АНТИДОТ ОКИСИ УГЛЕРОДА И ГЕПАТОТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2016 года по МПК A61K31/315 A61K35/00 C07G1/00 C08H7/00 A61P39/02 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения и профилактики отравлений угарным газом (СО) и гепатотоксическими веществами, а также для лечения гипоксических состояний различной этиологии.

Известно использование ацизола для профилактики и лечения отравлений нейротоксическими веществами, в том числе СО, RU 2331417 C1, опубл. 20.08.2008.

Недостатком данного вещества является его низкая эффективность: индекс защиты составляет не более 1,7 при профилактическом введении препарата и не более 1,4 при его лечебном использовании. Кроме того, данный препарат обладает высокой токсичностью - летальная доза составляет 520 мг/кг веса тела животного (для лабораторных крыс).

Известен антидот окиси углерода в лекарственной форме 1 мл 6%-ного раствора ацизола в 0,5%-ном водном растворе новокаина, RU 2038079 C1, опубл. 27.06.1995.

Данному веществу свойственны те же недостатки, что и описанному выше аналогу.

Известно гепатопротекторное действие ацизола, RU 2331417 C1, но оно ограничивается лишь случаями повреждения печени узким кругом токсикантов, а именно продуктами горения древесины и полимеров.

В качестве прототипа настоящего изобретения принят антидот согласно патенту RU 2331417 С1.

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности препарата.

Согласно изобретению заявляемый антидот представляет собой аммиачно-цинковую соль (комплекс) растворимого окисленного лигнина с общей формулой

(C_xH_yO_z)_n(NH₃)_k(Zn)_m,

где x=14-16;

у=11-13;

z=5-7;

n=1,0-20;

k=1-30;

m=1-1,2.

Заявленное вещество получают следующим образом.

В плоскодонную колбу вместимостью 1 л помещают лигнин гидролизный хвойный (получаемый из древесины лиственницы, например, по ТУ 9291-251-04716345-2000, или ТУ 921-008-31931821-2004 СОРТ, или ТУ 64-11-05-87, или препарат полифепан) в количестве, соответствующем 22 г сухого лигнина, и приливают 250 мл водного раствора, содержащего 16 г едкого натра. Содержимое колбы нагревают до кипения и перемешивают 5 мин. Затем при 100°С при перемешивании, небольшими порциями по 1 мл с интервалом 1-2 мин добавляют в реакционную смесь 40 мл перекиси водорода 30%. Реакция сопровождается обильным пенообразованием, поэтому скорость прибавления перекиси водорода регулируют таким образом, чтобы уровень пены не превышал 2/3 объема колбы. После прибавления всего количества перекиси водорода перемешивают реакционную массу еще 15 мин при 100°С и затем охлаждают до комнатной температуры. Раствор темного цвета фильтруют от нерастворенных частиц, остаток на фильтре промывают 100 мл воды и присоединяют к основному фильтрату, после чего фильтрат подкисляют соляной кислотой до рН 1. Выделившийся осадок отфильтровывают и промывают 100 мл воды. Полученный сырой осадок очищают, растворяя в 300 мл воды с добавкой 10 мл аммиака 25% и подкисляя соляной кислотой. Осадок фильтруют, промывают водой и сушат на воздухе при 50°С. Получают 10.0 г субстанции в виде порошка темно-коричневого цвета. Элементный состав C_14-16H_11-13O_5-7n.

Полученную субстанцию помещают в стеклянный стакан вместимостью 300 мл, добавляют 80 мл воды и 14 мл аммиака 25%. Стакан помещают на магнитную мешалку и перемешивают при нагревании до 70°С. Осадок растворяется с образованием темного раствора с рН>9. После полного растворения субстанции раствор продолжают перемешивать при той же температуре, контролируя рН по универсальному индикатору. Когда раствор после улетучивания избытка аммиака приобретает рН, близкий к нейтральному (рН 7-8), к нему при перемешивании приливают раствор цинка ацетата дигидрата 3.30 г в 20 мл воды, а затем добавляют 10%-ный раствор уксусной кислоты для формирования осадка. После этого перемешивают смесь еще 1 ч и оставляют на 12 ч при комнатной температуре. Выделившийся темный осадок соли цинка отфильтровывают на фильтре Шотта и промывают водой. Отжатый осадок переносят на чашку Петри и подсушивают на воздухе при 40°С. Высохшую субстанцию растирают в фарфоровой ступке и полученный порошок вновь сушат на чашке Петри на воздухе при 40°С. Получают цинковую соль растворимого продукта окисления лигнина виде мелкокристаллического порошка угольно-черного цвета. Выход 10.19 г, что близко к теоретическому. Содержание цинка в полученном веществе составляет 8.81%.

5 г полученного вещества растворяют в 100 мл воды с добавкой 5 мл аммиака. Избыток аммиака отгоняют при нагревании, а оставшийся раствор с рН 7-8 замораживают и лиофилизируют. Получают 5.23 г заявленного вещества в виде пористой массы или порошка темно-коричневого цвета с содержанием цинка 8.40%.

Образцы с другим содержанием цинка получали аналогично.

Для решения поставленной задачи предпочтительны производные заявленного вещества, указанные в таблице 1.

Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых бы содержались сведения об идентичных технических решениях, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного изобретения условию патентоспособности «Новизна».

