAG GTG TTC Вариант - CCT ATT АТС - - CCA GAA - AAC CAA GTT TTT   Аминокислота Ρ Ρ G R I С S I A G W G Кодон CCA CCT GGT CGT ATT TGT AGT ATT GCT GGA TGG GGA Вариант ест CCA GGA AGA АТС - TCT АТС - GGT - GGT   Аминокислота A L I Y Q G S Τ A D V L Кодон GCC CTG АТС TAC CAA GGA TCT ACC GCT GAC GTA TTA Вариант GCT TTG ATT - - GGT - ACT - GAT GTT TTG   Аминокислота Q Ε A D V Ρ L L S N Ε K Кодон CAA GAG GCA GAT GTT CCT CTG CTG ТСС AAC GAG AAA Вариант - GAA GCT - - CCA TTG TTG TCT - GAA AAG   Аминокислота С Q Q Q M Ρ Ε Y N I Τ Ε Кодон TGC CAG CAA CAA ATG CCA GAA TAC AAC АТС ACT GAA Вариант - CAA - - - CCT - - - ATT - -   Аминокислота N M V С A G Y Ε A G G V Кодон AAC ATG GTT TGT GCT GGT TAT GAA GCT GGA GGT GTA

Вариант - - - - - GGA TAC - - GGT GGA GTT   Аминокислота D S С Q G D S G G Ρ L M Кодон GAT TCA TGC CAG GGA GAT TCA GGC GGT CCT СТА ATG Вариант - TCT - CAA GGT - TCT GGT GGA GGA CCA TTG -   Аминокислота С Q Ε Ν N R W L L A G V Кодон TGC CAG GAG ΑΑΤ AAC CGA TGG TTG CTT GCT GGT GTA Вариант - CAA GAA AAC - AGA - - TTG - GGA GTT   Аминокислота Τ S F G Y Q С A L Ρ N R Кодон ACG AGT TTT GGA TAT CAA TGC GCT TTA CCT AAC CGT Вариант ACT TCT - GGT TAC - - - TTG CCA - AGA   Аминокислота Ρ G V Y A R V Ρ R F Τ Ε Кодон CCA GGG GTC TAT GCA AGA GTC CCA AGA TTC ACC GAG Вариант CCT GGT GGA GTT TAC GCT - GTT CCT - TTT ACT GAA   Аминокислота W I Q S F L H *         Кодон TGG ATT CAA TCT TTT CTG CAC TGA         Вариант - АТС - - - TTG CAT TAA        

В дополнительных аспектах данного варианта осуществления изобретения, полинуклеотидная молекула, кодирующая энтерокиназу, может быть полинуклеотидным вариантом, раскрытым в Таблице 2. Эта таблица включает аминокислотные последовательности легкой цепи энтерокиназы, кодоны, содержащие открытую рамку считывания полинуклеотидного участка последовательностей SEQ ID №4 и SEQ ID №6, кодирующих этот фрагмент легкой цепи, и варианты кодонов, которые могут замещать кодоны SEQ ID №4 и SEQ ID №6. Согласно аспектам данного варианта осуществления настоящего изобретения, молекула полинуклеотидного варианта, кодирующая энтерокиназу, имеет, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 вариантных кодонов из Таблицы 2, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 или SEQ ID №6. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула вариантного полинуклеотида, кодирующего энтерокиназу, имеет, например, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 вариантных кодонов из Таблицы 2, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 or SEQ ID №6. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, молекула вариантного полинуклеотида, кодирующего энтерокиназу, имеет, например, не менее чем 1, не менее чем 2, не менее чем 3, не менее чем 4, не менее чем 5, не менее чем 6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 11, не менее чем 12, не менее чем 13, не менее чем 14, не менее чем 15, не менее чем 16, не менее чем 17, не менее чем 18, не менее чем 19 или не менее чем 20 вариантных кодонов из Таблицы 2, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 и SEQ ID №6.

Таблица 2. Нуклеиновокислотные последовательности энтерокиназы Аминокислота I V G G S D S R Ε G A W Кодон ATA GTT GGC GGC TCT GAC ТСС AGA GAA GGT GCC TGG Вариант ATT - GGT GGT - GAT TCT - - - GCT -   Аминокислота Ρ W V V A L Y F D D Q Q Кодон CCA TGG GTC GTT GCC TTA TAC TTT GAT GAT CAA CAG Вариант - - GTT - GCT TTG TAT - - - - CAA   Аминокислота V С G A S L V S R D W L Кодон GTC TGT GGT GCT TCA CTT GTT TCT AGA GAT TGG TTG Вариант GTT - - - TCT TTG               Аминокислота V S A A H С V Y G R N M Кодон GTG ТСС GCA GCA CAT TGT GTG TAT GGT AGG AAT ATG

Вариант GTT TCT GCT GCT - - GTT TAC - AGA CAA -   Аминокислота Ε Ρ S K W К A V L G L H Кодон GAG CCT TCA AAG TGG AAA GCT GTA TTG GGG TTG CAT Вариант GAA CCA TCT - - AAG - GTT - GGT - -   Аминокислота M A S N L Τ S Ρ Q I Ε Τ Кодон ATG GCC TCT AAC CTT АСА AGT CCA CAA ATT GAA ACT Вариант - GCT - - TTG ACT TCT             Аминокислота R L I D Q I V I N Ρ Η Y Кодон AGA СТА ATT GAT CAA ATT GTT АТС AAT CCT CAT TAC Вариант - TTG           ATT AAC CCA - -   Аминокислота N K R R K N N D I A M M Кодон AAT AAG CGT AGG AAA AAC AAT GAC ATA GCA ATG ATG Вариант AAC - AGA AGA AAG - AAC GAT ATT GCT - -   Аминокислота H L Ε M K V N Y Τ D Y I Кодон CAC TTG GAG ATG AAA GTT AAC TAC АСА GAC TAC АТС Вариант CAT - GAA - AAG - - - ACT GAT - ATT   Аминокислота Q Ρ I С L Ρ Ε Ε N Q V F Кодон CAA CCA ATA TGT TTG CCT GAG GAA AAT CAG GTG TTC Вариант - - ATT - - CCA GAA - AAC CAA GTT ТТТ   Аминокислота Ρ Ρ G R I С S I A G W G Кодон CCA CCT GGT CGT ATT TGT AGT ATT GCT GGA TGG GGA Вариант - CCA - AGA - - TCT - - GGT - GGT   Аминокислота A L I Y Q G S Τ A D V L Кодон GCC CTG АТС TAC CAA GGA TCT ACC GCT GAC GTA TTA-

Вариант GCT TTG ATT - - GGT - ACT - GAT GTT TTG   Аминокислота Q Ε A D V Ρ L L S N Ε K Кодон CAA GAG GCA GAT GTT CCT CTG CTG ТСС AAC GAG AAA Вариант - GAA GCT - - CCA TTG TTG TCT - GAA AAG   Аминокислота С Q Q Q M Ρ Ε Y N I Τ Ε Кодон TGC CAG CAA CAA ATG CCA GAA TAC AAC АТС ACT GAA Вариант - CAA - - - - - - - ATT - -   Аминокислота N M V С A G Y Ε A G G V Кодон AAC ATG GTT TGT GCT GGT TAT GAA GCT GGA GGT GTA Вариант - - - - - - TAC - - GGT - GTT   Аминокислота D S С Q G D S G G Ρ L M Кодон GAT TCA TGC CAG GGA GAT TCA GGC GGT CCT СТА ATG Вариант - TCT - CAA GGT - TCT GGT - CCA TTG -   Аминокислота С Q Ε N N R W L L A G V Кодон TGC CAG GAG AAT AAC CGA TGG TTG CTT GCT GGT GTA Вариант - CAA GAA AAC - AGA - - TTG - - GTT   Аминокислота Τ S F G Y Q С A L Ρ N R Кодон ACG AGT TTT GGA TAT CAA TGC GCT TTA CCT AAC CGT Вариант ACT TCT - GGT TAC - - - TTG CCA - AGA   Аминокислота Ρ G V Y A R V Ρ R F Τ Ε Кодон CCA GGG GTC TAT GCA AGA GTC CCA AGA TTC ACC GAG Вариант - GGT GTT TAC GCT - GTT - - TTT ACT GAA   Аминокислота W I Q S F L H *         Кодон TGG ATT CAA TCT TTT CTG CAC TGA        

Вариант           TTG CAT TAA        

Согласно другому варианту осуществления изобретения полинуклеотидная молекула, кодирующая энтерокиназу, может быть усеченным фрагментом SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их нуклеотидного варианта. В данном описании, термин "усеченный фрагмент SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого из его нуклеотидных вариантов" обозначает удаление нуклеотидов из 710 нуклеотидной последовательности, сформированной SEQ ID №4 или ее нуклеотидным вариантом, или из 953 нуклеотидной последовательности, сформированной SEQ ID №6 или ее нуклеотидным вариантом. Могут быть удалены нуклеотиды с 5'-конца, 3'-конца или 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта.

Согласно аспектам данного варианта осуществления настоящего изобретения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нуклеотидов удалены с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или комплемента. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 нуклеотидов удалены с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или комплемента. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, не менее чем 1, не менее чем 2, не менее чем 3, не менее чем 4, не менее чем 5, не менее чем 6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 11, не менее чем 12, не менее чем 13, не менее чем 14, не менее чем 15, не менее чем 16, не менее чем 17, не менее чем 18, не менее чем 19, не менее чем 20, не менее чем 25, не менее чем 30, не менее чем 35, не менее чем 40, не менее чем 45 или не менее чем 50 удалены с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или комплемента.

Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 кодонов удалены с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта, или их комплемента. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 кодонов удалены с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или комплемента. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, не менее чем 1, не менее чем 2, не менее чем 3, не менее чем 4, не менее чем 5, не менее чем 6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 11, не менее чем 12, не менее чем 13, не менее чем 14, не менее чем 15, не менее чем 16, не менее чем 17, не менее чем 18, не менее чем 19 или не менее чем 20 кодонов удалены с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или комплемента.

