ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2015 года по МПК A61K31/17 A61K47/30 A61K47/02 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным средствам, обладающим противоопухолевым действием, и может найти применение при лечении злокачественных опухолей.

Известны лекарственные средства для лечения злокачественных опухолей из ряда нитрозоалкилмочевины (НАМ), которые широко применяются в современной онкологии [Полозкова С.А., Орел Н.Ф., Маркович А.А., Кузьминов А.Е., Горбунова В.А. / Злокачественные опухоли. №1 - 2013 (5) С. 47-55].

Так, при лечении опухолей центральной нервной системы (ЦНС) широко применяются препараты, относящиеся к алкилирующим агентам, - это НАМ, а также ее производные: ломустин, кармустин, нидран, мюстафоран [Дементьева Н.П., Корман Д.Б. / Вопросы онкологии. 2001. Т. 47. №6. С. 3-11], [Горбунова В.А., Орел Н.Ф. / Эффективная фармакотерапия. 2010. №2. С. 30-33].

Направленность действия препаратов данной группы объясняется не только способностью присоединяться ко многим веществам путем реакции алкилирования, но прежде всего способностью НАМ и ее производных проникать через гематоэнцефалический барьер [Перетолчина Н.М., Герасимова Г.К., Белоусова А.К. и др. / В кн. "Экспериментальная онкология на рубеже веков" // Ред. М.И. Давыдов, А.Ю. Барышников. - М.: Издательская группа РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2003. С. 147-160].

Отличительной чертой производных НАМ от других алкилирующих агентов является отсутствие перекрестной устойчивости по отношению к другим препаратам этой же группы, а также липофильность и миелосупрессивное действие. Препараты НАМ широко используются в клинической практике. Они обладают высокой терапевтической активностью, широким спектром противоопухолевого действия и применяются в комбинированной терапии опухолей (диссеминированной меланомы, мелкоклеточной карциномы легких, опухолей мозга и лимфом) [Горбунова В.А., Орел Н.Ф., Егоров Г.Н. Этюды химиотерапии. Юбилейный сборник, посвященный 40-летию отделения химиотерапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН / Под редакцией проф. В.А. Горбуновой. - Москва. - 2000. - С. 22-47].

Известно производное НАМ: лизомустин в виде «Лизомустина лиофилизата для приготовления раствора для инфузий 100 мг» [Краснов В.П., Авдюкова Н.В., Клочкова Т.И. и др. / Аналитика и контроль. 2001. Т.5. №2. С. 168-170], [Перетолчина Н.М., Клочкова Т.И., Михайлова Л.М. и др. / Практическое пособие для онкологов и врачей. 2000. С. 22].

Недостатки лизомустина:

1. Выраженная токсичность.

2. Высокая доза вводимого препарата.

3. Низкий спектр терапевтического действия.

Известно средство - N^δ-нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин - производное НАМ (Патент РФ №2503657), обладающее противоопухолевым действием.

Данное средство принято в качестве прототипа.

Недостатки прототипа:

1. Плохая растворимость.

2. Невозможность автоматического дозирования.

3. Нестабильность растворов.

Задачей настоящего изобретения является создание нового отечественного противоопухолевого средства из класса НАМ, удобного в употреблении, обладающего хорошей растворимостью, стабильного при хранении и обладающего высоким цитостатическим эффектом.

Технический результат:

1. Хорошая растворимость.

2. Стабильность при хранении.

3) Расширение спектра отечественных противоопухолевых препаратов из класса НАМ.

Поставленная задача достигается тем, что создано новое противоопухолевое средство, содержащее:

N^δ-Нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин; поливинилпирролидон низкомолекулярный Mm=7000-11000 (ПВП) и кислоту хлористоводородную при следующем соотношении компонентов (мг):

N^δ-Нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин 112,5-137,5 ПВП 270,0-330,0 Кислота хлористоводородная 14,4-17,6

Пример 1

N^δ-Нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин 112,5 ПВП 270,0 Кислота хлористоводородная 14,4

Пример 2

N^δ-Нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин 125,0 ПВП 300,0 Кислота хлористоводородная 16,0

Пример 3

N^δ-Нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин 137,5 ПВП 330,0 Кислота хлористоводородная 17,6

Способ получения заявляемого средства

N^δ-Нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин растворяли в 0,1 М кислоте хлористоводородной, добавляли ПВП (6%), проводили стерилизующую фильтрацию, разливали по 5,0 мл во флаконы вместимостью 20 мл, подвергали сублимации: кассеты с флаконами помещали в камеру сублимационной установки на предварительно охлажденные полки для замораживания и последующей лиофилизации. Температура полки при загрузке не превышала (-40) - (-45)°С.

