СРЕДА ДЛЯ СЛИЯНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РИСА Российский патент 1999 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии, культуре растительных тканей, физиологии, может быть использовано при генноинженерном конструировании растительных организмов.

В отечественной и зарубежной практике, а также в селекционных и физиологических исследованиях широкое распространение получило применение метода вегетационной (соматической) гибридизации, необходимой составной частью которого является среда для слияния протопластов. Важнейшим компонентом таких сред являются вешества-фузогены, обеспечивающие слияние протопластов, одним из них является ПЭГ-HO(CH₂H₄O)пH-(полиэтиленгликоль).

Известна среда для слияния протопластов, содержащая полиэтиленгликоль (см. например: Биология растений. Культура клеток. Под редакцией Л.Г.Бутенко. М.,"Агропромиздат", 1989, с. 69-70): HO(CH₂H₄O)₈₈H - 64,51; C₁₂H₂₂O₁₁ - 8,602; CaCl₂ • 2H₂O - 0,3139; NH₂CH₂COOH - 0,404; C₆H₁₄O₆ - 19,35; сухого вещества в растворе - 46,49% вес., остальное - вода.

Эта смесь рекомендуется в качестве основной смеси для соматической гибридизации растений любого систематического таксона, но не имеет видоспецифической направленности.

Известна также смесь для слияния протопластов (CM.Laszlo Мenczel, Kathy Wolfe. High freguency oi fusion induced in freely suspended protoplast mixtures by polyethylene glycol and dimethyl 'sulfoxide at high ph//Plant Cell Reports (1984), 3: 196-198), содержащая следующие компоненты в % вес.:
CaCl₂ • 2H₂O - 0,0702; KH₂PO₄ - 0,0790; HNO₃ - 1,403; (NH₄)₂SO₄ - 0,062; MgSO₄ • 7H₂O - 0,116; MnSO₄ • H₂O - 0,0046; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,0004; MnSO₄ • 4H₂O - 0,00617; H₃BO₃ - 0,0014; KI - 0,0003; CuSO₄ • 5H₂O - 0,00001; Na₂MoO₄ • 2H₂O - 0,0001; CoCl₂ • 6H₂O - 0,00001; FeSO₄ • 7H₂O - 0,01301; HO(CH₂H₄O)₈₈H - 46,781; C₆H₁₄O₆ - 32,748; NaOH - 9,3588; NH₂CH₂COOH - 9,356; сухого вещества в растворе - 21,4% вес., остальное - вода.

Эта питательная среда принята в качестве прототипа изобретению, т.к. она является наиболее близкой ему как по назначению, так и по технической сущности.

Недостатком прототипа является: низкая плотность слияния протопластов, отрицательно влияющая на процессы морфогенеза и каллусообразования.

Задачей являлось увеличение процента частоты слияния протопластов риса.

Поставленная задача достигается тем, что в питательную среду, содержащую хлорид кальция двухводный, фосфорнокислый калий, нитрат калия, сернокислый аммоний, семиводный сульфат магния, одноводный сернокислый марганец, семиводный сульфат цинка, четырехводный сульфат марганца, борную кислоту, йодистый калий, пятиводный сульфат меди, двухводный молибденовокислый натрий, шестиводный хлорид кобальта, семиводный сульфат железа, полиэтиленгликоль, маннитол, гидроксид натрия, глицин, дополнительно вводят диметилсульфоксид в качестве вещества, усиливающего эффект полиэтиленгликоля при следующем соотношении компонентов, в % вес. (таблица 1).

Сопоставимый анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемая среда для слияния протопластов отличается от известной введением нового компонента, а именно, диметилсульфоксида.

Таким образом, решение соответствует критерию новизна. Анализ известных сред для слияния (см., например, Laszlo Menczel, Kathy Wolfe. High freguency of fusion induced in freely suspended protoplast mixtures by polyethylene glycol and dimethyl sulfoxide at high ph//Plant Cell Reports (1984), 3: 196 - 198), используемых в биотехнологии, показал, что ряд введенных в заявляемое решение веществ известны. Однако их применение в известных культуральных средах в сочетании с полиэтиленгликолем не обеспечивает средам такие свойства, которые они проявляют в заявленном решении, а именно: повышение плотности слияния протопластов, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "существенные отличия" (см. таблицу 2).

Диметилсульфоксид (DMSO)C₂H₆SO - 78,13, широко применяемый растворитель, t_пл. - 18,5^oC; t_кип. - 189^oC; растворяется в органических растворителях, воде, диффундирует через покровные ткани (Л.И.Кнунянц. Химический энциклопедический словарь. М., "Советская энциклопедия", 1983, с. 171).

Для экспериментальной проверки заявляемой среды были приготовлены 6 сред (таблица 2). Опыты по слиянию мезофильных протопластов, полученных из мутантных линий N107 и 98 из сорта Лиман, проводили в двухкратной повторности.

