Питательная среда для повышения синтеза стильбенов в каллусной культуре винограда Российский патент 2023 года по МПК A01G24/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур винограда как источника биологически ценных веществ и может быть использовано для получения сырья биологически активных веществ растительного происхождения за счет стимулирования синтеза вторичных метаболитов, прежде всего стильбенов, в каллусной культуре винограда.

Виноград и продукты его переработки являются важным источником полезных для человека полифенолов, среди которых наибольший интерес представляют стильбены и, главным образом, ресвератрол. Это природный фитоалексин, содержащийся в кожице ягод, семенах, листьях, побегах, корневых волосках винограда. Для человека он представляет интерес как вещество, оказывающее выраженный положительный терапевтический эффект на сердечно-сосудистую, пищеварительную и нервную системы. Одной из проблем производства ресвератрола является его неоднородное накопление в различных частях виноградного растения и загрязнение сопутствующими вторичными метаболитами.

Каллусные культуры - дедифференцированные пролиферирующие ткани растений, в естественных условиях возникающие на раневых поверхностях. Каллусные культуры представляют интерес в качестве объекта биотехнологического производства биологически активных веществ (БАВ) так как, не имея специализации, способны равномерно синтезировать целевое вещество и увеличивать биомассу, меньше подвержены воздействию условий окружающей среды благодаря контролируемым параметрам при их выращивании; возможен максимальный контроль производства БАВ и получение БАВ в стерильных условиях.

На сегодняшний день прямых аналогов предлагаемому изобретению нет в связи с существованием принципиально иных методик, направленных на получение стильбенов.

Самым распространенным способом является стимуляция фенольного метаболизма в модифицированной генами стильбенсинтаз кишечной палочке (Escherichia coli) с последующей экстракцией (CN106032525A). Недостатком данного способа является высокая вероятность мутаций культур, используемых в качестве производителей стильбенов, поэтому не позволяет получать равномерный выход этих вторичных метаболитов.

Известен способ получения ресвератрола (патент RU №2326165), который имеет высокую производительность, однако основан на использовании трансгенных культур клеток. С другой стороны, такой подход существенно увеличивает стоимость получаемого продукта, эквивалентно стоимости получения трансгенной культуры.

Техническим результатом при использовании предлагаемого изобретения является повышение синтеза стильбенов в каллусной культуре винограда в 5-9 раз, повышение ростовой активности каллуса в 1,5-2 раза, что делает этот способ более стабильным в вопросе получения продукта и удешевляет процесс производства.

Технический результат достигается тем, что каллусная культура выращивается на питательной среде следующего состава: нитрат аммония (NH₄NO₃) - 350-450 мг/л; нитрат калия (KNO₃) - 1,0-1,2 г/л; фосфат натрия (NaH₂PO₄) - 150-200 мг/л; сульфат магния (MgSO₄⋅7H₂O) - 320-340 мг/л; нитрат кальция (Ca(NO₃)₂⋅4H₂O) - 400-500 мг/л; хлорид кальция (CaCl₂) - 50-80 мг/л; сульфат железа (FeSO₄⋅7H₂O) - 27,8-30,0 мг/л; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na₂-ЭДТА⋅2H₂O) - 37,3-40,0 мг/л; борная кислота (Н₃ВО₃) - 6,0-6,4 мг/л; сульфат марганца (MnSO₄⋅4H₂O) - 22,0-22,6 мг/л; сульфат цинка (ZnSO₄⋅7H₂O) 8,0-9,2 мг/л; йодид калия (KJ) - 0,40-0,80 мг/л; натрий молибденокислый (Na₂MoO₄) - 0,2-0,3 мг/л; сульфат меди (CuSO₄⋅5H₂O) - 0,02-0,03 мг/л; хлорид кобальта (CoCl₂⋅6H₂O) - 0,02-0,03 мг/л; миоинозит - 50-100 мг/л; тиамин - 0,2-0,5 мг/л; пиридоксин - 0,2-0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 1,5-2 мг/л; индолилмасляная кислота (ИМК) -0,06-0,1 мг/л; сахароза - 20-30 г/л; агар - 5,5-6,5 г/л; пролин - 1,1-1,2 г/л; метилжасмонат - 1,12 мкл. Смесь перечисленных реагентов следует растворить в 1 литре бидистиллированной воды.