При достижении температуры (-40) - (-45)°С продукт выдерживали в течение 3 часов.

Повышение температуры полок до -20°С проводили после включения и выравнивания вакуума со скоростью 2°С в час и далее до +20°С со скоростью 5°С в час. Температура препарата при досушивании не превышала +20°С. Продолжительность досушивания составила 3 часа.

Общее время сушки препарата составило 27,5-28 часов.

По окончании процесса сушки вакуум в сублимационной камере гасили чистым профильтрованным стерильным воздухом, пропущенным через патрон с безводным силикагелем и стерильным воздушным фильтром с размером пор 0,22 мкм.

Сравнение цитотоксического действия заявляемого средства и прототипа

Исследование in vitro проводили на клеточных линиях диссеминированной меланомы человека Mel Kor и Mel Z, аденокарциномы молочной железы MCF-7; карциномы легкого А549; карциномы толстой кишки НСТ-116; нейробластомы человека SH-SY5Y; Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat.

Клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10мМ HEPES (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 40 нг/мл гентамицина (ICN, США), 0,1% 1000^х раствора аминокислот и 0,1% 1000^х раствора витаминов (ПанЭко, Россия), при t°=37°С в атмосфере 5% СO₂. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для открепления адгезионных клеточных культур от пластика использовали раствор Версена. Клетки отмывали жидкостью чистой бессывороточной среды RPMI-1640 и пересаживали в 96-луночные плоскодонные планшеты по 4 тыс. клеток в 180 мкл полной среды RPMI-1640 на лунку. Суспензионную клеточную культуру Jurkat снимали без использования раствора Версена и сажали в плоскодонные планшеты в количестве 25 тыс. клеток на лунку в 180 мкл полной среды RPMI-1640.

Через сутки в лунки с клетками добавляли по 20 мкл заявляемого средства и прототипа в различных концентрациях. Планшеты с клетками помещали в инкубатор при t°=37°С 5% СО₂. В качестве контроля использовали лунки с клетками, в которые добавляли 20 мкл среды.

Через 24, 48 или 72 ч в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ[3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 дифенилтетразолий бромид] (маточный раствор 5 мг/мл) и инкубировали 4 ч при t°=37 °С в 5% СО₂-инкубаторе.

После образования формазана планшеты с клетками центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 200 мкл диметисульфоксида. Планшеты помещали на 5-7 минут в термостат при t°=37°С, затем - в шейкер. Интенсивность окрашивания среды измеряли на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан» (ЗАО «Пикон») при λ=530 нм. Величина поглощения была прямо пропорциональна числу живых клеток.

Выживаемость клеток рассчитывалась по формуле:

Все эксперименты повторяли не менее трех раз.

Цитотоксическую активность оценивали по ИК₅₀-концентрации, при которой происходит подавление роста 50% клеток.

Изобретение иллюстрируется таблицами 1-3, где приводятся результаты сравнения цитотоксического и противоопухолевого действия заявляемого средства и прототипа на используемые в исследовании клеточные линии и модели опухолей животных.

На линии клеток Mel Коr максимальный цитотоксический эффект наблюдался для заявляемого средства и прототипа при 72 ч инкубации с самой высокой дозой 1×10^-3 М при 10% выживших клеток. ИК₅₀ для прототипа при инкубации в течение 24 ч и 48 ч в исследуемых концентрациях не найдена, при инкубации в течение 72 ч она составила 5х10^-4 М. При инкубации в течение 72 ч она составила 1х10^-4 М (табл.1).

На клеточной линии Mel Z максимальный цитотоксический эффект наблюдался для заявляемого средства и прототипа при 72 ч инкубации с самой высокой исследованной дозой 5×10^-3 М и составил 10% выживших клеток. ИК₅₀ - для прототипа при инкубации в течение 24 ч и 48 ч в исследуемых концентрациях не найдена, при инкубации в течение 72 ч она составила 5×10^-4 М. ИК₅₀ для заявляемого средства при инкубации 24 ч составила 5×10^-4 М, при инкубации 48 ч - 2,5×10^-4 М, при инкубации в течение 72 ч- 1×10^-4 M (табл. 1).