Варианты данного описания раскрывают, в частности, полинуклеотидную молекулу, содержащую дрожжевой вектор экспрессии. Для экспрессрования полинуклеотидной молекулы, кодирующей ЭK, может быть использован широкий выбор дрожжевых векторов экспрессии, включая экспрессиионный вектор Pichia pastoris, экспрессиионный вектор Pichia methanolica, экспрессиионный вектор Pichia angusta, экспрессиионный вектор Schizosaccharomyces pombe, экспрессиионный вектор Saccharomyces cerevisiae и экспрессиионный вектор Yarrowia lipolytica, не ограничиваясь перечисленными. Примеры дрожжевых векторов экспрессии включают экспрессиионный вектор pGal-MF (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), экспрессиионный вектор рМЕТ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), экспрессиионный вектор PICHIAPINK (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), экспрессиионный вектор pPICZ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, СА), экспрессиионный вектор рРрТ4-альфа (Ingenza, Ltd., Midlothian, UK), экспрессиионный вектор pTEF-MF (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), экспрессиионный вектор pYES (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), не ограничиваясь перечисленными.

Дрожжевой вектор экспрессии, как правило, включает контролирующие или регулирующие полинуклеотидные участки, которые направляют или облегчают, например, особенности репликации, интеграции, транскрипции, трансляции и/или посттрансляционной обработки. Например, дрожжевой вектор экспрессии может включать конститутивный промотор и энхансерные элементы и/или индуцибельный промотор и энхансерные элементы, используемые для направления экспрессии ЭK. Неограничивающим примером конститутивного вектора экспрессии является вектор, который использует глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназный (GAP) промотор, что бы направлять продуцирование ЭK. Неограничивающим примером индуцибельного вектора экспрессии является вектор, который использует альдегидоксидазный-1 промотор (АОХ1) с метанолом в качестве индуктора. В любом случае могут быть достигнуты высокие уровни экспрессии, до несколько грамм на литр полученного продукта. Например, в индуцированных метанолом дрожжевых клетках, АОХ1 может составлять 30% всего растворимого белка. Штаммы, лишенные ттаАОХ1 (называемые также штаммами Mut^S) могут по-прежнему индуцироваться метанолом, так как они экспрессруют ген алкогольоксидазы-2 (АОХ2), но растут они медленнее чем штаммы дикого типа, когда метанол используют в качестве основного источника углерода. Однако, вместо использования энергии и ресурсов преимущественно для производства протеина АОХ1, в штаммах Mut^S сила промотора АОХ1, в основном, может быть направлена на производство рекомбинантного протеина. К тому же, могут быть использованы более низкие уровни метанола.

Дрожжевой вектор экспрессии может включать полинуклеотидные участки, кодирующие другие типы полипептидных молекул, таких как, например, очистительные теги, сигналы клеточной секреции и/или сигналы субклеточной локализации. Такие полинуклеотидные участки обычно функционально связаны с ЭK в виде слитого полипептида. Примеры очистительных тегов включают гистидиновый тег, туе тег, V5 тег, не ограничиваясь названными. Примеры сигнальных последовательностей включают последовательности, которые направляют ЭK к цитоплазме клеток, целлюлярным органеллам, таким как пероксисомы, или во внеклеточную среду, но не ограничиваются ими.

Варианты данного описания раскрывают, в частности, полинуклеотидную молекулу, содержащую дрожжевой экспрессиионный конструкт. Дрожжевой экспрессиионный конструкт содержит полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, как раскрыто в данном описании, функционально связанную с дрожжевым вектором экспрессии, как раскрыто в данном описании. Примеры дрожжевого экспрессонного конструкта описаны в Примерах 2 и 4-6.

Варинаты данного описания раскрывают, в частности, введение в дрожжевую клетку полинуклеотидной молекулы, раскрытой в данном описании. Полинуклеотидная молекула, введенная в клетку, может содержаться в ней временно или стабильно. Стабильно содержащиеся полинуклеотидные молекулы могут быть внехромосомными и реплицироваться автономно, или быть интегрированными в хромосомный материал клетки и реплицироваться неавтономно.

Предполагается, что может быть использован любой из способов для введения полинуклеотидной молекулы, раскрытой в данном описании, в клетку. Способы, используемые для введения нуклеиновокислой молекулы в клетку, включают химически опосредованную трасфекцию, такую как, например, опосредованную фосфатом кальция, опосредованную диэтиламинодекстраном (DEAE), опосредованную липидами, опосредованную полиэтиленимином (PEI), опосредованную полилизином и полибреном; физически опосредованную трасфекцию, такую как, например, доставка биолистических частиц, микроинъекция, протопластное слияние и электропорация; опосредованную вирусом трансфекцию, такую как, например, опосредованную ретровирусом трансфекцию, но не ограничиваются перечисленными. Специалисту понятно, что выбор специфического способа для введения экспрессонного конструкта в клетку будет зависеть, в частности, от того, будет ли содержать клетка экспрессиионный конструкт временно или стабильно. Эти протоколы являются рутинными процедурами, известными для специалиста из уровня техники или из данного описания, смотри, например, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp.16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol.3, 3^rd ed. 2001). Примеры введения дрожжевого экспрессонного конструкта, раскрытого в данном описании, в дрожжевую клетку описаны в Примерах 2 и 4-6.

Варианты данного описания раскрывают, в частности, дрожжевую клетку, содержащую дрожжевой экспрессиионный конструкт, включающий полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, как раскрыто в данном описании. Согласно одному аспекту данного варианта осуществления настоящего изобретения дрожжевая клетка временно содержит кратковременно дрожжевой экспрессиионный конструкт, включающий полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, как раскрыто в данном описании. Согласно другому аспекту данного варианта осуществления настоящего изобретения, дрожжевая клетка стабильно содержит дрожжевой экспрессиионный конструкт, включающий полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, как раскрыто в данном описании. Согласно аспектам данного варианта осуществления настоящего изобретения, дрожжевая клетка является клеткой штамма Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae или Yarrowia lipolytica. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, дрожжевой экспрессиионный конструкт является экспрессонным вектором Pichia pastoris, экспрессонным вектором Pichia methanolica, экспрессонным вектором Pichia angusta, экспрессонным вектором Schizosaccharomyces pombe, экспрессонным вектором Saccharomyces cerevisiae или экспрессонным вектором Yarrowia lipolytica. Согласно дополнительным аспектам данного варианта осуществления изобретения, полинуклеотидная молекула, кодирующая ЭK, является SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любым их нуклеотидным вариантом или комплементом.

Варианты данного описания раскрывают, в частности, экспрессрование ЭK из полинуклеотидной молекулы, раскрытой в данном описании, с использованием дрожжевой экспрессонной системы. экспрессрование полинуклеотидной молекулы с использованием дрожжевой экспрессонной системы может включать любую из ряда характеристик, включающих индуцибельную экспрессю, неиндуцибельную экспрессю, конститутивную экспрессю, опосредованную вирусом экспрессю, стабильно интегрированную экспрессю и временную экспрессю, но не ограничиваются перечисленными. Эти протоколы являются рутинными процедурами, известными для специалиста из уровня техники и из данного описания. Примеры дрожжевой экспрессонной системы включают экспресионный набор EASYSELECT™ Pichia (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), экспресионный набор EASYSELECT™ ECHO™ Pichia (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), экспресионный набор Pichia methanolica (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), секретирующий протеин набор PICHIAPINK™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), набор экспрессонного вектора YES-ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) и экспрессонную систему SPECTRA™ S. pombe (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), но не ограничиваются названными. Примеры экспрессрования ЭK из полинуклеотидной молекулы, раскрытой в данном описании, с использованием дрожжевой экспрессонной системы описаны в Примерах 2-6.

В одном варианте осуществления изобретения, количество ЭK, экспрессрованной из дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант, увеличено в сравнении с количеством ЭK, экспрессрованной из SEQ ID №2.

Согласно аспектам данного варианта осуществления настоящего изобретения, количество ЭK, экспрессрованной из дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант, увеличено, например, по меньшей мере в 0,5 раз, по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 35 раз или по меньшей мере в 40 раз в сравнении с количеством ЭK, экспрессрованнным из SEQ ID №2. Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, количество ЭK, экспрессрованной из дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант, увеличено, например, от, приблизительно, 1 раза до, приблизительно, 5 раз, от, приблизительно, 1 раза до, приблизительно, 10 раз, от, приблизительно, 1 раза до, приблизительно, 15 раз, от, приблизительно, 1 раза до, приблизительно, 20 раз, от, приблизительно, 1 раза до, приблизительно, 25 раз в сравнении с количеством ЭK, экспрессрованным из SEQ ID №2.

Согласно другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, количество ЭK, экспрессрованной из дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант, составляет, от, приблизительно, 100 мг/л до, приблизительно, 30 г/л. Согласно аспектам данного вариант осуществления изобретения, количество ЭK, экспрессрованной из дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант, может быть, например, по меньшей мере 100 мг/л, по меньшей мере 500 мг/л, по меньшей мере 1 г/л, по меньшей мере 1,5 г/л, по меньшей мере 2,5 г/л, по меньшей мере 5 г/л, по меньшей мере 7,5 г/л, по меньшей мере 10 г/л, по меньшей мере 12,5 г/л, по меньшей мере 15 г/л, по меньшей мере 20 г/л, по меньшей мере 25 г/л или по меньшей мере 30 г/л. Согласно еще другим аспектам данного варианта осуществления изобретения, количество ЭK, экспрессрованной из дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант, может быть от, например, приблизительно, 100 мг/л до, приблизительно, 5 г/л, от, приблизительно, 100 мг/л до, приблизительно, 10 г/л, от, приблизительно, 100 мг/л до, приблизительно, 15 г/л, от, приблизительно, 500 мг/л до, приблизительно, 5 г/л, от, приблизительно, 500 мг/л до, приблизительно, 10 г/л, от, приблизительно, 500 мг/л до, приблизительно, 15 г/л, от, приблизительно, 1 г/л до, приблизительно, 5 г/л, от, приблизительно, 1 г/л до, приблизительно, 10 г/л, от, приблизительно, 1 г/л до, приблизительно, 15 г/л, от, приблизительно, 1 г/л до, приблизительно, 20 г/л, от, приблизительно, 5 г/л до, приблизительно, 10 г/л, от, приблизительно, 5 г/л до, приблизительно, 15 г/л, от, приблизительно, 5 г/л до, приблизительно, 20 г/л, от, приблизительно, 5 г/л до, приблизительно, 25 г/л, от, приблизительно, 5 г/л до, приблизительно, 30 г/л.

