СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК СОЕДИНИТЕЛЬНО-ТКАННЫХ ОБОЛОЧЕК ГЛАЗНОГО ЯБЛОКА ПРИ СТАЦИОНАРНОЙ МИОПИИ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно офтальмологии, и касается методов прижизненного исследования биологических материалов для определения морфофункциональных характеристик соединительно-тканных оболочек глазного яблока при стационарной миопии высокой степени.

Как показали углубленные клинические исследования последних лет, соединительно-тканные структуры глазного яблока играют ведущую роль в патогенезе практически при всех патологических процессов органа зрения - аномалии развития, дистрофии, новообразования, повреждения и воспаления.

Для прижизненного исследования фиброзной оболочки глазного яблока А. Arciniegas с соавт. (1986), G.R. Bell (1993) и Е.Н. Иомдина (1992) предлагают использовать механико-математическую модель на основе анализа кривых зависимости напряжение-деформация, полученных для образцов изолированной и миопической склеры.

Известен способ оценки биомеханических свойств склеры определения отношения скорости распространения в склере акустических поверхностных волн в середине верхнего века в горизонтальном и вертикальном направлении. При его отрицательном значении прогнозируют прогрессирование течения близорукости (патент RU 2068654 опубл. 10.11.1996).

Недостатком известного способа является низкая информативность, не позволяющая прижизненно оценить морфо-функциональные характеристики соединительно-тканных оболочек глазного яблока.

Известен инструментальный метод, в котором в качестве прогностического критерия используется величина акустической плотности экваториальных отделов склеры, определяемого с помощью ультразвукового В-сканирования плотности экваториальных отделов склеры в стандартизированных условиях (патент RU 2055522, опубл. 10.03.1996).

Данная методика также не обладает достаточными возможностями для доклинической диагностики дистрофических изменений соединительно-тканных оболочек глазного яблока.

Наиболее близким к заявляемому является способ использования в качестве объекта для прижизненного изучения патогенеза прогрессирующей миопии теноновой капсулы глаза - соединительно-тканную оболочку, прилежащую к склере, образцы которой получают во время различных хирургических вмешательств (Иомдина Е.Н., Тарутта Е.П., Игнатьева Н.Ю., Костанян И.А., Минкевич Н.И., Какуев Д.Л., Радченко В.В., Шехтер А.Б., Данилов Н.А., Кварацхелия Н.Г., Чернышева С.Г. Фундаментальные исследования биохимических и ультраструктурных механизмов патогенеза прогрессирующей миопии // Российский офтальмологический журнал. - 2008. - Том 1, №3. - С. 7-12). Изучались образцы теноновой оболочки, взятые во время склероукрепляющих вмешательств с последующим применением комплекса фундаментальных методов - дифференциальной сканирующей калометрии (ДСК), трансмиссонной электронной микроскопии, электрофореза в агарозном геле, вестерн-блот анализа, иммуногистохимии, биохимии.

Недостатком этого метода является трудоемкость, длительность его проведения, односторонность и вследствие этого низкая информативность и точность оценки клеточного состава теноновой капсулы (анализ только фибробластов), что не обеспечивает учета полноты анализа популяций и субпопуляций клеток теноновой капсулы и их активационно-пролиферативного потенциала.

Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в разработке способа диагностики стационарной миопии высокой степени с прижизненным определением морфофункциональных характеристик соединительнотканных оболочек глазного яблока, повышающего точность и объективность результатов исследования, универсальность применения и стандартность проводимой оценки.

Указанный результат достигается тем, что в качестве способа прижизненной оценки морфофункциональных характеристик соединительно-тканных оболочек глазного яблока предлагается метод проточной цитометрии теноновой капсулы. А предлагаемый способ включает в себя использование проточного цитофлюориметра и многоцветного цитометрического анализа, которые дают возможность индентификации популяций и субпопуляций клеток теноновой капсулы и определения их активационно-пролиферативных характеристик.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Забор теноновой капсулы производится во время оперативного вмешательства при проведении склероукрепляющих операций. Затем теноновую капсулу помещают в криопробирки 2 мл (Costar) с раствором для замораживания (эмбриональная телячья сыворотка 90% + диметилсульфоксида 10% + криопротектор (90% Fetal Bovine Serum + 10% DMSO)). Замораживание производят в парах жидкого азота до -180°С со скоростью заморозки 1°С в минуту с использованием программного биологического замораживателя Kryo 560-16 (Planer, Великобритания). Охлажденные криопробирки с материалом помещают в жидкий азот (t -180°С) в сосуды Дюара (СДС-35М ОАО «НПО ГЕЛИЙМАШ» г. Москва). Для проведения проточной цитометрии замороженный материал подвергают медленной разморозке в парах жидкого азота со скоростью +1°С в минуту с использованием программного биологического замораживателя Kryo 560-16 (Planer, Великобритания) для сохранения высокой жизнеспособности клеток.

Размороженный материал переносят в стерильную стеклянную центрифужную пробирку и трехкратно отмывают в растворе NaCl 0,9%. Затем измельчают клеточные элементы в Medimashine (Becton Dichinson, Cod 79300, maximal volume 1 ml, нож BD medicors) до получения гомогенной клеточной суспензии. Осаждают строму в центрифуге при 1500 об/мин в течение 10 минут.