Изложенная сущность изобретения поясняется примерами:
Пример 1.

Среду для слияния мезофильных и каллусных протопластов готовили по следующей технологии: CaCl₂ • 2H₂O - 0,0702; KH₂PO₄ - 0,0790; KNO₃ - 1,403; (NH₄)₂SO₄ - 0,062; MgSO₄ • 7H₂O - 0,116; MnSO₄ • H₂О - 0,0046; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,0004; MnSO₄ • 4H₂О - 0,00617; H₃BO₃ - 0,0014; KI - 0,0003; CuSO₄ • 5H₂O - 0,00001; Na₂MoO₄ • 2H₂O - 0,0001; CoCl₂ • 6H₂O - 0,00001; FeSO₄ • 7H₂O - 0,01301; HO(CH₂H₄O)₈₈)H - 46,781; C₆H₁₄O₆ - 32,748; NaOH -9,3588% вес, сухого вещества в растворе - 21,4%, остальное - вода, компоненты растворяли в 950 мл H₂O; автоклавировали 15' при 121^oC, добавляли NH₂CH₂COOH - 9,356%, доводили объем до 1000 мл. Тщательно перемешивали растворами HCl и NaOH, устанавливали pH среды до 10,0. В 10-см чашки Петри помещали по 4 мл раствора суспензии протопластов и 4 мл раствора для слияния, смешивали 5 круговыми движениями и оставляли в покое на весь период слияния (40' при комнатной температуре), после чего слившиеся протопласты промывали в промывочном растворе, а продукт слияния оценивали микроскопически (подсчитывали плотность слившихся протопластов и частоту слияния, %).

Пример 2.

Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl₂ • 2H₂O - 0,0444; KH₂PO₄ - 0,0508; KNO₃ - 1,3407; (NH₄)₂SO₄ - 0,0401; MgSO₄ • 7H₂O - 0,0749; MnSO₄ • H₂O - 0,044; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,00059; MnSO₄ • 4H₂O - 0,0039; H₃BO₃ - 0,0013; KI - 0,00022; CuSO₄ • 5H₂O - 0,000007; Na₂MoO₄ • 2H₂O - 0,00007; CoCl₂ • 6H₂O - 0,000007; FeSO₄ • 7H₂O - 0,0083; HO(CH₂H₄O)₈₈H - 29,818706; C₆H₁₄O₆ - 20,993; NaOH - 5,992, NH₂CH₂COOH - 5,992, C₂H₆SO - 35,595, сухое вещество - 22,124013, остальное - вода.

Пример 3.

Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl₂ • 2H₂O - 0,0478; KH₂PO₄ - 0,054; KNO₃ - 0,0956; (NH₄)₂SO₄ - 0,0427; MgSO₄ • 7H₂O - 0,0796; MnSO₄ • H₂O - 0,0032; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,00064; MnSO₄ • 4H₂O - 0,0042; H₃BO₃ - 0,0009; KI - 0,00024; CuSO₄ • 5H₂O - 0,000007; Na₂MoO₄ • 2H₂O - 0,00007; CoCl₂ • 6H₂O - 0,000007; FeSO₄ • 7H₂O - 0,0089; HO(CH₂H₄O)₈₈H - 40,705808; C₆H₁₄O₆ - 28,716; NaOH - 8,205, NH₂CH₂COOH - 6,374, C₂H₆SO - 15,661328, сухое вещество - 22,4, остальное - вода.

Пример 4.

Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl₂ • 2H₂O - 0,0568; KH₂PO₄ - 0,0643; KNO₃ - 1,137; (NH₄)₂SO₄ - 0,0510; MgSO₄ • 7H₂O - 0,0947; MnSO₄ • H₂O - 0,0037; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,00075; MnSO₄ • 4H₂O - 0,0050; H₃BO₃ - 0,0011; KI - 0,00028; CuSO₄ • 5H₂O - 0,000009; Na₂MoO₄ • 2H₂O - 0,00009; CoCl₂ • 6H₂O - 0,000009; FeSO₄ • 7H₂O - 0,0105; HO(CH₂H₄O)₈₈H - 37,913; C₆H₁₄O₆ - 26,539; NaOH - 7,583762, NH₂CH₂COOH - 7,582, C₂H₆SO - 18,957, сухое вещество - 26,3762, остальное - вода.

Пример 5.

Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl₂ • 2H₂O - 0,0615; KH₂PO₄ - 0,0695; KNO₃ - 1,231; (NH₄)₂SO₄ - 0,0549; MgSO₄ • 7H₂O - 0,103; MnSO₄ • H₂O - 0,0041; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,00082; MnSO₄ • 4H₂O - 0,0054; H₃BO₃ - 0,0012; KI - 0,0003; CuSO₄ • 5H₂O - 0,000009; Na₂MoO₄ • 2H₂O - 0,00009; CoCl₂ • 6H₂O - 0,000009; FeSO₄ • 7H₂O - 0,0111; HO(CH₂H₄O)₈₈H - 34,97028; C₆H₁₄O₆ - 22,31; NaOH - 6,374, NH₂CH₂COOH - 7,705, C₂H₆SO - 27,097792, сухое вещество - 34,05, остальное - вода.