ЭK, экспрессрованная из дрожжевого экспрессонного конструкта, раскрытого в данном описании, может быть очищена от дрожжевых клеток или культуральной среды с использованием любого из ряда известных способов. Примеры способов очистки включают осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислую экстракцию, ионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, лецитиновую хроматографию, аффинную хроматографию, гидрофобную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, адсорбционную хроматографию, гидроксиапатитную хроматографию, жидкостную хроматографию быстрого разрешения (FPLC) и высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), но не ограничиваются перечисленными. Связывающие частицы представляющего интерес целевого пептида могут быть присоединены к любому из ряда веществ, включая смолы, агарозу и магнитные шарики, не ограничиваясь перечисленными. Кроме того, может быть использован любой из способов обработки, включая обработку по партиям или с использованием колонок с подачей самотеком. Для обеспечения восстановления функционально-активного ΒοΝТ/А, кодируемого нуклеиновокислыми молекулами, раскрытыми в данном описании, необходимым также может быть рефолдинг протеина. Примеры специфических протоколов для очистки и восстановления протеинов описаны, например, John Abelson et al., Guide to Protein Purification, (Academic Press, 1990), Protein Purification: Principles and Practice, (Robert K. Scopes et al. eds., Springer Verlag, 3rd ed. 1994), Protein Purification Techniques: A Practical Approach, (Simon Roe ed., Oxford University Press, 2nd ed. 2001), Molecular Cloning A Laboratory Manual, supra, (2001), Ian M. Rosenberg, Protein Analysis & Purification: Benchtop Techniques, (Springer Verlag, 2002), но не ограничиваются ими. Эти протоколы являются рутинными процедурами, известными для специалиста из уровня техники и из данного описания.

Количество ЭK может быть измерено во время экспрессии ЭK, после завершения экспрессии ЭK и/или после очистки ЭK с использованием любого из ряда известных способов. Примеры способов протеиновых измерений включают гель-электрофорез и окрашивание протеина, вестерн-блоттинг, ELISA, мечение протеинов, УФ абсорбцию, метод Лоури, биуретовый метод, метод Смита с медью/бицинхониновой кислотой (ВСА), метод Брэдфорда, но не ограничиваются ими, смотри, например, Christine V. Sapan et al., Colorimetric Protein Assay Techniques, 29(2) Biotechnol. Appl. Biochem. 99-108, (1999).

Особенности данного описания раскрывают, в частности, способы расщепления полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK с использованием ЭK. Согласно одному варианту осуществления изобретения, способ расщепления полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK, включает этап контактирования полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK, с ЭK, продуцируемой посредством экспрессии дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант или любой усеченный вариант в дрожжевых клетках, где контактирование рекомбинантного полипептида с энтерокиназой приводит к специфическому расщеплению сайта расщепления ЭK. Согласно одному аспекту данного варианта воплощения изобретения сайт расщепления ЭK представляет собой SEQ ID №1. Полипептид может природным образом содержать сайт расщепления ЭK или может быть рекомбинантным полипептидом, генетически сконструированным, чтобы содержать сайт расщепления ЭK.

Особенности данного описания раскрывают, в частности, способы приготовления полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK, с использованием ЭK. В одном из вариантов осуществления данного изобретения способ приготовления полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK, включает этап контактирования полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK, с энтерокиназой, продуцируемой посредством экспрессии дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любой их полинуклеотидный вариант или любой их усеченный вариант, в дрожжевых клетках, где контактирование рекомбинантного полипептида с энтерокиназой приводит к специфическому расщеплению сайта расщепления ЭK. Согласно одному из аспектов данного варианта осуществления изобретения, сайт расщепления ЭK представляет собой SEQ ID №1. Полипептид может природным образом содержать сайт расщепления ЭK или может быть рекомбинантным полипептидом, генетически сконструированным, чтобы содержать сайт расщепления ЭK.

Способы использования ЭK для расщепления или получения полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK, могут быть проведены с использованием стандартного in vitro способа протеолитического расщепления. Например, полипептид, содержащий сайт расщепления ЭK, добавляют в реакционную смесь, содержащую 20 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 50 мМ NaCl, 20 мМ CaCl₂ и ЭK, полученную способом, раскрытым в этом описании, и инкубируют при от, приблизительно, 20°С до, приблизительно, 22°С на протяжении от, приблизительно, 2 часов до, приблизительно, 16 часов. Объем расщепленного или приготовленного таким образом полипептида может быть оценен с использованием стандартных процедур, таких как, например, анализ SDS-PAGE, иммунный вестерн-блоттинг или ELISA, или анализ активности полипептида. Расщепленный или приготовленный полипептид также может быть очищен с использованием стандартных процедур. Способы, полезные для расщепления или приготовления полипептида, содержащего сайт расщепления ЭK, описаны, например, в публикациях Ogiwara, et al., Modified Enteropeptidase Protein, US 8,013,137; La Vallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, US 6,746,859, включенных в полном объеме в данное описание путем ссылки.

Особенности описания данного изобретения могут быть описаны следующим образом:

1. Выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая SEQ ID №4, SEQ ID №6, их полинуклеотидный вариант или их усеченный вариант и любой их комплемент.

2. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где полинуклеотидный вариант по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или, по меньшей мере на 99% идентичный полинуклеотидной последовательности SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементу.

3. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где полинуклеотидный вариант имеет от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 10, от приблизительно, 1 до, приблизительно, 15, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 20, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 35, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 50, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 55, или, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 60 несмежных нуклеотидных замещений в сравнении с SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементом.

4. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где полинуклеотидный вариант имеет, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 10, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 15, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 20, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 35, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 50, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 55 или от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 60 смежных нуклеотидных замещений в сравнении с SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементом.

5. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где полинуклеотидный вариант гибридизирует с полинуклеотидной молекулой, содержащей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплемент в жестких условиях.

6. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где полинуклеотидный вариант имеет по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 вариантных ко донов из Таблицы 1, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

7. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где полинуклеотидный вариант имеет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 вариантных кодонов из Таблицы 2, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

8. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где усеченный вариант имеет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 нуклеотидов, удаленных с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или комплемента.

9. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 1, где усеченный вариант имеет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 кодонов, удаленных с 5'-конца, 3'-конца или с 5'-конца и 3'-конца последовательностей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или комплемента.

10. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно вариантам осуществления 1-9, где выделенная полинуклеотидная молекула является дрожжевым вектором экспрессии.

11. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 10, где дрожжевой вектор экспрессии представляет собой экспрессиионный вектор Pichia pastoris, экспрессиионный вектор Pichia methanolica, экспрессиионный вектор Pichia augusta, экспрессиионный вектор Schizosaccharomyces pombe, экспрессиионный вектор Saccharomyces cerevisiae и экспрессиионный вектор Yarrowia lipolytica.

12. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 10 или 11, где дрожжевой вектор экспрессии включает конститутивный промотор, конститутивный энхансер, индуцибельный промотор, индуцибельный энхансер или любую их комбинацию, которые направляют экспрессю полинуклеотидной молекулы согласно вариантам осуществления 1-9.

13. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 12, где индуцибельный промотор является промотором АОХ1 (альдегидоксидаза 1).

14. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно вариантам осуществления 10-14, где дрожжевой вектор экспрессии включает полинуклеотидный участок, кодирующий сигнальную последовательность, которая направляет ЭK, кодируемую полинуклеотидной молекулой согласно вариантам осуществления 1-9, к специфическим клеточным или внеклеточным компартментам.

15. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно вариантам осуществления 10-14, где дрожжевой вектор экспрессии включает полинуклеотидный участок, кодирующий сигнальную последовательность, которая направляет ЭK, кодируемую полинуклеотидной молекулой согласно вариантам осуществления 1-9, в клеточную цитоплазму, клеточные органеллы или внеклеточную культуральную среду.

16. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно варианту осуществления 14 или 15, где сигнальная последовательность является пептидом фактора альфа.

17. Выделенная полинуклеотидная молекула согласно вариантам осуществления 1-9, где выделенная полинуклеотидная молекула является дрожжевым экспрессонным конструктом.

18. Дрожжевой экспрессиионный конструкт, содержащий дрожжевой вектор экспрессии и полинуклеотидную молекулу, которая содержит SEQ ID №4, SEQ ID №6, их полинуклеотидный вариант или усеченный вариант, или любой их комплемент.

19. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно варианту осуществления 18, где полинуклеотидный вариант, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97% по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен полинуклеотидной последовательности SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементу.

20. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно варианту осуществления 18, где полинуклеотидный вариант имеет от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 10, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 15, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 20, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 35, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 50, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 55 или от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 60 несмежных нуклеотидных замещений в сравнении с SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементом.

21. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно варианту осуществления 18, где полинуклеотидный вариант имеет от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 10, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 15, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 20, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 1 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 25, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 30, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 35, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 5 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 40, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 45, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 50, от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 55 или от, приблизительно, 10 до, приблизительно, 60 смежных нуклеотидных замещений в сравнении с SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплементом.

