ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/17/Техас/2012/30 (H3N2) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ И ДЛЯ ДЕТЕЙ Российский патент 2015 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 A61P31/16 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма вируса гриппа A, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus A A/17/Техас/2012/30 (H3N2).

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа, A/Техас/50/2012 (H3N2), известный вакцинный штамм A/17/Перт/09/87 (H3N2) - прототип [Дешева Ю.А., Руденко Л.Г., Александрова Г.И., Патент РФ на изобретение №2464311, опубликован 20.10.2012 бюлл. №29] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной A/Техас/50/2012 - подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического вируса A/Техас/50/2012 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Александрова Г.И. Применение метода генетической рекомбинации для получения вакцинных штаммов вируса гриппа // Вопр. Вирусол - 1977 - №4. - С.387-395 /134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (ca) температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа, разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л., 1968. - С.66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма.

Вакцинный штамм A/17/Техас/2012/30 (H3N2) получен методом генетической реассортации пандемического вируса A/Техас/50/2012 (H3N2) с донором аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°C температуре инкубации в присутствии антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированиями методом предельных разведений под прессом антисыворотки к донору при пониженной (26°C) и оптимальной (32°C) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts-, ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (HA) - в РТГА идентичен вирусу A/Техас/50/2012 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.

Второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма нейраминидаза (NA) - проверен методом микс-ПЦР и идентичен вирусу A/Техас/50/2012 (H3N2).

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали микс-ПЦР анализ ДНК копий генов [Киселева И.В. с соавт. Анализ состава генома штаммов сезонной и пандемической живой гриппозной вакцины. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011, №4. С.29-36], основанный на различиях в размерах соответствующих амплифицируемых фрагментов генов донора аттенуации или «дикого» вируса.

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) принадлежат пандемическому родительскому вирусу A/Техас/50/2012 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (PB2, PB1, PA, NP, M, NS), принадлежат донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) представлены в табл.1.

Таблица 1. Состав генома реассортантного вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2), полученного на основе эпидемического вируса A/Техас/50/2012 (H3N2), и донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Ген Принадлежность гена одному из родительских вирусов Донор аттенуации Эпидемический вирус Вакцинный штамм РВ2 Лен17¹ Wt (H3N2)² Лен17 РВ1 Лен17 Wt (H3N2) Лен17 РА Лен17 Wt (H3N2) Лен17 НА Лен17 Wt (H3N2) Wt (H3N2) NP Лен17 Wt (H3N2) Лен17 NA Лен17 Wt (H3N2) Wt (H3N2) М Лен17 Wt (H3N2) Лен17 NS Лен17 Wt (H3N2) Лен17 ¹Лен17: ген принадлежит донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2). ²Wt (H3N2): ген принадлежит эпидемическому вирусу A/Техас/50/2012 (H3N2).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм A/17/Техас/2012/30 (H3N2), в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°C составила 3.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (ca фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°C температуре инкубации составила 7.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Все результаты фенотипического анализа представлены в таблице 2.

Таблица 2. Фенотипические свойства вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) при пассировании в развивающихся куриных эмбрионах Вирус Титр, log₁₀ ЭИД₅₀/мл Фенотип 32°C 26°C 40°C А/Техас/50/2012 (H3N2) 8.0 2.2 2.4 ts, non-ca А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) 8.2 6.5 2.0 ts, са А/17/Техас/2012/30 (H3N2) 10.1 7.2 3.2 ts, са

Генетическая стабильность кодирующих мутаций. Генетическую стабильность вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций во внутренних генах до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма в куриных эмбрионах. Методом частичного секвенирования ДНК копий генов, основанным на амплификации коротких участков РНК, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2), продемонстрирована идентичность мутаций во всех внутренних генах донора аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) до и после его пятикратного пассирования, в том числе, в генах полимеразного комплекса (PB2, PB1, PA), ответственных за аттенуирующий фенотип (табл.3).

Таблица 3. Кодирующие мутации в геноме вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) по сравнению с донором аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и его диким предшественником, вирусом A/Ленинград/134/57 (H2N2) Ген Аминокислота Мутации Лен/wt¹ Лен/17² A/17/Texac/2012/30 (H3N2) до пассирования 5 пассаж РВ2 478 Val Leu Leu Leu РВ1 265 Lys Asn Asn Asn 591 Val Ile Ile Ile РА 28 Leu Pro Pro Pro 341 Val Leu Leu Leu NP NP ген донора аттенуации не содержит мутаций M1 15 Ile Val Val Val 144 Phe Leu Leu Leu NS2 100 Met Ile Ile Ile ¹Лен17: ген принадлежит донору аттенуации A/Ленинград/134/17/57 (H2N2). ²Wt (H3N2): ген принадлежит эпидемическому вирусу A/Техас/50/2012 (H3N2).

