СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕИНА НАТРИЯ В СУБСТАНЦИИ И ЛЕКАРСТВЕННОМ ПРЕПАРАТЕ НА ЕЕ ОСНОВЕ Российский патент 2015 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности, к способу количественного определения флуоресцеина натрия, который может быть использован в исследовательской и производственной практике.

В последнее время флуоресцеин натрия находит применение в качестве субстанции в производстве лекарственных препаратов, предназначенных для диагностики в офтальмологии и нейрохирургии.

На основе флуоресцеина натрия созданы импортные препараты «Флуоресцеин Новартис» (Швейцария) и «Флуоресцеин» (США), которые закупаются и используются для диагностики в ведущих медицинских учреждениях Москвы и других городов России. Они представляют собой лекарственную форму в виде 10%-ного раствора в стерильной воде для внутривенного введения.

Для количественного анализа флуоресцеина натрия в субстанции применяют фотометрический анализ, заключающийся в измерении оптической плотности анализируемого раствора в фосфатном буфере с рН 8,0 на длине волны 491 нм и последующем использовании ее в расчетной формуле, не применяя при этом градуировочного графика изменения оптической плотности раствора в зависимости от концентрации флуоресцеина натрия [European Pharmacopeia, 2007, Edition 6. V.2. p. 1919]. Однако, несмотря на простоту этой методики, получаемые результаты нередко неоднозначны и вызывают сомнение, а также зависят от типа спектрофотометра.

Известен способ количественного определения флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате «Флуоресцеин Новартис» методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием в качестве элюента системы ацетонитрил: фосфатный буфер с pH 2,0 в соотношении 3:7, а в качестве стандарта - диацетилфлуоресцеина, гидролизующегося количественно в динатриевую соль флуоресцеина в спиртовой щелочной среде при нагревании [British Pharmacopoeia, 2009, v 3]. Однако метод ВЭЖХ является трудоемким и дорогим, так как требуется сложное приборное оборудование, специальное обслуживание и закупка расходных материалов. Кроме того, в анализе используется в большом количестве токсичный растворитель - ацетонитрил (на одну пробу анализируемого продукта расходуется 300-350 мл растворителя).

Флуоресцеин натрия является карбонилсодержащим соединением и кетогруппа в нем может электрохимически восстанавливаться аналогично ароматическим карбонильным соединениям. Поэтому электрохимические методы анализа, как альтернативные, могут быть использованы для количественного определения флуоресцеина натрия.

Полярографическое восстановление карбонильной группы в кетонах исследовано достаточно подробно, причем ароматические кетоны восстанавливаются на ртутном капающем электроде легче по сравнению с алифатическими [Майрановский С.Г., Страдынь Я.П., Безуглый В.Д. Полярография в органической химии. - Л.: Химия, 1975. 351 с.; Гейровский Я., Кута Я. Основы полярографии. - М.: Мир, 1965. - 559 с.]. Имеются данные в научной литературе о полярографическом поведении флуоресцеина и его производных как в водных буферных растворах [Bannerjee N.R, Vig S.K. Ind. J. Chem., 1971, v. 9, №5, p. 444-448; Bannerjee N.R, Vig S.K. Ind. J. Chem., 1972, v. 10, №8, p. 842-844; Ельцов A.B., Смирнова Н.П., Бобровников M.H. и др. Журнал общей химии, 1988, т. 58, №3, с. 635-641], так и неводных средах [Mchedlov-Petrossyan N.O., Kukhtik V.I., Bezugliy V.D. J. Phys. Org. Chem. 2003.V 16. P. 380-397]. При этом показано, что количество наблюдаемых волн, их потенциалы и обратимость зависят от ионной формы красителя, образующейся при данном pH, а также состава фонового раствора. В щелочной среде при pH>10 на полярограммах наблюдаются две одноэлектронные волны восстановления флуоресцеина. Первая одноэлектронная волна отвечает процессу образования анион-радикала, является обратимой и не зависит от pH раствора. Вторая одноэлектронная волна является необратимой и соответствует дальнейшему восстановлению анион-радикала до полианиона, который, протонируясь, превращается в соответствующий спирт. Известные полярографические свойства флуоресцеина и его производных представляют исключительно научный интерес и не предлагаются для аналитических целей. К тому же, в литературе отсутствуют данные по восстановлению флуоресцеина и его производных на твердом электроде.

