СОСТАВ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЯ СЕМЕЙСТВА РЯСКОВЫЕ (Lemna minor) В УСЛОВИЯХ in vitro Российский патент 2016 года по МПК A01G1/00 C05D9/02 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для производства как высокобелковых кормов в отраслях кормопроизводства, так и разнообразных белковых препаратов в фармацевтике и ветеринарии.

При культивировании растений семейства рясковых (разные виды Lemna, Wolffia, Spirodela) в условиях in vitro рядом исследователей рекомендованы среды, составленные по прописям Мурасиге-Скуга (наиболее универсальная среда) (Войнов Н.А. и др., 2009), Гамборга, Шенка-Хильдебрандта (Schenk and Hildebrandt, 1972; Gamborg et al., 1968; Boehm et al., 2001; Kruse et al., 2001; Li J. et al., 2004; Friedrich A.S., 2005).

Наиболее распространенными средами для водных и песчаных культур являются среды, составленные по прописям Кнопа, Стейнберга и Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Steinberg, R., 1946; Knop, 1865; Hoagland and Arnon., 1938) и имеющие более низкое, по сравнению с вышеупомянутыми, содержание минеральных веществ. Все указанные среды разработаны для культивирования широкого круга растений, поэтому не в полной мере удовлетворяют индивидуальным потребностям в элементах питания отдельно взятого объекта, что не позволяет максимально реализовать его потенциальную биологическую продуктивность.

Наиболее близкой по биологической сущности к изобретению является среда Стейнберга (Steinberg, R., 1946), включающая в свой состав следующие компоненты, мас.%:

КН₂РO₄ 0,43 К₂НРO₄ 0,060 Ca(NO₃)₂×4H₂O 1,41 KNO₃ 1,67 MgSO₄×7H₂O 0,48 FeCl₃×6H₂O 0,004 Nа₂ЭДТА×2Н₂O 0,007 Na₂MoO₄×2H₂O 0,0002 ZnSO₄×7H₂O 0,0008 MnCl₂×4H₂O 0,004 H₃BO₃ 0,0006 Сахароза Остальное

К недостаткам указанной среды для культивирования водных растений относятся несбалансированность минерального питания для индивидуальных потребностей Lemna minor и практически полное отсутствие органических элементов питания за исключением сахарозы.

Задача изобретения - повышение биологической продуктивности Lemna minor за счет оптимизации содержания элементов питания в культивационной среде.

Поставленная задача достигается изменением баланса минеральных элементов в питательном растворе, заменой некоторых минеральных элементов и включением в раствор дополнительных как минеральных, так и органических компонентов. Для этого среда, включающая фосфат калия монозамещенный - КН₂РO₄, четырехводный нитрат кальция - Ca(NO₃)₂×4Н₂O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄×7H₂O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄×2H₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄×7H₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Na₂ЭДТА×2H₂O и борную кислоту - Н₃ВO₃, дополнительно содержит калия йодид - KJ, кобальта хлорид - СоСl₂×6Н₂O, глицин, глутамин, тиамин, пиридоксин, фолиевую кислоту, семиводный сульфат железа - FeSO₄×7H₂O, пятиводный сульфат марганца - MnSO₄×5H₂O, фруктозу и пятиводный сульфат меди - CuSO₄×5H₂O при следующем содержании компонентов, мас.%:

КН₂РO₄ 1,31-1,44 Ca(NO₃)₂×4H₂O 1,89-2,09 KNO₃ 2,23-2,46 MgSO₄×7H₂O 1,14-1,26 FeSO₄×7H₂O 0,13-0,15 Na₂ЭДТА×2H₂O 0,18-0,20 KJ 0,0018-0,0020 Na₂MoO₄×2H₂O 0,00021-0,00023 ZnSO₄×7H₂O 0,00096-0,00106 CuSO₄×5H₂O 0,00015-0,00017 MnSO₄×5H₂O 0,0015-0,0016 H₃BO₃ 0,00086-0,00095 CoCl₂×6H₂O 0,00036-0,00040 Глицин 0,46-0,51 Глутамин 0,49-0,54 Тиамин 0,045-0,050 Пиридоксин 0,0044-0,0048 Фолиевая кислота 0,065-0,072 Фруктоза Остальное

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав раствора отличается от известных по содержанию всех компонентов ионной формой ряда компонентов и введением новых компонентов. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию «новизна». Разработанная среда обеспечила многократное повышение продуктивности Lemna minor по целому комплексу показателей, таких как прирост биомассы популяции, содержание тотального белка в 100 мг сырой массы и процентное содержание белка в сухой массе, обеспечивая при этом достаточно высокий показатель содержания сухого вещества, и не вызывая видимых физиологических отклонений в архитектонике растения. Наиболее важный показатель - выход тотального белка с популяции - также превосходит аналогичный показатель при культивировании Lemna minor на ранее известных аналогах сред. Таким образом, данный состав компонентов среды действительно увеличивает продуктивность объекта, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «существенные отличия».

Для экспериментальной проверки заявляемого состава были подготовлены четыре варианта: прототип (среда Стейнберга (St)) и три варианта заявляемой среды (L4M«1» - среда составлена по наименьшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, L4M«2» - среда составлена по средним величинам из заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, L4M«3» - среда составлена по наибольшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов).

Смеси получили простым смешиванием. Среды готовили из концентрированных маточных растворов стандартной компоновки (Войнов Н.А. и др., 1998) (табл.1):

Растения помещали на жидкие питательные среды в количестве 10 растений в одну банку общим объемом 300 мл в трехкратной повторности для каждого из вариантов. Объем среды в каждой банке составлял 50 мл. Учетный период - 1 месяц со дня посадки (табл.2).