Известен состав питательной среды (патент RU №2636030) сходный по многим компонентам с заявляемым составом в предлагаемом изобретении. Существенное отличие запатентованного изобретения №2636030 заключается в том, что питательная среда предназначена для ввода и регенерации меристем винограда в условиях in vitro.

Культивация каллусных тканей винограда по заявляемому изобретению осуществляется в течение двух недель под освещением белым светом интенсивностью 3 кЛк при температуре 23-25°С. Полученная каллусная культура характеризуется повышенным содержанием ресвератрола и является пригодным для промышленного производства источником этого стильбена.

Примеры конкретного применения

Пример 1. Заранее выращенный по классической методике каллус винограда сорта Красностоп Золотовкий пересаживается на питательную среду следующего состава: NH₄NO₃ - 375 мг/л; KNO₃ - 1,1 г/л; NaH₂PO₄ - 175 мг/л; MgSO₄⋅7H₂O - 330 мг/л, Ca(NO₃)₂⋅4H₂O - 450 мг/л; CaCl₂ - 65 мг/л; FeSO₄⋅7H₂O - 28,0 мг/л; Na₂-ЭДТА⋅2H₂O - 38,0 мг/л; H₃BO₃ - 6,2 мг/л; MnSO₄⋅4H₂O - 22,3 мг/л; ZnSO₄⋅7H₂O - 8,6 мг/л; KJ - 0,60 мг/л; Na₂MoO₄ - 0,25 мг/л; CuSO₄⋅5H₂O - 0,03 мг/л; CoCl₂⋅6H₂O - 0,03 мг/л; миоинозит - 75 мг/л; тиамин и пиридоксин, по 0,3 мг/л; 6- бензиламинопурин - 2; индолилмаслянная кислота - 0,1 мг/л; сахароза - 25,0 г/л; агар - 6,0 г/л; пролин -1,2 г/л; метилжасмонат 1,12 мкл/л. Смесь доводится дистиллированной водой до 1 л. Результатом является увеличение содержания ресвератрола в каллусной ткани до 0,48 мг/г сухой массы (что больше контрольных значений в 8 раз), пицеида до 0,21 мг/г сухой массы (5-кратный прирост), виниферина до 0,34 мг/г сухой массы (8-кратный прирост). При этом ростовая активность каллуса возрастает в 1,8 раза.

Пример 2. Состав питательной среды следующего состава: NH₄NO₃ - 350 мг/л; KNO₃ - 1,0 г/л; NaH₂PO₄ - 150 мг/л; MgSO₄⋅7H₂O - 320 мг/л, Ca(NO₃)₂⋅4H₂O - 400 мг/л; CaCl₂ - 50 мг/л; FeSO₄⋅7H₂O - 27,8 мг/л; Na₂-ЭДТА⋅2H₂O - 37,3 мг/л; Н₃ВО₃ - 6,0 мг/л; MnSO₄⋅4H₂O - 22,0 мг/л; ZnSO₄⋅7H₂O - 8,0 мг/л; KJ - 0,40 мг/л; Na₂MoO₄ - 0,20 мг/л; CuSO₄⋅5H₂O - 0,02 мг/л; CoCl₂⋅6H₂O - 0,02 мг/л; миоинозит - 50 мг/л; тиамин и пиридоксин, по 0,2 мг/л; 6-бензиламинопурин - 1,5; индолилмаслянная кислота - 0,06 мг/л; сахароза -20,0 г/л; агар - 5,5 г/л; пролин - 1,1 г/л; метилжасмонат 1,12 мкл/л. Смесь доводится дистиллированной водой до 1 л. Результатом является увеличение содержания ресвератрола в каллусной ткани до 0,40 мг/г сухой массы (что больше контрольных значений в 5 раз), пицеида до 0,18 (4-кратный прирост), виниферина до 0,27 (6-кратный прирост). При этом ростовая активность каллуса возрастает в 2 раза.