Пример 6.

Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде в % вес. следующее: CaCl₂ • 2H₂O - 0,0670; KH₂PO₄ - 0,0757; KNO₃ - 0,0899; (NH₄)₂SO₄ - 0,059; MgSO₄ • 7H₂O - 0,1117; MnSO₄ • H₂O - 0,0029; ZnSO₄ • 7H₂O - 0,00085; MnSO₄ • 4H₂O - 0,0058; H₃BO₃ - 0,0008; KI - 0,0003; CuSO₄ • 5H₂O - 0,00001; Na₂MoO₄ • 2H₂O - 0,0001; CoCl₂ • 6H₂O - 0,00001; FeSO₄ • 7H₂O - 0,0124; HO(CH₂H₄O)₈₈H - 44,691; C₆H₁₄O₆ - 31,283; NaOH - 8,90013; NH₂CH₂COOH - 8,938, C₂H₆SO - 5,7614; сухое вещество - 34,4; остальное - вода.

Результаты экспериментов представлены в таблице 3. Как следует из экспериментальных данных, использование оптимального варианта предлагаемой смеси обеспечивает увеличение частоты слияния протопластов на 15,83%. Последнее очень важно, т.к. приводит к увеличению количества микрокаллусов и получению большого числа регенерантов, позволяет уменьшить количество повторностей, лабораторной техники и рабочего времени.

Изобретение предназначено для использования в биотехнологии, культуре растительных тканей, физиологии. В среду для слияния протопластов дополнительно вводят диметилсульфоксид при следующем соотношении компонентов, вес.%: CaCl₂•2H₂O 0,0478 - 0,0615, KH₂РО₄ 0,054 - 0,0695, KNO₂ 0,0956 - 1,231, (NH₄)₂SO₄ 0,0427 - 0,0549, MgSO₄•7H₂O 0,0796 - 0,103, MnSO₄•H₂O 0,0032 - 0,0041, ZnSO₄•7H₂O 0,00064 - 0,00082, MnSO₄•4H₂O 0,0042 - 0,0054, H₃BO₃ 0,0009 - 0,0012, KI 0,00024 - 0,0006, СuSO₄•5Н₂О 0,000007 - 0,000009, Nа₂МоO₄•2Н₂О 0,00007 - 0,00009, CoCl₂•6H₂O 0,000007 - 0,000009, Fe₂SO₄•7H₂O 0,0089 - 0,0111, HO(CH₂H₄O)₈₈H 34,97028 - 40,705808, C₆H₁₄O₆ 22,310 - 28,716, NaOH 6,374 - 8,205, NH₂CH₂COOH 6,374 - 7,705, C₂H₆SO 15,661328 - 27,097792. Изобретение обеспечивает увеличение слияния протопластов, что способствует получению большего числа регенератов. 3 табл.

Среда для слияния протопластов риса, включающая хлорид кальция двухводный, фосфорнокислый калий, нитрат калия, сернокислый аммоний, семиводный сульфат магния, одноводный сернокислый марганец, семиводный сульфат цинка, четырехводный сульфат марганца, борную кислоту, йодистый калий, пятиводный сульфат меди, двухводный молибденовокислый натрий, шестиводный хлорид кобальта, семиводный сульфат железа, полиэтиленгликоль, маннитол, гидроксид натрия, глицин, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит диметилсульфоксид в качестве химического вещества, усиливающего фузогенный эффект полиэтиленгликоля при следующем соотношении компонентов, вес.%:
CaCl₂•2Н₂О - 0,0478 - 0,0615
КН₂РО₄ - 0,054 - 0,0695
KNO₃ - 0,0956 - 1,231
(NH₄)₂SO₄ - 0,0427 - 0,0549
MgSO₄•7Н₂О - 0,0796 - 0,103
MnSO₄•Н₂О - 0,0032 - 0,0041
ZnSO₄•7Н₂О - 0,00064 - 0,00082
MnSO₄•4Н₂О - 0,0042 - 0,0054
Н₃ВО₃ - 0,0009 - 0,0012
KI - 0,00024 - 0,0003
CuSO₄•5Н₂О - 0,000007 - 0,000009
Na₂МоО₄•2Н₂О - 0,00007 - 0,00009
CoCl₂•6Н₂О - 0,000007 - 0,000009
FeSO₄•7Н₂О - 0,0089 - 0,0111
НО(СН₂Н₄О)₈₈Н - 34,97028 - 40,705808
С₆Н₁₄О₆ - 22,310 - 28,716
NaOH - 6,374 - 8,205
NH₂СН₂СООН - 6,374 - 7,705
С₂Н₆SO - 15,661328 - 27,097792