Приведенные в табл.2 данные по результатам дисперсионного анализа показали наличие достоверных различий фактора на 95% уровне значимости.

Из табл.2 следует, что заявляемая среда существенно превосходит по всем показателям продуктивности прототип. Так же полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании граничных значений заявляемых допустимых интервалов масс компонентов происходит снижение продуктивности Lemna minor по всем показателям в связи с дефицитом либо избытком элементов питания в среде.

Источники информации

1. Войнов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В., Маркова С.В., Франк Л.А., Шишацкая Е.И. Современные проблемы и методы биотехнологии / Учеб. пособие. - Красноярск, ИПК СФУ, 2009. - 418 с.

2. Гродзинский А.М, Гродзинский Д.М. (1973). Краткий справочник по физиологии растений. Изд. 2, испр., доп. - Киев: Наукова думка. - 590 с.

3. Boehm, R., Kruse, С., Voeste, D., Barth, S. and Schnabl, H. (2001) A transient transformation system for duckweed (Wolffia columbiana) using Agrobacterium-mediated gene transfer. J Appl Bot 75:107-111.

4. Friedrich A.S. (2005) Untersuchungen zu Kultivierung, Transformation und Fermentation von Wolffia spec. - Inaugural - Dissertation. - 177 s.

5. Gamborg, O.L., Miller, R.A. and Ojima, K. (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50, 151-158.

6. Gamborg, O.L., Constabel, F., La Rue, T.A. G., Miller R.A. & Steck, W. (1971). The influence of hormones on secondary metabolite formation in plant cell cultures. In Les Cultures de Tissas de Plantes, pp. 335-44. Paris: Centre National de la Recherche Scientifique.

7. Hoagland, D.R., and Arnon, D.I., (1938) The water-culture method for growing plants without soil Univ. Calif. Coll. Agric. Exp. Sta. Circ. Berkeley, CA 347-353

8. Knop, W. (1865) Quantitative Utersuchungen Über den Ernährungensprozeβ der Pflanze. Landw. Versuchssat. 7:93.

9. Knop, W. (1865) Arbeiten aus dem Laboratorio der Versuchs-Station zu Moecern. Die Landwirtschaftlichen Versuchs-Stationen 7: 436-450.

10. Kruse, C., Boehm, R., Voeste, D., Barth, S. and Schnabl, H. (2001) Transient transformation of Wolffia columbiana by particle bombardment. Aquatic Bot 72:175-181.

11. Li. J, Jain. M, Vunsh. R, Vishnevetsky. J, Hanania. U, Flaishman M., Perl. A, Edelman. M. Callus induction and regeneration in Spirodela and Lemna // Plant Cell Rep (2004) 22:457-464.

12. Steinberg, R., 1946: Mineral requirement of Lemna minor. Plant Physiology, 21, 42-48.

Изобретение относится к биотехнологии. Состав среды для культивирования растения семейства Рясковые (Lemna minor) в условиях in vitro включает фосфат калия монозамещенный - KH₂PO₄, четырехводный нитрат кальция - Ca(NO₃)₂×4H₂O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄×7H₂O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄×2H₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄×7H₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Nа₂ЭДТА×2H₂O и борную кислоту - H₃BO₃, дополнительно содержит калия йодид - KI, кобальта хлорид - CoCl₂×6H₂O, глицин, глутамин, тиамин, пиридоксин, фолиевую кислоту, семиводный сульфат железа - FeSO₄×7H₂O, пятиводный сульфат марганца - MnSO₄×5H₂O, фруктозу и пятиводный сульфат меди - CuSO₄×5H₂O. Все компоненты взяты при определенном соотношении. Изобретение позволяет повысить биологическую продуктивность Lemna minor за счет оптимизации содержания элементов питания в культивационной среде. 2 табл.

Состав среды для культивирования растений семейства Рясковые (Lemna minor) в условиях in vitro, включающий фосфат калия монозамещенный - KH₂PO₄, четырехводный нитрат кальция - Ca(NO₃)₂×4H₂O, нитрат калия - KNO₃, семиводный сульфат магния - MgSO₄×7H₂O, двуводный молибдат натрия - Na₂MoO₄×2H₂O, семиводный сульфат цинка - ZnSO₄×7H₂O, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - Nа₂ЭДТА×2H₂O и борную кислоту - H₃BO₃, дополнительно содержит калия йодид - KI, кобальта хлорид - CoCl₂×6H₂O, глицин, глутамин, тиамин, пиридоксин, фолиевую кислоту, семиводный сульфат железа - FeSO₄×7H₂O, пятиводный сульфат марганца - MnSO₄×5H₂O, фруктозу и пятиводный сульфат меди - CuSO₄×5H₂O при следующем содержании компонентов, мас.%:
KH₂PO₄ 1,31-1,44 Ca(NO₃)₂×4H₂O 1,89-2,09 KNO₃ 2,23-2,46 MgSO₄×7H₂O 1,14-1,26 FeSO₄×7H₂O 0,13-0,15 Na₂ЭДTA×2H₂O 0,18-0,20 KI 0,0018-0,0020 Na₂MoO₄×2H₂O 0,00021-0,00023 ZnSO₄×7H₂O 0,00096-0,00106 CuSO₄×5H₂O 0,00015-0,00017 MnSO₄×5H₂O 0,0015-0,0016 H₃BO₃ 0,00086-0,00095 CoCl₂×6H₂O 0,00036-0,00040 Глицин 0,46-0,51 Глутамин 0,49-0,54 Тиамин 0,045-0,050 Пиридоксин 0,0044-0,0048 Фолиевая кислота 0,065-0,072 Фруктоза Остальное