Безвредность для морских свинок

Доклинические исследования острой и подострой токсичности вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) проводили на морских свинках в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М., 2010. 39 с.] и с «Правилами лабораторной практики» [Правила лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №708н от 23.08.20010. http://www.rg.ru/2010/10/22/laboratornaya-praktika-dok.html].

Изучение острой токсичности вакцинного штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) проводили в экспериментах на морских свинках обоего пола. Морским свинкам вводили однократно 5 мл вакцинного вируса подкожно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/0.2 мл. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его подкожном введении.

Изучение подострой токсичности изучали на морских свинках обоего пола. Морским свинкам вводили вирус интраназально по 100 мкл вируса в носовой ход, двукратно с 24-часовым интервалом. Животным контрольной группы интраназально вводили физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (14 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Показана безвредность вакцинного штамма для лабораторных животных при его интраназальном введении (табл.4).

Таблица 4. Результаты изучения безвредности вакцинного штамма в экспериментах на морских свинках Животные Пол Препарат Путь введения Выжило к последнему дню наблюдения Морские свинки (острая токсичность) Самцы ВШ п/к 10/10 Самки ВШ п/к 10/10 Самцы Плацебо п/к 10/10 Самки Плацебо п/к 10/10 Морские свинки (подострая токсичность) Самцы ВШ и/н 10/10 Самки ВШ и/н 10/10 Самцы Плацебо и/н 10/10 Самки Плацебо и/н 10/10 Обозначения: ВШ - вакцинный штамм A/17/Техас/2012/30 (H3N2) п/к - подкожное введение; и/н - интраназальное введение.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины A/17/Техас/2012/30 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса A/Техас/50/2012 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Образец паспорта на вакцинный штамм A/17/Техас/2012/30 (H3N2) прилагается.

Таким образом, вакцинный штамм A/17/Техас/2012/30 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: P N003224/01-270313) на Ультравак^®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм A/17/Техас/2012/30 (H3N2) депонирован 04.07.2013 в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России (ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России, Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2737 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма A/17/Техас/2012/30 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°C в течение 48 часов - 10.1 log₁₀ ЭИД₅₀/мл

Гемагглютинирующая активность - 1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа A/17/Техас/2012/30 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа A/17/Техас/2012/30 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

ПАСПОРТ ШТАММА (ОБРАЗЕЦ) 1 Название штамма: А/17/Техас/2012/30 2 ИЭМ идентификационный №: 3053/7461 3 Серия: №1 4 Тип/подтип: H3N2 5 Метод подготовки: Классическая реассортация в куриных эмбрионах 6 Родительские вирусы   6.1 Эпидемический вирус: А/Техас/50/2012 (H3N2); CDC ID# 2012704893 6.2 Донор аттенуации: А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) 7 Число пассажей в процессе реассортации: E6/E1 (скрещивание, два селективных пассажа и три клонирования предельными разведениями + накопление) 8 Состав генома: Гены PB2, PB1, PA, NP, M и NS - от донора аттенуации; гены HA и NA - от эпидемического вируса (формула генома 6:2) 9 Характеристика штамма до лиофилизации 9.1 Оптимальные условия репродукции: 32°C, 48 часов 9.2 Гемагглютинирующая активность: 1:1024 с 1.0% куриными эритроцитами 9.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°C: 10.1 log₁₀ ЭИД₅₀/мл 9.4 ts маркер (температурочувствительность репродукции): 3.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл при 40°C (титр при t 40°C, ts фенотип) 9.5 ca маркер (холодоустойчивость репродукции): 7.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл при 26°C (титр при 26°C, ca фенотип) 10 Характеристика штамма после лиофилизации 10.1 Дата лиофилизации: 15.05.2013 10.2 Объем материала в ампуле: 0.5 мл 10.3 Инфекционная активность при оптимальной температуре 32°C: 8.9 log₁₀ ЭИД₅₀/мл 10.4 Гемагглютинирующая активность: 1:256 с 1.0% куриными эритроцитами 11 Антигенная специфичность 11.1 Гемагглютинин: идентичен вирусу A/Техас/50/2012 (H3N2) по данным секвенирования и РТГА 11.2 Нейраминидаза: идентична вирусу A/Техас/50/2012 (H3N2) по данным секвенирования 12 Токсикологические исследования in vivo: Не токсичен после подкожного и интраназального заражения морских свинок 13 Контроль стерильности: Стерилен (30.05.2013)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму вируса гриппа А/17/Техас/2012/30 (H3N2). Данный штамм вируса гриппа депонирован в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под № 2737. Предложенное изобретение позволяет получить новый штамм вируса гриппа А/17/Техас/2012/30 (H3N2), который используют для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 4 табл.

Штамм вируса гриппа А/17/Техас/2012/30 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под № 2737, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.