Наиболее близкий к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ полярографического восстановления флуоресцеина в сернокислой неводной среде, в котором на полярограмме наблюдается одна двухэлектронная необратимая волна [Мчедлов-Петросян Н.О. Вестник Харьковского национального университете. 2004. №626, вып. 11 (34). С. 74-77]. В качестве растворителей используют ДМФА и водно-этанольную смесь с массовой долей спирта 91%. Недостатком этого способа является использование токсичных растворителя и ртути.

Задачей предлагаемого изобретения является создание простого и доступного способа количественного определения флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе, легко реализуемого в производственных условиях.

Для решения этой задачи предложен способ вольтамперометрического количественного определения флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе с использованием серийных приборов на стационарном стеклоуглеродном электроде в 0,1 н. растворе серной кислоты, а регистрацию вольтамперограмм осуществляют в классическом режиме, для расчета содержания флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе используют нижеприведенные формулы:

в субстанции:

в лекарственном препарате:

где С_я - концентрация стандартного раствора флуоресцеина натрия в ячейке, г/л;

I_d - высота волны (пика) анализируемого раствора, мм;

V - объем анализируемого раствора, л;

V_ф - объем фонового раствора, мл;

V_пp - объем пробы анализируемого раствора, мл;

m - точная навеска анализируемого раствора, г;

W - содержание влаги в субстанции, %;

1252,3 - тангенс угла наклона градуировочной прямой.

Предлагаемый способ осуществляют в обычной стеклянной термостатируемой трехэлектродной электрохимической ячейке с использованием серийных недорогих приборов: электронного полярографа ПУ-1 и двухкоординатного самописца. В качестве рабочего электрода используют стационарный стеклоуглеродный электрод, а электродом сравнения и вспомогательным служат насыщенные каломельные полуэлементы.

Для определения содержания флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе используется высота волны восстановления флуоресцеина натрия, которая наблюдается на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты с Е_1/2-0,85 В (нас.к.э.) со спадом тока. При этом высота (предельный ток) регистрируемой волны прямо пропорциональна концентрации флуоресцеина натрия до 0,11 г/л (фиг. 1, а). Фиг. 1, а: зависимость высоты волны от концентрации флуоресцеина натрия, г/л: 1 - 6,97·10^-2; 2 - 13·10^-2; 3 - 18,4·10^-2, снятая в классическом режиме на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты (4).

Для выбора условий вольтамперометрического количественного определения флуоресцеина натрия в субстанции и лекформе исследовано его электрохимическое поведение на твердом стационарном электроде из стеклоуглерода. При этом оказалось неожиданным, что флуоресцеин натрия восстанавливается на твердом электроде из стеклоуглерода как в кислой, так и щелочной среде в одну стадию и при сравнительно невысоких отрицательных значениях потенциала: -0,78 В (нас.к.э.) на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты и -1,34 В (нас.к.э.) на фоне 0,1 н. раствора гидроксида натрия. Кроме того, в кислой среде при вольтамперометрических измерениях не наблюдается кристаллизация флуоресцеиновой кислоты.

Регистрируемая на вольтамперограмме волна восстановления флуоресцеина натрия на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты необратима и имеет диффузионную природу тока, что подтверждает линейная зависимость высоты волны от концентрации деполяризатора (фиг. 2). Фиг 2: Зависимость высоты волны восстановления флуоресцеина натрия (стандарта) от ее концентрации на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты.

Однако волна восстановления флуоресцеина натрия становится обратимой в водно-спиртовой кислой среде на фоне 0,01-0,1н. растворов серной или соляной кислоты (фиг. 1, b). Фиг. 1, b: циклическая дифференциальная вольтамперограмма восстановления флуоресцеина натрия на фоне 0,01 н. HCl в метаноле, концентрация флуоресцеина натрия 2,43·10^-2 г/л, скорость развертки потенциала 20 мВ/с. При этом ее высота уменьшается в два раза. По-видимому, в кислой водной среде флуоресцеин натрия подвергается восстановлению в протонированном состоянии, давая на вольтамперной кривой необратимую двухэлектронную волну, а в водно-спиртовой среде протонизация деполяризатора затруднена, что приводит к обратимому присоединению лишь одного электрона с образованием анион-радикала. Волна дальнейшего восстановления последнего, вероятно, скрыта разрядом фона.

Спад тока на вольтамперной кривой, наблюдаемый при потенциалах отрицательнее - 0,85 В (нас.к.э.), вероятно, обусловлен адсорбцией продуктов реакции восстановления на поверхности твердого электрода.