22. Дрожжевой экспрессиионный конструкт, согласно варианту осуществления 18, где полинуклеотидный вариант гибридизирует с полинуклеотидной молекулой, содержащей SEQ ID №4, SEQ ID №6 или их комплемент, в жестких условиях.

23. Дрожжевой экспрессиионный конструкт, согласно варианту осуществления 18, где полинуклеотидный вариант имеет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 вариантных кодонов из Таблицы 1, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

24. Дрожжевой экспрессиионный конструкт, согласно варианту осуществления 18, где полинуклеотидный вариант имеет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 вариантных кодонов из Таблицы 2, замещающих соответствующий кодон, присутствующий в SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

25. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно варианту осуществления 18, где усеченный вариант имеет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 нуклеотидов, удаленных с 5'-конца, 3'-конца, или 5'-конца и 3'-конца последовательности SEQ ID №4 или SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или любого их комплемента.

26. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно варианту осуществления 18, где усеченный вариант имеет, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 кодонов, удаленных с 5'-конца, 3'-конца, или 5'-конца и 3'-конца последовательности SEQ ID №4 или SEQ ID №6 или любого их нуклеотидного варианта или любого их комплемента.

27. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно вариантам осуществления 18-26, где дрожжевой вектор экспрессии представляет собой экспрессиионный вектор Pichia pastoris, экспрессиионный вектор Pichia methanolica, экспрессиионный вектор Pichia augusta, экспрессиионный вектор Schizosaccharomyces pombe, экспрессиионный вектор Saccharomyces cerevisiae и экспрессиионный вектор Yarrowia lipolytica.

28. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно варианту осуществления 27, где дрожжевой вектор экспрессии включает конститутивный промотор, конститутивный энхансер, индуцибельный промотор, индуцибельный энхансер или любую их комбинацию, которые направляют экспрессю полинуклеотидной молекулы, согласно вариантам осуществления 1-9.

29. Дрожжевой экспрессиионный конструкт, согласно варианту осуществления 28, где индуцибельный промотор является промотором АОХ1 (альдегидоксидаза 1).

30. Дрожжевой экспрессиионный конструкт, согласно вариантам осуществления 27-29, где дрожжевой вектор экспрессии включает полинуклеотидный участок, кодирующий сигнальную последовательность, которая направляет ЭK, кодируемую полинуклеотидной молекулой согласно вариантам осуществления 1-9, к специфическим клеточным и внеклеточным компартментам.

31. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно вариантам осуществления 27-29, где дрожжевой вектор экспрессии включает полинуклеотидный участок, кодирующий сигнальную последовательность, которая направляет ЭK, кодируемую полинуклеотидной молекулой согласно вариантам осуществления 1-9, в клеточную цитоплазму, целлюлярные органеллы или внеклеточную культуральную среду.

32. Дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно варианту осуществления 30 или 31, где сигнальная последовательность является пептидом фактора альфа.

33. Дрожжевая клетка, содержащая полинуклеотид согласно вариантам осуществления 1-17.

34. Дрожжевая клетка согласно варианту осуществления 33, где экспрессиионный конструкт временно содержится в дрожжевой клетке.

35. Дрожжевая клетка согласно варианту осуществления 33, где экспрессиионный конструкт стабильно содержится в дрожжевой клетке.

37. Дрожжевая клетка согласно вариантам осуществления 33-35, где дрожжевая клетка включает в себя клетку штамма Pichia pastoris, клетку штамма Pichia methanolica, клетку штамма Pichia angusta, клетку штамма Schizosaccharomyces pombe, клетку штамма Saccharomyces cerevisiae или клетку штамма Yarrowia lipolytica.

38. Дрожжевая клетка согласно вариантам осуществления 33-35, где дрожжевая клетка представляет собой клетку штамма Pichia pastoris.

39. Дрожжевая клетка, содержащая дрожжевой экспрессиионный конструкт согласно вариантам осуществления 18-32.

40. Дрожжевая клетка согласно варианту осуществления 39, где экспрессиионный конструкт временно содержится в дрожжевой клетке.

41. Дрожжевая клетка согласно варианту осуществления 39, где экспрессиионный конструкт стабильно содержится в дрожжевой клетке.

42. Дрожжевая клетка согласно вариантам осуществления 39-41, где дрожжевая клетка содержит клетку штамма Pichia pastoris, клетку штамма Pichia methanolica, клетку штамма Pichia angusta, клетку штамма Schizosaccharomyces pombe, клетку штамма Saccharomyces cerevisiae или клетку штамма Yarrowia lipolytica.

43. Дрожжевая клетка согласно вариантам осуществления 39-41, где дрожжевая клетка является клеткой штамма Pichia pastoris.

44. Способ продуцирования энтерокиназы, включающий этап экспрессрования энтерокиназы с использованием дрожжевой клетки согласно вариантам осуществления 33-43.

45. Способ согласно варианту осуществления 44, где способ дополнительно включает очистку энтерокиназы.

46. Способ расщепления рекомбинантного полипептида, включающий этап контактирования рекомбинантного полипептида, который содержит сайт расщепления SEQ ID №1, с энтерокиназой, где энтерокиназа получена способом согласно вариантам осуществления 44 или 45, где контактирование рекомбинантного полипептида с энтерокиназой приводит к специфическому расщеплению SEQ ID №1.

47. Способ приготовления рекомбинантного полипептида, включающий этап контактирования рекомбинантного полипептида, который содержит сайт расщепления SEQ ID №1, с энтерокиназой, где энтерокиназа получена способом согласно вариантам осуществления 44 или 45, где контактирование рекомбинантного полипептида с энтерокиназой приводит к специфическому расщеплению SEQ ID №1.

ПРИМЕРЫ

Для более полного понимания рассматриваемых репрезентативных вариантов изобретения, не ограничивая их объем, предоставлены следующие иллюстративные примеры. Эти примеры не должны истолковываться как ограничивающие изобретение каким-либо вариантом осуществления, раскрытым в данном описании, относящимся к способам экспрессии ЭK с использованием дрожжевой экспрессонной системы, раскрытой в данном описании.

Пример 1

Синтез полинуклеотидной молекулы, кодирующей ЭK

Полинуклеотидная молекула SEQ ID NO:4 синтезирована с использованием стандартных химических процедур (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA). Например, олигонуклеотиды длиною от 20 до 50 оснований синтезировали, используя стандартный фосфорамидитный синтез. Эти олигонуклеотиды гибридизировали в двухцепочечные дуплексы, связанные вместе в полноразмерную полинуклеотидную молекулу. Эту полинуклеотидную молекулу клонировали, используя стандартные молекулярно-биологические способы, в вектор pUCBHB1 возле сайта SmaI, что бы получить pUCBHB1/ЭK. Синтезированную полинуклеотидную молекулу верифицировали с помощью секвенирования, используя Big Dye Terminator™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и секвенсер ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Подобную стратегию синтеза использовали для получения полинуклеотидной молекулы SEQ ID NO:6, нуклеотидных вариантов SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, и усеченных вариантов SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.

При необходимости, оптимизированную для экспрессии полинуклеотидную молекулу, базирующуюся на SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, синтезируют с целью улучшения экспрессии в клетках дрожжей. Полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, модифицируют для того, чтобы она: 1) содержала синонимичные кодоны, типично присутствующие в полинуклеотидных молекулах природного происхождения предпочтительных штаммов дрожжей; 2) содержала долю G+C, более близко совместимую с средней долей G+C в полинуклеотидных молекулах природного происхождения предпочтительных штаммов дрожжей; 3) снижала полимононуклеотидные участки, найденные в пределах полинуклеотидной молекулы; и/или 4) элиминировала внутренние регуляторные или конструкционные сайты, найденные в пределах полинуклеотидной молекулы, смотри, например, Lance Ε. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, международную патентную заявку WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type А, международную патентную заявку WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006), включенные в данное описание в полном объеме посредством ссылки. Как только завершится оптимизация последовательности, синтезируют олигонуклеотиды длиною от 20 до 50 оснований, используя стандартный фосфорамидитный синтез. Эти олигонуклеотиды гибридизировали в двухцепочечные дуплексы, связанные вместе в полноразмерную полинуклеотидную молекулу. Эту полинуклеотидную молекулу клонировали, используя стандартные молекулярно-биологические способы, в вектор pUCBHB1 возле сайта SmaI, чтобы получить pUCBHB1/ЭK. Синтезированную полинуклеотидную молекулу верифицировали с помощью секвенирования, используя Big Dye Terminator™ Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) и секвенсер ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, С А). Подобную стратегию синтеза использовали для получения полинуклеотидной молекулы, нуклеотидных вариантов SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, или усеченных вариантов SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.

Пример 2

Конструирование и экспрессрование pPpT4Alpha/ЭK

Чтобы сконструировать дрожжевой экспрессиионный конструкт, содержащий полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, как описано в данной заявке, конструкт pJ201/rEK, содержащий SEQ ID NO:4, расщепляют с помощью XhoI и NotI, чтобы отделить вставку SEQ ID NO:4. Полученный рестрикционный фрагмент очищают с помощью набора для гель-экстракции QIAQUICK^® (QIAGEN, Inc., Valencia, CA), и фрагмент SEQ ID NO:4 субклонируют в вектор pPpT4Alpha_S (Ingenza, Ltd., Midlothian, UK), который был расщеплен рестрикционными эндонуклеазами XhoI и NotI. Вектор pPpT4Alpha_S включает сигнальную последовательность секреции Фактора альфа, часть промотора AOX1 и последовательности завершения транскрипта AOD и АОХ1, открытую рамку считывания ZEOCIN™. Фрагмент и вектор лигируют, используя протокол Т4 ДНК лигазы с получением pPpT4Alpha/rЭK, аликвоту этой лигационной смеси трансформируют с помощью стандартного электропорационного протокола в электрокомпетентные клетки NEB10 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA). Трансформированные клетки помещают в чашки Lennox с 1,5% агаром Луриа-Бертани (рН 7,0), содержащим 25 мкг/мл ZEOCIN™, и помещают в инкубатор при 37°С на всю ночь. Резистентные к ZEOCIN™ колонии отбирали в качестве кандидатов для экспрессонных конструктов. Резистентные колонии выращивали, собирали и выделяли плазмидную ДНК, используя стандартные способы, кандидаты экспрессонных конструктов отбирали с помощью рестрикционного расщепления, используя XhoI и NotI, XbaI, или NdeI для определения присутствия и ориентации заданного инсерционного фрагмента. Культуры, содержащие желательный экспрессиионный конструкт pPpT4Alpha/rЭK выращивали, собирали и выделяли плазмидную ДНК, используя стандартные способы, и кандидаты экспрессонных конструктов секвенировали для определения наличия заданного экспрессонного конструкта. Такая стратегия клонирования дает дрожжевой экспрессиионный конструкт, содержащий SEQ ID NO:4. Подобную стратегию применяли для получения экспрессонного конструкта pPpT4Alpha/ЭK, включающего SEQ ID NO:6, нуклеотидный вариант SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, или усеченный вариант SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6. Альтернативно, полинуклеотидная молекула SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, нуклеотидный вариант SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, усеченный вариант SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6 синтезировали, как описано в Примере 1.