Пример 3. Состав питательной среды следующего состава: NH₄NO₃ - 450 мг/л; KNO₃ - 1,2 г/л; NaH₂PO₄ - 200 мг/л; MgSO₄⋅7H₂O - 340 мг/л, Ca(NO₃)₂⋅4H₂O - 500 мг/л; CaCl₂ - 80 мг/л; FeSO₄⋅7H₂O - 30,0 мг/л; Na₂-ЭДТА⋅2H₂O - 40,0 мг/л; Н₃ВО₃ - 6,4 мг/л; MnSO₄⋅4H₂O - 22,6 мг/л; ZnSO₄⋅7H₂O - 9,2 мг/л; KJ - 0,80 мг/л; Na₂MoO₄ - 0,20 мг/л; CuSO₄⋅5H₂O - 0,03 мг/л; CoCl₂⋅6H₂O - 0,03 мг/л; миоинозит - 100 мг/л; тиамин и пиридоксин, по 0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин - 2,0; индолилмаслянная кислота - 0,1 мг/л; сахароза - 30,0 г/л; агар - 6,5 г/л; пролин - 1,2 г/л; метилжасмонат 1,12 мкл/л. Смесь доводится дистиллированной водой до 1 л. Результатом является увеличение содержания ресвератрола в каллусной ткани до 0,54 (что больше контрольных значений в 9 раз), пицеида до 0,27 (6-кратный прирост), виниферина до 0,41 (10-кратный прирост) мг/г сухой массы. При этом ростовая активность каллуса возрастает в 1,5 раза.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур винограда как источника биологически ценных веществ, и может быть использовано для получения сырья биологически активных веществ растительного происхождения за счет стимулирования синтеза вторичных метаболитов, прежде всего стильбенов, в каллусной культуре винограда. Предлагаемое изобретение обеспечивает повышение синтеза стильбенов в каллусной культуре винограда в 5-9 раз, а также повышение ростовой активности каллуса в 1,5-2 раза. Таким образом достигается стабильность производства стильбенов внутри клеток, что позволяет применять получаемую каллусную культуру в качестве источника стильбенов для промышленного производства. 3 пр.

Питательная среда для повышения синтеза стильбенов в каллусной культуре винограда, отличающаяся тем, что при выращивании каллусной культуры винограда применяется питательная среда состава, растворенного в 1 литре бидистиллированной воды: нитрат аммония - 350-450 мг/л; нитрат калия - 1,0-1,2 г/л; фосфат натрия - 150-200 мг/л; сульфат магния - 320-340 мг/л; нитрат кальция - 400-500 мг/л; хлорид кальция - 50-80 мг/л; сульфат железа - 27,8-30,0 мг/л; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты - 37,3-40,0 мг/л; борная кислота - 6,0-6,4 мг/л; сульфат марганца - 22,0-22,6 мг/л; сульфат цинка - 8,0-9,2 мг/л; йодид калия - 0,40-0,80 мг/л; натрий молибденокислый - 0,2-0,3 мг/л; сульфат меди - 0,02-0,03 мг/л; хлорид кобальта - 0,02-0,03 мг/л; миоинозит - 50-100 мг/л; тиамин - 0,2-0,5 мг/л; пиридоксин - 0,2-0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин - 1,5-2 мг/л; индолилмасляная кислота - 0,06-0,1 мг/л; сахароза - 20,0-30,0 г/л; агар - 5,5-6,5 г/л; пролин - 1,1-1,2 г/л; метилжасмонат - 1,12 мкл.