При 72 ч инкубации ИК₅₀ для заявленного средства на клеточной линии MCF-7 составила 5×10^-4 М, на клеточной линии А549 - 7×10^-4 М, на клеточной линии НСТ-116 - 5×10^-4 М, на клеточной линии SH-SY5Y - 1×10^-4 М и на клеточной линии Jurkat - 4×10^-4 М. Тогда как для прототипа на всех клеточных линиях ИК₅₀ была более высокой: на MCF-7 - 7×10^-4 М, на А549 - 7×10^-3 М, на НСТ-116 и Jurkat - 9×10^-4 М и на SH-SY5Y - 5×10^-4 М (табл. 1).

Показано, что заявляемое средство в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций по сравнению с прототипом оказывает более выраженное цитотоксическое действие на клетки диссеминированной меланомы человека, аденокарциномы молочной железы человека, карциномы легкого человека, карциномы толстой кишки человека, нейробластомы человека и Т-клеточного лимфобластного лейкоза человека.

Сравнение противоопухолевого действия заявляемого средства и прототипа in vivo

Исследование противоопухолевой активности заявляемого средства и прототипа проводили при внутривенном введении стандартным животным: самкам мышей гибридов BDF₁ (С₅₇l/_6j×DBA/2) массой 18-20 грамма, полученным из питомника ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» в соответствии с этическими аспектами проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. Все мыши были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества о состоянии здоровья. мышей содержали в специальных просторных клетках по 5 особей при температуре воздуха 20-23°С и относительной влажности 60-65% в условиях естественного освещения и принудительной вентиляции на подстилке из древесных стружек, стерилизованных в сухожаровом шкафу. Для кормления животных использовали стандартный промышленный и сертифицированный брикетированный корм для грызунов с установленным сроком годности. Кормление проводили в одно и то же время.

Для оценки противоопухолевой активности в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» использовали лимфолейкозы Р-388 и L-1210 мышей и рак шейки матки РШМ-5. Лечение лейкозов начинали через 24 часа, а рака шейки матки через 48 часов после перевивки.

Группы формировались с учетом получения статистически достоверных результатов: контрольная группа состояла из 12 мышей, опытные группы - из 8 или 9 животных.

Критериями оценки противоопухолевого эффекта служили: торможение роста опухоли (ТРО,%), увеличение продолжительности жизни (УПЖ,%) опытных мышей по сравнению с контрольными и излечение.

После однократного внутривенного введения заявляемого средства на модели лимфолейкоза мышей Р-388 в диапазоне доз от 50 мг/кг до 125 мг показана зависимость терапевтического эффекта от дозы. При введении заявляемого средства в дозе 50 мг/кг у мышей с лимфолейкозом Р-388 УПЖ составляло 90%, в дозе 100 мг/кг - 178% и излечение в 22% случаев, в дозе 125 мг/кг - 174% и излечение в 33% случаев. Прототип был эффективен в более высокой дозе - 150 мг/кг, УПЖ составило 178% и излечение 44% случаев (табл.2).

После однократного внутривенного введения заявляемого средства в диапазоне доз от 50 мг/кг до 125 мг/кг на модели лимфолейкоза L-1210 также выявлено, что терапевтический эффект увеличивался при возрастании дозы, в дозе 100 мг/кг УПЖ составило 244%, а излечение 50% случаев, в дозе 125 мг/кг УПЖ составило 346% и излечение в 67% случаев. Тогда как применение прототипа в более высокой дозе 150 мг/кг вызывало УПЖ 196% и излечение в 67% случаев (табл. 2).

Показано, что заявляемое средство в виде лиофилизата для приготовления раствора для инъекций по сравнению с прототипом оказывает более выраженное противоопухолевое действие на перевиваемые опухоли животных - лимфолейкоз Р-388 и L-1210 и рак шейки матки РШМ-5.

Изобретение относится к фармацевтике, в частности к противоопухолевому средству, содержащему N^δ-нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин, поливинилпирролидон низкомолекулярный Mm=7000-11000 и кислоту хлористоводородную. Осуществление изобретения позволяет получить противоопухолевое средство из класса НАМ, удобное в употреблении, обладающее хорошей растворимостью, стабильностью при хранении и обладающее высоким цитостатическим эффектом. 3 табл., 3 пр.

Противоопухолевое средство, содержащее N^δ-нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин, отличающееся тем, что оно содержит поливинилпирролидон низкомолекулярный Мm=7000-11000 (ПВП) и кислоту хлористоводородную при следующих соотношениях компонентов (мг):
N^δ-Нитрозо-N^δ-[(2-хлорэтил)карбамоил]-L-орнитин 112,5-137,5 ПВП 270,0-330,0 Кислота хлористоводородная 14,4-17,6