В щелочных растворах на фоне фосфатного буфера с pH 8,0 и 0,1 н. раствора гидроксида натрия существенно уменьшается высота волны восстановления флуоресцеина натрия, очевидно, вследствие затруднения протонизации восстанавливаемой частицы и ее анионной природы (дианион), что снижает чувствительность метода. Так, высота волны восстановления флуоресцеина натрия с концентрацией 0,06 г/л на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты составляет 41,0 мм, на фоне фосфатного буфера с pH 8,0 - 18 мм, а на фоне 0,1 н. раствора гидроксида натрия - 14 мм.

Из полученных результатов следует, что вольтамперометрическое количественное определение флуоресцеина натрия предпочтительно проводить в кислой среде на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты. В более кислых растворах возможно частичное осаждение продукта в виде кислоты.

На фиг. 1, а представлены на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты классические вольтамперограммы восстановления флуоресцеина натрия. Концентрацию флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе рассчитывают по градуировочному графику (фиг. 2), построенному для стандарта. В качестве стандартного раствора используют раствор динатриевой соли флуоресцеина, полученный гидролизом диацетилфлуоресцеина в спиртовой щелочной среде при нагревании [British Pharmacopeia, 2009, v. 3].

Градуировочный график в координатах I_d(мм)-С (г/л), представляющий прямую линию, проходящую практически через начало координат, строят с использованием программы Microsoft Excel и находят для него уравнение: I_d=1252,3С_я+2,433 (1), из которого по высоте волны, измеренной экспериментально, рассчитывают концентрацию флуоресцеина натрия в анализируемом растворе, содержащемся в электрохимической ячейке: С_я=(I_d-2.433)/1252,3.

Дальнейший расчет содержания флуоресцеина натрия (X) осуществляют по следующим формулам:

в субстанции:

в лекарственном препарате:

где С_я - концентрация стандартного раствора флуоресцеина натрия в ячейке, г/л;

I_d - высота волны (пика) анализируемого раствора, мм;

V - объем анализируемого раствора, л;

V_ф - объем фонового раствора, мл;

V_пр - объем пробы анализируемого раствора, мл;

m - точная навеска анализируемого раствора, г;

W - содержание влаги в субстанции, %;

1252,3 - тангенс угла наклона градуировочной прямой (уравнение 1).

Относительная ошибка определения составляет 2,0-3,0%, а время, затрачиваемое на анализ, 25-30 мин.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1 (Построение градуировочного графика стандарта)

0,0550 г (точная навеска) стандарта диацетилфлуоресцеина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в смеси 5 мл этилового спирта и 1 мл 2,5 М раствора гидроксида натрия и нагревают на водяной бане в течение 20 минут при перемешивании. Полученную реакционную массу охлаждают, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

В электрохимическую ячейку заливают 5 мл 0,1 н. раствора серной кислоты (фоновый раствор), продувают азотом 3 минуты и записывают классическую вольтамперограмму фонового раствора при скорости развертки потенциала 20 мВ/с от -0,4 до -1,25 В в катодном направлении с использованием электронного полярографа ПУ-1М и двухкоординатного самописца. К этому фоновому раствору прибавляют 0,1 мл стандартного раствора, полученный раствор продувают азотом в течение 3 минут и записывают классическую вольтамперограмму стандарта в области потенциалов от -0,4 до -1,25 В. В катодной области наблюдается диффузионная волна с E_1/2-0,78 В, отвечающая процессу восстановления флуоресцеина натрия, высоту которой измеряют. Затем в этот же раствор добавляют еще 0,1 мл стандартного раствора, продувают азотом 3 минуты и записывают вольтамперограмму и т.д.

По полученным экспериментальным данным строят градуировочный график стандарта в координатах I_d(мм)-С (г/л) с использованием программы Microsoft Excel и находят для него уравнение: I_d=1252,3С_я+2,433 (1), которое используется для расчета содержания флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе. Линейная зависимость предельного тока волны восстановления флуоресцеина натрия от ее концентрации наблюдается до 0,11 г/л в электрохимической ячейке.

Пример 2

0,0300 г (точная навеска) субстанции флуоресцеина натрия вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем колбы дистиллированной водой до метки, а затем тщательно перемешивают. Содержание влаги в анализируемой субстанции флуоресцеина натрия составляет 13,5%.

