Способ определения антистафилококковой активности препарата Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/04 

Ё

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии. Цель изобретения - ускорение способа. Определяют чувствительность методом серийных разведений, например к фурациллину и витамину А. Засевают три пробирки исследуемым штаммом, добавив в первые две пробирки соответственно фурациллин и витамин А, третья пробирка - контроль. Инкубируют 24 ч при 37°С и стандартизируют взвеси стафилококков, для чего добавляют раствор лизоцима концентрацией 20 мкг/мл. Определяют количество сорбированного лизоцима как разницу между рабочей концентрацией лизоцима и остаточным лизоцимом. Использование изобретения позволит ускорить срок отбора препарата. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии.

Целью изобретения является ускорение способа.

Срособ осуществляется следующим образом.

В опытные пробирки добавляют исследуемые препараты в концентрации 1/10 от МБК, заливают 1,5% мясопептонным агаром. Контрольные пробирки готовят без добавления препарата. Засевают исследуемые штаммы, инкубируют 18-24 ч. Затем из выросших штаммов готовят опытные и контрольные микробные взвеси (все разведения выполняются на фосфатном буфере рН 6,2). Взвеси стандартизуют фотонефеломет- рическим методом по оптической плотности, которая при синем светофильтре и кювете шириной 5 мм равна 0,3. Параллельно готовят разведения лизоцима концентрацией 20-10-8-6-4-2 мкг/мл. Затем к 1 мл

стандартизованным опытным и контрольным взвесями стафилококков приливают 1 мл раствора лизоцима 20 мкг/мл и инкубируют 10 мин при 37°С. Затем центрифугируют 25 мин при 3000 об/мин, надосадки отсасывают в количестве 0,6 мл и определяют остаточный лизоцим нефелометри- ческим методом. Для определения остаточного лизоцима готовят взвесь микрококка оптической плотностью ,2. Разливают в три ряда пробирок по 2 мл и добавляют 0,6 мл надосадка из опытных и контрольных пробирок и калибровочного раствора лизоцима 10-8-6-4-2 мкг/мл, инкубируют 10 мин при 37°С, затем замеряют оптическую плотность взвеси микрококка при синем светофильтре в кювете шириной 5 мм. По калибровочной кривой находят количество остаточного лизоцима в надосадочной жидкости. Величинусорбированного лизоцима определяют как разницу между рабочей

СП

VJ

о а ю

.

концентрацией лизоцима (10 мкг/мл) и остаточным лизоцимом. Отбор препарата проводят по степени увеличения сорбции лизоцима стафилококками из среды с суб- бактериостатической концентрацией препарата по сравнению с контролем.

Пример.У бактерионосителя Н., 24 года, из клеток слущенного эпителия слизистой носа выделен золотистый стафилококк. Методом серийных разведений определяют его чувствительность к препаратам фу- рацилину и витамину А-МБК. Готовят три пробирки с агаровой средой. В первую и вторую добавляют соответственно 1/10 МБК фурацилина и витамина А - опытная партия, а в третью - контрольную пробирку препарат не добавляют.

Все пробирки засевают исследуемым штаммом и после 24 ч инкубации при 37°С готовят и стандартизируют взвеси стафилококков из опытных и контрольных пробирок по описанной методике. Для этого к 1 мл взвеси в каждой пробирке добавляют 1 мл раствора лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл, инкубируют 10 мин при 37°С, получают надосадки в количестве 0,6 мл и определяют в них количество остаточного (несорбированного стафилококками) лизоцима. Для этого приготовленную взвесь тест-культуры микрококка оптической плотностью ,2 разливают по 2 мл в три ряда пробирок и добавляют по 0,6 мл полученных надосадков из опыта и контроля, 0,6 мл калибровочного раствора лизоцима 10-8-6-4-2 мкг/мл, инкубируют 10-мин при . В контроле определяют оптическую плотность 0,32, по калибровочной кривой определяют, что это соответствует концентрации лизоцима 7 мкг/мл. Рабочая концентрация лизоцима 10 мкг/мл, следовательно, количество сорбированного лизоцима по поверхности стафилококков в контроле 10- мкг/мл.

В опыте с витамином А оптическая плотность микрококка после инкубации с над- осадком 0,46 по калибровочной кривой. Это соответствует концентрации лизоцима в надосадке 4 мкг/мл. Количество сорбированного лизоцима на стафилококках мкг/мл. В опыте фурацилином оптическая плотность микрококка после инкубации с надосадком 0,37, что соответствует концентрации лизоцима 6,5 мкг/мл, Количество сорбированного лизоцима на стафилококках в опыте с фурацилином 10-6,5 мкг/мл 3,5 мкг/мл.

Увеличение сорбции лизоцима стафилококками в опыте с витамином А 100% (с 3 мкг/мл до 6 мкг/мл), а в случае с фурацилином 17% (сЗ мкг/мл до 3,5 мкг/мл), что

позволяет оценить витамин А как более эффективный препарат для санации стафилококковых бактерионосителей.

Пример 2. У бактерионосителя Д. 22

лет из клеток слущенного эпителия носа выделен золотистый стафилококк, проверка действия хлорофиллипта и риванола предлагаемым способом показала, что концентрация сорбированного на стафилококках

лизоцима предлагаемым способом в контроле 4 мкг/мл, в опыте с хлорофиллиптом 7 мкг/мл, в опыте с риванолом 5 мкг/мл. Увеличение сорбции лизоцима в опыте с хлорофиллиптом 75%, а в опыте с риванолом 25%

(по сравнению с контролем). Это позволяет оценить хлорофиллипт как более эффективный препарат для санации стафилококковых бактерионосителей.

Проведена санация 200 стафилококковых бактерионосителей с использованием фурацилина и витамина А. Все бактерионосители разделены на 2 группы по 100 человек в каждой. Санация препаратами проводилась один раз в день в течение 6 сут

путем смазывания слизистой носа масляным раствором 3,44% витамина А, в концентрации 6 тыс. м.е. и фурацилином в разведении 1:5000.

Оценка влияния препаратов на антилизоцимную активность (чашечный метод) и на сорбцию лизоцима (ФЭК-метод) стафилококками приведена в таблице.

Из таблицы видно, что наименее выраженным действием обладают фурацилин и

риванол: антилизоцимная активность снижается на 5 и 4% по прототипу, а сорбци- онная активность соответственно в незначительной степени повышается на 20 и на 10%.

Наиболее выраженным действием обладают облепиховое масло и витамин А, Антилизоцимная активность снижается на 22 и 27%, повышается сорбционная активность на 110 и 101%.

Использование изобретения позволит в течение 6-7 ч отобрать наиболее эффектив- ный препарат для санации стафилококковых бактерионосителей.

0 Формула изобретения

Способ определения антистафилококковой активности препарата путем инкубирования стафилококка в питательной среде в присутствии исследуемого препарата с по5 следующей оценкой активности препарата по изменению содержания лизоцима, о т- личающийся тем, что, с целью ускорения способа, после .инкубирования микроорганизм отделяют от питательной среды, суспендируют, затем к суспензии добавляют

лизоцим и нефелометрическим методом по количеству лизоцима, осевшего на микробную клетку, оценивают активность препарата.