Для конструирования дрожжевых клеток, экспрессрующих энтерокиназу, которая кодируется последовательностью SEQ ID NO:4, молекула ДНК из экспрессонного конструкта pPpT4Alpha/rЭK была амплифицирована в полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием прямого праймера АОХ с последовательностью SEQ ID NO:8 и обратного праймера PUC с последовательностью SEQ ID NO:9 для получения кассеты линейного интегрирования. Первые пять пар оснований прямого праймера АОХ содержат сайт BglII, который не является идентичным последовательности ДНК pPpT4Alpha/ЭK. Прямой праймер АОХ связывается после участка, который является частью промотора АОХ1. Несмотря на то, что полноразмерный ген АОХ1 не присутствует в кассете линейной интеграции, весь полноразмерный ген АОХ1 реконструируется после интегрирования с хромосомой P. pastoris. Полученный линеаризированный экспрессиионный конструкт трансформируют в подходящий штамм CBS7435 P. pastoris Mut^S, используя метод электропорации. Трансформационную смесь помещают в агаровые чашки с 1,5% дрожжей, пептона, декстрозы и сорбитола (YPDS) (рН 7,5), содержащие 100 мкг/мл, 250 мкг/мл или 500 мкг/мл ZEOCIN™ и помещают в инкубатор при 28-30°С на 1-3 дня. Селекцию трансформантов, интегрирующих фрагмент pPpT4Alpha/ЭK у локуса 5' АОХ1, определяют по колониям, резистентным к ZEOCIN™. Из разных чашек YPDS, содержащих разные концентрации ZEOCIN™, и инокулированных в жидкой среде дрожжей, пептона, декстрозы (YPD), содержащей 100 мкг/мл ZEOCIN™, были отобраны шестьдесят две колонии. Выделенные дрожжевые клеточные линии выращивали, как и предполагалось, на жидкой среде YPD, содержащей ZEOCIN™, определяя штаммы, резистентные к Zeocin и содержащие интегрированную кассету pPpT4Alpha/ЭK. Аликвоты культур YPD, содержащие выделенные клеточные линии дрожжей, помещали в пробирки с 1 мл жидкой среды YPD, содержащей 10% (об./об.) глицерола для культивирования установленных клеточных линий, пробирки хранили при -80°С. Подобную стратегию использовали для получения дрожжевых клеточных линий, экспрессрующих энтерокиназу SEQ ID NO:6, нуклеотидный вариант SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6, или усеченный вариант SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6.

Для проверки присутствия интегрированной кассеты pPpT4Alpha/E и определения номера генной копии ЭK каждой выделенной дрожжевой клеточной линии был проведен анализ PCR 62 выделенных клеточных линий. Один миллилитр был удален из оговоренной выше культуры YPD, его подвергли лизису, выделили геномную ДНК, используя стандартные процедуры. Выделенную геномную ДНК подвергли PCR амплификации на протяжении 29 циклов, используя энтерокиназный прямой праймер SEQ ID NO:10 и энтерокиназный обратный праймер SEQ ID NO:11 с целью продуцирования из гена ЭK продукта, состоящего из 250 пар оснований. После завершения амплификации реакционную смесь перерастворяли в 0,8% агарозном геле, содержащем полинуклеотидное пятно рядом с лэддером 2-log ДНК размером 0,1-10 т.н. Эти эксперименты подтверждают, что из 61 протестированной клеточной линии был генерирован ожидаемый фрагмент ЭK, состоящий из 250 пар оснований. PCR амплификацию повторили, используя те же геномные препараты ДНК, но проводя только 18 циклов, для определения относительной копийности между штаммами. Хотя наблюдался относительно низкий уровень изменчивости, четыре клеточные линии показали повышенную геномную копийность в сравнении с остальными.

Пример 3

Анализ энтерокиназной активности

Для того, что бы проверить качественное и количественное наличие экспрессрованной энтерокиназы, клеточные линии, содержащие интегрированную кассету pPpT4Alpha/ЭK, были проанализированы с использованием жидкостно-колориметрического анализа энтерокиназы, SDS-PAGE, вестерн-блоттинг и ELISA. Для индуцирования экспрессии энтерокиназы из интегрированной кассеты pPpT4Alpha/ЕК аликвоту из каждой установленной клеточной линии инокулировали во встряхиваемые колбы на 100 мл, содержащие по 10 мл ростовой среды, включающей 1,34% (масс./об.) основы азотного агара (YNB), 200 мМ фосфатного буфера, 4×10^-5% (масс./об.) биотина и 1% (об./об.) глицерола. Инокуляты выращивали при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 оборотов в минуту) на протяжении, приблизительно, 60-65 часов. Клетки собирали центрифугированием (3000 g при 22°С на протяжении 5 минут). Для индуцирования энтерокиназной экспрессии клеточные таблетки ресуспендировали в 1 мл среды для первичной индукции, содержащей 1,34% (масс./об.) основы азотного агара (YNB), 200 мМ фосфатного буфера, 4×10^-5% (масс./об.) биотина и 5% (об./об.) метанола. Клетки культивировали при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин) в течение, приблизительно 8-10 часов. Культуры загружали 100 мкл метанола, культивировали на протяжении, приблизительно, 16-18 часов и добавляли дополнительные 100 мкл метанола к среде каждые 24 часа, финальная загрузка метанолом состоялась через, приблизительно, 72-74 часа после индукции. Для сравнения данных, полученных из образцов встряхиваемых колб, сравнительный тестовый штамм В18 (Экспрессиионный конструкт pPpT4Alpha/EK-HIS штамма CBS7435 P. pastoris Muts, который продуцирует His-теговую энтерокиназу) помещали в дубликатные встряхиваемые колбы рядом с интегрированными штаммами.

Для определения ферментативной активности экспрессрованной энтерокиназы образцы отбирали на протяжении курса развития культуры и анализировали на наличие энтерокиназной активности, используя жидкостно-колориметрический анализ. Тестовую аликвоту среды отбирали из дрожжевых культур, описанных выше, через, приблизительно, 0 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа и 96 часов после индукции. Тестовые аликвоты добавляли в пробирки и дважды центрифугировали при 14000 об./мин для удаления клеток. Аликвоту образца приготовленной среды потом добавляли в реакционную смесь, содержащую 1 мМ колориметрического пептидного субстрата N-карбобензилокси-Lys-тиобензилового эфира (Z-Lys-SBZL; Bachem, AG, Bubendorf, CH), в присутствии 5,5'дитио-бис (2-нитробензойная кислота) (DTNB). Реакция расщепления инициирует обесцвечивание желтой окраски, а начальную скорость измеряли на планшете-ридере кинетическим способом при оптической плотности 405 нм. Концентрацию энзима доводили для обеспечения разведений образцов согласно диапазону линейности способа (0-100 mOD/мин). Образцы анализировали в трех повторностях с негативным и позитивным контролем.

Исходя из результатов анализа энтерокиназной активности всех штаммов, жидкостно-колориметрический анализ энтерокиназной активности был повторен с использованием четырех установленных дрожжевых клеточных линий с наивысшей энтерокиназной активностью, обозначенных как YCL-48, YCL-49, YCL-98 и YCL-99, и двух клеточных линий с самой низкой энтерокиназной активностью, обозначенных как YCL-40 и YCL-88. Все образцы анализировали в трех повторностях, используя единовременные субстраты. На Фигуре 1 показана средняя энтерокиназная активность каждой клеточной линии в зависимости от времени пост-индукции. Величина ошибки указывает 95% доверительный интервал между значениями трех повторностей. Исходя из полученных данных, клеточная линия YCL-49 имела наивысшую энтерокиназную активность, a YCL-88 - самую низкую активность.

Для определения идентичности и качества экспрессрованной энтерокиназы в момент времени 96-98 часов после индукции, были взяты образцы YCL-40, YCL-48, YCL-49, YCL-88, YCL-98 и YCL-99 и проанализированы с использованием SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Образцы добавляли в 2×SDS буфер для образцов и разделяли с помощью MOPS электрофореза в полиакриламидном геле, используя 10-20% Bis-Tris сборные полиакриламидные гели (Expedeon, Inc, San Diego, CA) под воздействием денатурирования и восстановления. Для анализа SDS-PAGE гели прокрашивали Бриллиантовым Голубым Кумасси, чтобы выявить характер исчерченности протеинов. Для вестен-блоттинга разделенные полипептиды переносили на нитроцеллюлозу и пропитывали α-энтерокиназным антителом. Энтерокиназный полипептид был отчетливо виден на SDS-PAGE и вестерн-блоттах как одна полоса около 38 кДа. Электрофоретическая миграция показала, что энтерокиназа подверглась пост-трансляционной модификации. Кроме того, отсутствие каких-либо выявленных случайных полос показало высокое качество энтерокиназы, экспрессрованной из дрожжевых клеточных линий с интегрированной кассетой pPpT4Alpha/ЭK.