В электрохимическую ячейку заливают 5 мл 0,1 н. раствора серной кислоты (фоновый раствор), продувают азотом 3 минуты и записывают классическую вольтамперограмму фонового раствора при скорости развертки потенциала 20 мВ/с от -0,4 до -1,25 В в катодном направлении с использованием электронного полярографа ПУ-1М и двухкоординатного самописца. К этому фоновому раствору прибавляют 0,35 мл анализируемого раствора, полученный раствор продувают азотом в течение 3 минут и записывают классическую вольтамперограмму полученного раствора в области потенциалов от -0,4 до -1,25 В. Измеряют высоту волны анализируемой пробы, а количественное определение флуоресцеина натрия в субстанции проводят по формуле, приведенной на стр.4. Найдено экспериментально: высота волны анализируемой субстанции - 44 мм. В анализируемой субстанции содержание флуоресцеина натрия составляет 97,8%, что соответствует нормативной технической документации [British Pharmacopeia, 2009, v. 3] (от 95 до 103%).

Пример 3

0,0360 г (точная навеска) флуоресцеина натрия фирмы Fluka вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем колбы дистиллированной водой до метки, а затем тщательно перемешивают. Содержание влаги в анализируемой субстанции составляет 9,7%.

Запись вольтамперограмм и определение высоты пика анализируемой пробы проводят аналогично примеру 2, а количественное определение флуоресцеина натрия в анализируемом продукте проводят по формуле, приведенной выше. Для анализируемой субстанции высота пика составляет 48,25 мм, а содержание флуоресцеина натрия в субстанции - 99.4%, что соответствует нормативной технической документации [British Pharmacopeia, 2009, v. 3] (от 95 до 103%).

Пример 4

0,2821 г (точная навеска) лекарственного препарата «Флуоресцеин Новартис» вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем колбы дистиллированной водой до метки, а затем тщательно перемешивают.

К фоновому раствору объемом 5 мл прибавляют 0,5 мл анализируемого раствора. Запись вольтамперограммы и определение высоты волны анализируемой пробы проводят аналогично примеру 2, а количественное определение флуоресцеина натрия в препарате проводят по формуле, приведенной на выше. Для анализируемого препарата высота волны составляет 40,25 мм, а содержание флуоресцеина натрия в препарате - 10,5%, что соответствует нормативной технической документации (от 9,0 до 10.5%).

Пример 5

0,2851 г (точная навеска) экспериментального образца лекарственного препарата «Флуоресцеин натрия» на основе флуоресцеина натрия вносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем колбы дистиллированной водой до метки, а затем тщательно перемешивают.

К фоновому раствору объемом 5 мл прибавляют 0,3 мл анализируемого раствора. Запись вольтамперограммы и определение высоты волны анализируемой пробы проводят аналогично примеру 2, а количественное определение флуоресцеина натрия в экспериментальном образце препарата проводят по формуле, приведенной выше. Для анализируемого экспериментального препарата высота волны составляет 47,5 мм, а содержание флуоресцеина натрия в нем - 9,37%, что соответствует нормативной технической документации (от 9,0 до 10,5%).

Таким образом, создан вольтамперометрический способ количественного анализа флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе на твердом электроде из стеклоуглерода, который может быть легко реализован в производственных условиях.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в исследовательской и производственной практике. Согласно изобретению предлагается определять флуоресцеин натрия вольтамперометрически на стационарном электроде из стеклоуглерода по волне восстановления указанного соединения в кислой среде на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты в классическом режиме. Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность упрощения способа количественного определения флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе по сравнению с известными методами и реализации его в производственных условиях. 2 ил.

Способ количественного определения флуоресцеина натрия в субстанции и лекарственном препарате на ее основе электрохимическим восстановлением в кислой среде, отличающийся тем, что восстановление осуществляют на стационарном электроде из стеклоуглерода на фоне 0,1 н. раствора серной кислоты в классическом режиме, а расчет содержания флуоресцеина натрия (X) осуществляют по следующим формулам:
в субстанции:

в лекарственном препарате:

где C_я - концентрация стандартного раствора флуоресцеина натрия в ячейке, г/л;
V - объем анализируемого раствора, л;
V_ф - объем фонового раствора, мл;
V_пр - объем пробы анализируемого раствора, мл;
m - точная навеска субстанции и анализируемого раствора, г;
W - содержание влаги в субстанции, %.