Надосадок, содержащий клетки теноновой капсулы, переносят в стерильную пробирку и вновь осаждают клетки. Супернатант удаляют, а к осадку, содержащему клетки теноновой капсулы, добавляют 1 мл раствора NaCl 0,9% и рессуспендируют. В полученной суспензии определяют фенотип клеток с использованием моноклональных антител (CD) согласно международному протоколу.

Предлагаемый способ апробирован при заборе теноновой капсулы у 5 пациентов с эмметропической рефракцией и у 5 пациентов со стационарной миопией высокой степени. В таблице приведены усредненные результаты содержания популяций и субпопуляций клеток, полученных при исследовании фрагментов теноновой капсулы.

Выбор панели анализируемых CD-маркеров основывался на результатах проведенного аналитического обзора и анализа современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей раздел структурной организации клеток соединительной ткани организма человека, в частности теноновой капсулы глазного яблока.

Установлено, что тенонова капсула при стационарной миопии высокой степени достоверно отличается от эмметропии следующим содержанием популяции и субпопуляции клеток:

1. Повышенным содержанием кератиноцитов с фенотипами CD49f+ и CD49f+HLADR+, эндотелиальных клеток с фенотипом CD146+CD54-HLADR+, тучных клеток с фенотипом CD249+ и моноцитов (макрофагов) с фенотипом CD45+CD14+HLADR+.

2. Более низким содержанием фибробластов (фиброцитов) с фенотипами CD45-CD14-CD44+ и CD45-CD14-CD44+CD80+, клеток Лангенгарса с фенотипом CD207+, эндотелиальные клетки с фенотипами CD146+, CD146+CD54+HLADR- и CD146+CD34+.

Таким образом, современный метод проточной цитометрии и многоцветный цитометрический анализ позволили одновременно проанализировать коллосальное количество различных клеток теноновой капсулы, локализовать отдельные их группы, классы, популяции, субклассы, субпопуляции и оценить их функциональное состояние с использованием моноклональных антител (CD-маркеров).

В конечном итоге объективность интерпретации полученных результатов анализа содержания популяций и субпопуляций клеток теноновой капсулы позволяет использовать заявленный способ для выявления значимых патогенетических механизмов формирования стационарной миопии высокой степени, в которых активно участвуют соединительно-тканные структуры глаза, а значит разработать более эффективные методы профилактики миопии и добиться более высоких результатов в их лечении.

Заявителю неизвестны технические решения, обладающие указанными отличительными признаками, обеспечивающие в совокупности достижение заданного результата, поэтому авторы считают, что заявляемый способ соответствует критериям: новизны, изобретательского уровня и промышленной применимости. Заявляемый способ может найти широкое применение в медицине, офтальмологии, аллергологии и иммунологии, общей и клинической фармакологии.

Изобретение относится к медицине, а именно офтальмологии, и может быть использовано для диагностики стационарной миопии высокой степени. Для этого при хирургии выделяют фрагмент теноновой капсулы, который измельчают и замораживают в парах жидкого азота до -180°С. Для оценки на проточном цитофлюориметре распределения CD-маркеров на поверхности клеток теноновой капсулы замороженный материал размораживают в парах азота, переносят в центрифужную пробирку, отмывают физраствором и центрифугируют. Далее удаляют супернатант и отмывают второй раз физраствором, а затем добавляют к осадку физраствор и полученную тканевую суспензию измельчают с выделением клеточных элементов теноновой капсулы. В полученной суспензии определяют CD-маркеры и при превышении содержания CD49f+, CD49f+HLADR+, CD146+CD54-HLADR+, CD249+, CD45+CD14+HLADR+ клеток и снижения содержания CD45-CD14-CD44+, CD45-CD14-CD44+CD80+, CD207+, CD146+, CD146+CD54+HLADR-, CD146+CD34+ клеток диагностируют стационарную миопию высокой степени. Использование данного способа позволяет с помощью определения субпопуляций клеток теноновой капсулы диагностировать стационарную миопию высокой степени с прижизненным определением морфофункциональных характеристик соединительно-тканных оболочек глазного яблока. 1 табл.

Способ диагностики стационарной миопии высокой степени с прижизненным определением морфофункциональных характеристик соединительно-тканных оболочек глазного яблока, отличающийся тем, что при хирургии выделяют фрагмент теноновой капсулы, который измельчают и замораживают в парах жидкого азота до -180°С, для оценки на проточном цитофлюориметре распределения CD-маркеров на поверхности клеток теноновой капсулы замороженный материал размораживают в парах азота, переносят в центрифужную пробирку, отмывают физраствором и центрифугируют, удаляют супернатант и отмывают второй раз физраствором, а затем добавляют к осадку физраствор и полученную тканевую суспензию измельчают с выделением клеточных элементов теноновой капсулы, в полученной суспензии определяют CD-маркеры и при превышении содержания CD49f+, CD49f+HLADR+, CD146+CD54-HLADR+, CD249+, CD45+CD14+HLADR+ клеток и снижения содержания CD45-CD14-CD44+, CD45-CD14-CD44+CD80+, CD207+, CD146+, CD146+CD54+HLADR-, CD146+CD34+ клеток диагностируют стационарную миопию высокой степени.