Для определения концентрации экспрессрованной энтерокиназы в момент времени 96-98 часов после индукции были взяты образцы YCL-49, YCL-88 и YCL-98 и проанализированы с использованием твердофазного иммуноферментного (ELISA). Из тестовых образцов были приготовлены серии разведений и проанализированы в трех повторностях вместе с определенными концентрациями коммерчески доступного стандарта рекомбинантной энтерокиназы (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Калибровочная кривая, полученная для серии разведений коммерческого стандарта, позволила определить количественные характеристики образцов YCL-49 и YCL-88. Результаты ELISA были использованы для количественного определения уровня энтерокиназного продукта, присутствующего в супернатанте образцов, полученных после выращивания и экспрессии интегрированных штаммов (Таблица 3).

Таблица 3. Анализ ELISA Образец Концентрация энтерокиназы В18 1,0 мкг/мл YCL-49 2,6 мкг/мл YCL-88 2,9 мкг/мл YCL-98 2,2 мкг/мл

Описанные выше анализы показали, что несколько установленных дрожжевых клеточных линий экспрессровали высококачественную, ферментативно активную энтерокиназу из интегрированной кассеты pPpT4Alpha/ЭK.

Пример 4

Конструирование и экспресся pPICZ A/EK-myc-His

Для конструирования дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, в соответствии с описанием, сайты рестрикционной эндонуклеазы, пригодные для клонирования функционально связанной нуклеиновокислой молекулы в вектор pPIC A (Invitrogen, Inc, Carlsbad, СА), присоединяют к 5'- и 3' концам SEQ ID №4, используя стандартные процедуры синтеза ДНК. Этот конструкт расщепляют рестрикционными энзимами следующим образом 1) отделяют SEQ ID №4, кодирующий энтерокиназу; и 2) адаптируют этот инсерт для функционального связывания с вектором pPIC А. Этот инсерт субклонируют, используя ДНК-лигазу Т4, в вектор pPIC А, который расщепляют с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, получая pPIC A/BoNT/E-myc-His. Лигационную смесь трансформируют в химический компонент клеток DH5α Ε. coli (Invitrogen, Inc, Carlsbad, СА), используя метод теплового шока, наносят на чашки с 1,5% низкосолевого агара Луриа-Бертани (рН 7,5), содержащего 25 мкг/мл ZEOCIN™, и помещают в инкубатор при 37°С на всю ночь. Бактерии, содержащие экспрессонные конструкты, идентифицируют как колонии, резистентные к ZEOCIN™. Кандидаты конструктов выделяют, используя щелочнолизисный способ миниподготовки плазмид, и анализируют с помощью рестрикционного картирования эндонуклеазного расщепления для определения присутствия и ориентации инсерта. Эта стратегия клонирования дает дрожжевой экспрессиионный конструкт, кодирующий энтерокиназу, функционально связанный с С-концевым c-myc, и полигистидиновыми связывающими пептидами. Подобную стратегию используют для получения экспрессонного конструкта pPIC А/ЭK, включающего SEQ ID №6, нуклеотидный вариант SEQ ID №4 или SEQ ID №6, или усеченный вариант SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

Для конструирования дрожжевой клеточной линии, экспрессрующей энтерокиназу, pPICZ А/ЭK-myc-His расщепляют пригодной рестрикционной эндонуклеазой (например, SacI, PmeI или BstXI), и полученный линеаризированный экспрессиионный конструктстрансформируют в подходящий штамм KM71H P. pastoris Mut^S, используя способ электропорации. Трансформационную смесь наносят на чашки с 1,5% агаром YPDS (рН 7,5), содержащим 100 мкг/мл ZEOCIN™, и помещают в инкубатор при 28-30°С на 1-3 дня. Отбирают трансформанты, интегрирующие pPICZ A/EK-myc-His на 5' конце локуса АОХ1, по колониям, резистентным к ZEOCIN™. Клеточные линии, интегрирующие конструкт pPICZ А/ЭK-myc-His, потом тестируют на наличие энтерокиназной экспрессии. Выделенные колонии тестовых клеточных линий, имеющие интегрированные pPICZ А/ЭK-myc-His, используют для инокуляции колб с перегородками, объемом 1,0 л, содержащих 100 мл среды MGYH, и выращивают при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин) до тех пор, пока культура не достигает OD₆₀₀=2-6 (в среднем 16-18 часов). Клетки собирают центрифугированием (3000 g при 22°С в течении 5 минут). Для индуцирования экспрессии клеточные таблетки ресуспендируют в 15 мл среды ММН и добавляют 100% метанола до конечной концентрации 0,5%. Культуры выращивают при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин) на протяжении шести дней. Дополнительный 100% метанол добавляют к культуре каждые 24 часа до конечной концентрации 0,5%. Тестовую аликвоту в 1,0 мл отбирают из культуры каждые 24 часа, начиная с времени ноль и заканчивая 144 часами. С помощью микроценрифугирования из аликвот собирают клетки, затем клеточные таблетки подвергают лизису, используя трехразовое замораживание-оттаивание в режиме 5 минут при -80°С, а затем 5 минут при 37°С. Лизисные образцы добавляют в 2×SDS буфер для образцов (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) и измеряют экспрессю из установленных клеточных линий с использованием SDS-PAGE и вестен-блоттинга (как описано в Примере 3). Клеточную линию KM71H P. pastoris Muts, демонстрирующую повышенный уровень экспрессии энтерокиназы, отбирают для крупномасштабной экспрессии с использованием коммерческих ферментационных процедур. Процедуры для крупномасштабной экспрессии являются такими, как указано выше, за исключением того, что объем культуры составляет 2,5 л ростовой среды MGYH в ферментере BioFlo 300, объемом 5 л, и концентрации всех реагентов повышают пропорционально этому объему. Для более подробного ознакомления с процедурами, описанными в этом примере, смотри EasySelect™ Pichia Expression Kit, version G, A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris, 122701, 25-0172 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Подобную стратегию используют для получения клеточной линии, экспрессрующей энтерокиназу с SEQ ID №6, нуклеотидный вариант с SEQ ID №4 или SEQ ID №6, или усеченный вариант с SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

Пример 5

Конструирование и экспресся pMET/ЭK-V5-His

Для конструирования дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, в соответствии с данным описанием, сайты рестрикционной эндонуклеазы, пригодные для клонирования функционально связанной нуклеиновокислой молекулы в вектор рМЕТ (Invitrogen, Inc, Carlsbad, СА) присоединяют к 5'- и 3' концам SEQ ID №4, используя стандартные процедуры синтеза ДНК. Этот конструкт расщепляют рестрикционными энзимами следующим образом 1) отделяют SEQ ID №4, кодирующий энтерокиназу; и 2) адаптируют этот инсерт для функционального связывания с вектором рМЕТ. Этот инсерт субклонируют, используя ДНК-лигазу Т4, в вектор рМЕТ, который расщепляют с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, получая pMET/BoNT/3-V5-His. Лигационную смесь трансформируют в химический компонент клеток DH5α Ε. coli (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), используя метод теплового шока, наносят на чашки с 1,5% низкосолевого агара Луриа-Бертани (рН 7,5), содержащего 100 мкг/мл ампицилина, и помещают в инкубатор при 37°С на всю ночь. Бактерии, содержащие экспрессонные конструкты, идентифицируют как колонии, резистентные к ампицилину. Кандидаты конструктов выделяют, используя щелочнолизисный способ миниподготовки плазмид, и анализируют с помощью рестрикционного картирования эндонуклеазного расщепления для определения присутствия и ориентации инсерта. Эта стратегия клонирования дает дрожжевой экспрессиионный конструкт, кодирующий энтерокиназу, функционально связанный с С-концевым V5, и полигистидиновыми связывающими пептидами. Подобную стратегию используют для получения экспрессонного конструкта рМЕТ/ЭK, включающего SEQ ID №6, нуклеотидный вариант SEQ ID №4 или SEQ ID №6, или усеченный вариант SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

Для конструирования дрожжевой клеточной линии, экспрессрующей энтерокиназу, pMET/BoNT/E3V5-His расщепляют пригодной рестрикционной эндонуклеазой (например, ApaI, AscI, FseI, PacI, KpnI или PstI), и полученный линеаризованный экспрессиионный конструкт трансформируют в подходящий штамм PMAD16 P. methanolica Mut^S, используя способ электропорации. Трансформационную смесь наносят на чашки с 1,5% агаром MD (рН 7,5), лишенным аденина, и помещают в инкубатор при 28-30°С на 3-4 дня. Селекцию трансформантов, интегрирующих pMET/ЭK-V5-His, определяют по колониям, растущим на аденин-дефицитной среде. Ade⁺ клеточные линии, интегрирующие конструкт рМЕТ/ЭK-V5-HiS, тестируют на наличие энтерокиназной экспрессии, используя мелкомасштабный экспрессиионный тест. Выделенные Ade⁺ колонии из тестовых клеточных линий, имеющих интегрированный pMET/ЭK-V5-His, используют для инокуляции 15 мл среды BMDY и выращивают при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин), пока культура не достигнет CD₆₀₀=2-10 (в среднем 16-18 часов). Клетки собирают центрифугированием (1500 g при 22°С на протяжении 5 минут). Для индуцирования экспрессии клеточные таблетки ресуспендируют в 5 мл среды BMMY, и культуры выращивают при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин). Через 24 часа отбирают аликвоту 500 мкл, и добавляют метанол до конечной концентрации 0,5%, и культуру выращивают при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин). Отбирают 500 мкл аликвоту и к культуре добавляют дополнительный метанол до конечной концентрации 0,5% каждые 24 часа на протяжении 3-5 дней. Собранные клетки центрифугируют (1500 g при 4°С на протяжении 5 минут), один раз промывают водой, и хранят клеточные таблетки при -80°С пока не понадобятся. Для определения экспрессии индуцированной энтерокиназы клеточные таблетки, отобранные в каждый момент времени, подвергают лизису, используя обработанные кислотой стеклянные шарики. Лизисные образцы добавляют к 2×SDS буфера для образцов (Invitrogen, Inc, Carlsbad, СА), а экспрессю из установленных клеточных линий измеряют с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга (как описано в Примере 3). Клеточную линию PMAD16 P. methanolica Mut^S, демонстрирующую повышенный уровень экспрессии энтерокиназы, отбирают для крупномасштабной экспрессии с использованием коммерческих ферментационных процедур. Процедуры для крупномасштабной экспрессии являются такими, как указано выше, за исключением того, что объем культуры составляет 2,5 л ростовой среды BMDY/BMMY в ферментере BioFlo 3000, объемом 5 л, и концентрации всех реагентов повышают пропорционально этому объему. Для более подробного ознакомления с процедурами, описанными в этом примере, смотри P. methanolica Expression Kit, version С, A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia methanolica, 062101, 25-0288 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, СА). Подобную стратегию использовали для получения клеточной линии, экспрессрующей энтерокиназу с SEQ ID №6, нуклеотидный вариант с SEQ ID №4 или SEQ ID №6, или усеченный вариант с SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

Пример 6

Конструирование и экспресся pYES2/ЭK-V5-His

Для конструирования дрожжевого экспрессонного конструкта, содержащего полинуклеотидную молекулу, кодирующую ЭK, в соответствии с данным описанием, сайты рестрикционной эндонуклеазы, пригодные для клонирования функционально связанной нуклеиновокислой молекулы в вектор pYES2 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) присоединяют к 5'- и 3' концам SEQ ID №4, используя стандартные процедуры синтеза ДНК. Этот конструкт расщепляют рестрикционными энзимами следующим образом 1) отделяют SEQ ID №4, кодирующий энтерокиназу; и 2) адаптируют этот инсерт для функционального связывания с вектором pYES2. Этот инсерт субклонируют, используя ДНК-лигазу Т4, в вектор pYES2, который расщепляют с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, получая pYES2/EK-V5-His. Лигационную смесь трансформируют в химически компетентные клетки DH5α Ε. coli (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), используя метод теплового шока, наносят на чашки с 1,5% низкосолевого агара Луриа-Бертани (рН 7,5), содержащего 100 мкг/мл ампицилина, и помещают в инкубатор при 37°С на всю ночь. Бактерии, содержащие экспрессонные конструкты, идентифицируют как колонии, резистентные к ампицилину. Кандидаты конструктов выделяют, используя щелочнолизисный способ миниподготовки плазмид, и анализируют с помощью рестрикционного картирования эндонуклеазного расщепления для определения присутствия и ориентации инсерта. Эта стратегия клонирования дает дрожжевой экспрессиионный конструкт, кодирующий энтерокиназу, функционально связанный с С-концевым V5, и полигистидиновыми связывающими пептидами. Подобную стратегию используют для получения экспрессонного конструкта pYES2/ЭK, включающего SEQ ID №6, нуклеотидный вариант SEQ ID №4 или SEQ ID №6, или усеченный вариант SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

Для конструирования дрожжевой клеточной линии, экспрессрующей энтерокиназу, pYES2/ЭK-V5-His трансформируют в компетентный штамм INVSc1 S. Cerevisiae, используя основанный на литии трансформационной способ. Трансформационную смесь наносят на чашки с 2% минимальной агаровой средой SC (рН 7,5), содержащей 2% глюкозы, которые либо содержат 0,01% урацила, либо не имеют урацила, помещают при 28-30°С в инкубатор на 1-3 дня. Селекцию трансформантов, содержащих pYES2/ЭK-V5-His, определяют только по колониям, растущим на чашках с урацилом. Клетки, содержащие конструкт pYES2/ЭK-V5-His, тестируют по поводу энтерокиназной экспрессии, используя мелкомасштабный анализ экспрессии. Выделенные колонии из тестовых клеток, содержащих pYES2/ЭK-V5-His, использовали для инокулирования пробирок на 50 мл, содержащих 15 мл среды SC, содержащей 2% глюкозы и 0,01% урацила, и выращивали всю ночь при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин). Определяли OD₆₀₀ культуры и отбирали аликвоты для получения клеточной концентрации 0,4 OD₆₀₀ в объеме 50 мл, эти аликвоты центрифугировали (1500 g при 22°С на протяжении 5 минут), и полученные клеточные таблетки ресуспендировали в среде SC, содержащей 20% галактозы и 10% раффинозы. Клетки выращивали при, приблизительно, 28-30°С в шейкерном инкубаторе (250 об./мин), аликвоты, объемом 5 мл, отбирали через 0 часов, 4 часа, 8 часов, 12 часов, 16 часов и 24 часа, для каждого образца определяли концентрацию OD₆₀₀. Собранные клетки центрифугировали (1500 об/мин при 4°С на протяжении 5 минут), один раз промывали водой, а клеточные таблетки сохраняли при -80°С пока не понадобятся. Для определения экспрессии индуцированного BoNT/Э-V5-His клеточные таблетки, отобранные в каждый момент времени, поддавали лизису, используя обработанные кислотой стеклянные шарики. Лизисные образцы добавляли к 2×SDS буфера для образцов (Invitrogen, Inc, Carlsbad, СА), а экспрессю из установленных клеточных линий измеряли с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга (как описано в Примере 3). Индукционные условия, приводящие к повышенным уровням экспрессии энтерокиназы, отбирали для крупномасштабной экспрессии с использованием коммерческих ферментационных процедур. Процедуры для крупномасштабной экспрессии являются такими, как указано выше, за исключением того, что объем культуры составляет 2,5 л ростовой среды BMDY/BMMY в ферментере BioFlo 3000, объемом 5 л, и концентрации всех реагентов повышают пропорционально этому объему. Для более подробного ознакомления с процедурами, описанными в этом примере, смотри pYES2/CT, pYES3/CT, and pYC2/CT Yeast Expression Constructs with C-terminal Tags and Auxotrophic Selection Markers, version E, 25-0304, Jan. 27, 2003 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, СА). Подобную стратегию использовали для получения клеточной линии, экспрессрующей энтерокиназу с SEQ ID №6, нуклеотидный вариант с SEQ ID №4 или SEQ ID №6, или усеченный вариант с SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

В заключение, следует понимать, что хотя варианты осуществления изобретения данной заявки описаны путем отсылки на специфические варианты осуществления изобретения, специалист в данной области техники легко определит, что эти раскрытые варианты осуществления изобретения, являются иллюстративными и, ни в коей мере, не должны рассматриваться как ограничивающие объем притязаний конкретными методологиями, протоколами и/или реагентами и т.п., раскрытыми в данном описании. По существу, различные модификации или изменения или альтернативные конфигурации объектов изобретения могут быть осуществлены в соответствии с идеей патента в пределах объема изобретения. И, наконец, терминология данного описании, применена только для описания частных случаев осуществления изобретения, и не предназначена ограничивать объем настоящего изобретения, определенный исключительно формулой изобретения. Следовательно, настоящее изобретение не ограничивается конкретно показанным и описанным здесь.

В настоящей заявке описаны определенные варианты осуществления настоящего изобретения, в том числе наилучший из известных авторам вариант осуществления данного изобретения. Безусловно, для среднего специалиста в данной области техники очевидными будут вариации этих описанных воплощений, исходя из вышеизложенного описания. Авторы изобретения ожидают, что специалисты будут использовать такие вариации соответствующим образом, и авторы данного изобретения предполагают осуществление данного изобретения иным образом, отличным от конкретно описанного здесь. Соответственно, это изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта, изложенного в прилагаемой формуле изобретения, как предусмотрено действующим законодательством. Кроме того, изобретение охватывает любые комбинации вышеописанных воплощений во всех возможных их вариациях, если здесь не указано иное или это явным образом не противоречит контексту изобретения.

Группы альтернативных воплощений, элементов или этапов настоящего изобретения не должны анализироваться как ограничения. Представитель каждой группы может рассматриваться или заявляться в формуле индивидуально или в любой комбинации с представителями других групп, описанных в данной заявке. Ожидается, что один или больше представителей группы могут быть включены или удалены из нее для удобства и/или с целью обеспечения патентоспособности. Когда любое такое включение или исключение происходит, то считается, что описание изобретения содержит группу с изменениями, следовательно, удовлетворяющую письменное описание всех групп Маркуша, используемых в присоединенной формуле.

Если не указано иное, то все числа, выражающие характеристику, элемент, количество, параметр, свойство, срок, и так далее, используемые в настоящем описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином «приблизительно». В соответствии с данным описанием, термин «приблизительно» обозначает, что характеристика, элемент, количество, параметр, свойство или срок охватывают диапазон плюс или минус десять процентов выше и ниже значения заявленной характеристики, элемента, количества, параметра, свойства или срока. Соответственно, если не указано противоположное, то числовые параметры, сформулированные в описании и приложенной формуле являются приблизительными, так что они могут варьировать. Как минимум, и не в качестве попытки ограничить использование доктрины эквивалентов в объеме формулы, каждое числовое указание нужно, как минимум, истолковывать с учетом сообщенных значащих цифр и обычных способов округления. Несмотря на это, числовые диапазоны и значения, формулирующие широкий объем изобретения, являются аппроксимациями, числовые диапазоны и значения, указанные в специфических примерах, отображаются, как можно более точно. Однако, любой числовой диапазон или значение неотъемлемо содержит определенные ошибки, неизбежно возникающие вследствие погрешностей, найденных в соответствующих опытных измерениях. Перечисление здесь числовых диапазонов значений предназначено только для того, чтобы служить в качестве условного обозначения индивидуальной ссылки на каждое отдельное числовое значение, попадающее в указанный диапазон. Если здесь не указано иное, то каждое индивидуальное значение числового диапазона включено в данное описание, как если бы оно было перечислено здесь индивидуально.

Применение слов в единственном и множественном числе и аналогичных обозначений в контексте описания данного изобретения (особенно в контексте последующей формулы изобретения) следует истолковывать как охватывающее как единственное число, так и множественное число, если только здесь не указано иное или это явно не противоречит контексту. Все описанные здесь способы могут выполняться в любом подходящем порядке, если только здесь не указано иное или это явным образом не противоречит контексту изобретения. Использование любого и всех примеров или примерных формулировок (например, "такой как"), предложенных в данном описании, предназначено для более четкого разъяснения настоящего изобретения и не накладывает ограничений на объем изобретения, если только не заявлено иное. В настоящем описании отсутствует формулировка, которую следует истолковывать как такую, которая обозначает любой незаявленный элемент, как существенный для применения изобретения на практике.

Специфические варианты осуществления изобретения, раскрытые в данном описании, могут быть еще ограничены в формуле использованием фразы «состоящий из» или «состоящий главным образом из». При использовании в формуле переходного термина «состоящий из» исключаются любые элементы, этапы или ингредиенты, не определенные формулой изобретения. Переходной термин "состоящий главным образом из" ограничивает объем формулы специфическими материалами или этапами, которые не затрагивают основные и новые характеристики. Заявленные варианты осуществления изобретения заведомо или определенно описаны и раскрыты в данном описании.

Все патенты, патентные публикации и другие публикации, на которые ссылаются в данном описании и которые идентифицированы этим описанием, отдельно и явным образом полностью включены в данный документ посредством ссылок с целью описания и раскрытия, например, композиций и методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы применительно к настоящему изобретению. Эти публикации изложены только для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в этой связи не должно истолковываться как подтверждение того, что авторам изобретения не дано право датировать задним числом такое раскрытие преимуществами предшествующего изобретения или по иным основаниям. Все утверждения относительно даты или репрезентация относительно содержания этих документов основаны на информации, находящейся в распоряжении заявителей, и не позволяют любое допущение относительно корректности дат или содержания этих документов.

Перечень последовательностей

<110> Fotheringham, Ian

Sheffield, Peter J.

<120> Композиции и способы продуцирования энтерокиназы в дрожжах

<130> 18850 (BOT)

<150> US 61/416,622

<151> 2010-11-23

<160> 11

<170> Патентная версия 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> сайт расщепления энтерокиназы

<400> 1

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 2

<211> 708

<212> ДНК

<213> Bos taurus

<400> 2

attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc 60

gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc 120

cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat 180

atggcatcaa atctgacttc tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata 240

aacccacact acaataaacg gagaaaggac aatgacatcg ccatgatgca tcttgaaatg 300

aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt 360

tccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tgggggacac ttatatatca aggttctact 420

gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag 480

atgccagaat ataacattac ggaaaatatg gtgtgtgcag gctacgaagc aggaggggta 540

gattcttgtc agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600

ctggctggtg tgacatcatt tggatatcag tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat 660

gcccgggtcc caaggttcac agagtggata caaagttttc tacattag 708

<210> 3

<211> 235

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 3

Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser

20 25 30

Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met

35 40 45

Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn

50 55 60

Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile

65 70 75 80

Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met

85 90 95

His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys

100 105 110

Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile

115 120 125

Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln

145 150 155 160

Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu

165 170 175

Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met

180 185 190

Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly

195 200 205

Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro

210 215 220

Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His

225 230 235

<210> 4

<211> 710

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная молекула, кодирующая легкую цепь энтерокиназы

<400> 4

atagttggcg gctctgactc cagagaaggt gcctggccat gggtcgttgc cttatacttt 60

gatgatcaac aggtctgtgg tgcttcactt gtttctagag attggttggt gtccgcagca 120

cattgtgtgt atggtaggaa tatggagcct tcaaagtgga aagctgtatt ggggttgcat 180

atggcctcta accttacaag tccacaaatt gaaactagac taattgatca aattgttatc 240

aatcctcatt acaataagcg taggaaaaac aatgacatag caatgatgca cttggagatg 300

aaagttaact acacagacta catccaacca atatgtttgc ctgaggaaaa tcaggtgttc 360

ccacctggtc gtatttgtag tattgctgga tggggagccc tgatctacca aggatctacc 420

gctgacgtat tacaagaggc agatgttcct ctgctgtcca acgagaaatg ccagcaacaa 480

atgccagaat acaacatcac tgaaaacatg gtttgtgctg gttatgaagc tggaggtgta 540

gattcatgcc agggagattc aggcggtcct ctaatgtgcc aggagaataa ccgatggttg 600

cttgctggtg taacgagttt tggatatcaa tgcgctttac ctaaccgtcc aggggtctat 660

gcaagagtcc caagattcac cgagtggatt caatcttttc tgcactgagc 710

<210> 5

<211> 235

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> легкая цепь энтерокиназы 1

<400> 5

Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val

1 5 10 15

Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser

20 25 30

Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met

35 40 45

Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn

50 55 60

Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile

65 70 75 80

Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met

85 90 95

His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys

100 105 110

Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile

115 120 125

Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln

145 150 155 160

Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu

165 170 175

Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met

180 185 190

Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly

195 200 205

Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro

210 215 220

Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His

225 230 235

<210> 6

<211> 953

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> Полинуклеотидная молекула, кодирующая фактор альфа и

легкую цепь энтерокиназы

<400> 6

atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctatagttg gcggctctga ctccagagaa ggtgcctggc catgggtcgt tgccttatac 300

tttgatgatc aacaggtctg tggtgcttca cttgtttcta gagattggtt ggtgtccgca 360

gcacattgtg tgtatggtag gaatatggag ccttcaaagt ggaaagctgt attggggttg 420

catatggcct ctaaccttac aagtccacaa attgaaacta gactaattga tcaaattgtt 480

atcaatcctc attacaataa gcgtaggaaa aacaatgaca tagcaatgat gcacttggag 540

atgaaagtta actacacaga ctacatccaa ccaatatgtt tgcctgagga aaatcaggtg 600

ttcccacctg gtcgtatttg tagtattgct ggatggggag ccctgatcta ccaaggatct 660

accgctgacg tattacaaga ggcagatgtt cctctgctgt ccaacgagaa atgccagcaa 720

caaatgccag aatacaacat cactgaaaac atggtttgtg ctggttatga agctggaggt 780

gtagattcat gccagggaga ttcaggcggt cctctaatgt gccaggagaa taaccgatgg 840

ttgcttgctg gtgtaacgag ttttggatat caatgcgctt tacctaaccg tccaggggtc 900

tatgcaagag tcccaagatt caccgagtgg attcaatctt ttctgcactg agc 953

<210> 7

<211> 316

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальная последовательность энтерокиназы с фактором альфа

<400> 7

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val

85 90 95

Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val

100 105 110

Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn

115 120 125

Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser

130 135 140

Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val

145 150 155 160

Ile Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met

165 170 175

Met His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile

180 185 190

Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser

195 200 205

Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val

210 215 220

Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln

225 230 235 240

Gln Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr

245 250 255

Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

260 265 270

Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe

275 280 285

Gly Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val

290 295 300

Pro Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His

305 310 315

<210> 8

<211> 25

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный праймер для ПЦР

<400> 8

agatctaaca tccaaagacg aaagg 25

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный праймер для ПЦР

<400> 9

gcagagcgag gtatgtaggc 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный праймер для ПЦР

<400> 10

cagatgttcc tctgctgtcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> олигонуклеотидный праймер для ПЦР

<400> 11

atccactcgg tgaatcttgg 20.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полинуклеотидную молекулу с SEQ ID №4 или 6, кодирующую легкую цепь энтерокиназы. Изобретение относится также к дрожжевому экспрессионному конструкту, содержащему указанную последовательность, а также к дрожжевой клетке, трансформированной конструктом. Изобретение касается также способа продуцирования энтерокиназы с использованием такой клетки. Изобретение позволяет эффективно получать энтерокиназу. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 6 пр.

1. Изолированная полинуклеотидная молекула, кодирующая легкую цепь энтерокиназы, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

2. Дрожжевой экспрессионный конструкт, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ ID №4, функционально связанную с регулирующей экспрессию последовательностью нуклеиновой кислоты.

3. Дрожжевой экспрессионный конструкт по п. 2, отличающийся тем, что дрожжевой экспрессионный конструкт дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий фактор альфа, функционально связанный с указанным полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID №4.

4. Дрожжевой экспрессионный конструкт по п. 3, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность указанного полинуклеотида, кодирующего фактор альфа, функционально связанного с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID №4, является SEQ ID №6.

5. Дрожжевая клетка для продукции легкой цепи энтерокиназы, которая трансформирована дрожжевым экспрессионным конструктом, включающим полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

6. Дрожжевая клетка по п. 5, отличающаяся тем, что дрожжевой экспрессионный конструкт является внехромосомным в дрожжевой клетке.

7. Дрожжевая клетка по п. 5, отличающаяся тем, что дрожжевой экспрессионный конструкт является стабильно интегрированным в хромосому дрожжевой клетки.

8. Дрожжевая клетка по п. 5, отличающаяся тем, что дрожжевая клетка представляет собой клетку Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae или Yarrowia lipolytica.

9. Дрожжевая клетка по п. 5, отличающаяся тем, что дрожжевая клетка является клеткой Pichia pastoris.

10. Способ продуцирования энтерокиназы, включающий этап культивирования дрожжевой клетки, трансформированной дрожжевым экспрессионным конструктом, содержащим полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID №4 или SEQ ID №6, чтобы таким образом продуцировать энтерокиназу, кодируемую нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 или SEQ ID №6.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что дрожжевая клетка представляет собой клетку Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae или Yarrowia lipolytica.

12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что дрожжевая клетка является клеткой Pichia pastoris.

13. Способ по п. 10, отличающийся тем, что способ дополнительно включает очистку энтерокиназы, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID №4 или SEQ ID №6.