Как показывают приведенные ниже примеры, заявленное вещество обеспечивает важный технический результат, состоящий в значительном повышении эффективности лечения и профилактики отравлений угарным газом, газовыми смесями продуктов термодеструкции древесины, при отравлении веществами гепатотоксического действия, а также при лечении и профилактике гипоксических состояний. Кроме того, заявляемое вещество может быть эффективно при лечении язвенных состояний желудка.

Заявителем не выявлены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии признаков изобретения на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данного технического решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

Реализация изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Исследование защитного действия заявляемого вещества при отравлении продуктами горения осуществлялось на белых нелинейных крысах массой 180-200 г, возраст 13-14 недель. При исследовании антидотного действия при отравлении крыс угарным газом ингаляцию СО проводили в стандартной камере объемом 100 л с системой замкнутой циркуляции газов. Из баллона СО подавали в ингаляционную камеру с заданной скоростью в течение 4 минут, поддерживая заданные концентрации СО на уровне 100, 150 и 300 мг/м³. Концентрация СО контролировалась с помощью газового анализатора. Препарат сравнения (ацизол) и заявляемое вещество вводились за 20-25 минут до ингаляции внутрижелудочно. Ацизол вводили в виде водного раствора, а заявляемое вещество - в виде водно-крахмальной суспензии. Крысам третьей группы (контроль) вводили дистиллированную воду.

Каждая экспериментальная группа включала по 10 животных.

Защитный индекс антидота (коэффициент защиты) К определяли по формуле

К=ЛД_х/ЛД₅₀,

где ЛД_х - доза токсиканта, вызывающая гибель 50% животных в условиях применения антидота,

ЛД₅₀ - доза токсиканта, вызывающая гибель 50% животных без применения антидота.

Результаты исследований приведены в таблицах 2 и 3.

Клинические проявления:

Контроль. Через 60-90 секунд у животных наблюдалась одышка и атаксия, через 120-150 секунд появлялись судороги. Гибель всех животных наступала на 5-7 минуте.

Ацизол. Через 100-120 секунд наблюдалась одышка и небольшая атаксия, через 200-220 секунд появлялись судорожные подергивания, через 240 секунд наступала адинамия, часть животных погибла через 5 мин. Выжившие животные через 6-8 минут реагировали на раздражители. Через 17-22 минут признаки интоксикации у животных отсутствовали.

Заявляемое вещество. Через 140 секунд наблюдалась атаксия и одышка, через 180 секунд у животных появлялась гиподинамия, через 240 секунд у 5 из 10 животных наблюдалось боковое положение, через 8 минут все животные вышли из бокового положения. Через 11-13 минут признаки интоксикации у животных отсутствовали.

Таким образом, по уровню выживаемости и по данным наблюдения за экспериментальными животными в постинтоксикационный период можно сделать вывод, что при остром отравлении угарным газом заявленное вещество более эффективно, чем прототип.

Пример 2. Исследование антигипоксантной активности заявленного вещества в условиях гипобарической гипоксии

Антигипоксантное действие оценивали по продолжительности жизни крыс в барокамере в условиях разряжения воздуха, соответствующих 15000 м над уровнем моря. В эксперименте участвовало 5 групп по 10 животных. Первой группе крыс вводили ацизол в оптимальной дозе (50 мг/кг), трем другим группам - производные №1, №2 и №3 заявленного вещества в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг и 100 мг/кг соответственно, а пятая группа (контроль) получала дистиллированную воду. Препараты вводились внутрижелудочно за 30 минут до испытания.

Результаты изучения антигипоксантной активности веществ приведены в таблице 4.

Таким образом, производные №1 и №2 заявленного вещества существенно превосходят ацизол по антигипоксантному эффекту при гипобарической гипоксии, а производное №3 заявленного вещества по эффективности примерно равно ацизолу.

Пример 3. Исследование влияния заявленного препарата на биохимические и другие показатели адаптационного статуса животных в условиях хронической интоксикации газовой смесью продуктов термодеструкции древесины

Подопытные животные (крысы) на протяжении 15 суток подвергались ежедневно однократному ингаляционному воздействию субтоксичных концентраций газовой смеси продуктов термодеструкции древесины. Препарат вводили внутрижелудочно ежедневно через 30 минут после окончания затравки в дозе 50 мг/кг. В эксперименте участвовало 6 групп по 10 животных:

группа 1 - контроль, интактные здоровые животные;

группа 2 - животные, подвергавшиеся ингаляции газовой смесью;

группа 3 - животные, подвергавшиеся ингаляции газовой смесью в условиях защиты ацизолом;

группа 4, 5 и 6 - животные, подвергавшиеся ингаляции газовой смесью в условиях защиты производными №1, №2 и №3 заявленного вещества.

На 16-й день эксперимента у животных определяли биохимические показатели, характеризующие влияние препаратов на показатели антиоксидантной активности легких: весовой коэффициент легких ВКЛ (г/кг массы тела), содержания малонового диальдегида (МДА, нмоль/мг белка), аскорбиновой кислоты (АК, мкг/мг белка), восстановленного глутатиона (Г-SH, мкг/мг белка) в гомогенатах легких крыс (таблица 4). Эти показатели характеризуют сопротивляемость легких развитию отека (нарушению проницаемости легочных мембран) и оксидантному поражению паренхимы органа.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что защитный эффект у заявляемого вещества выражен в большей степени, чем у ацизола.

Параллельно с биохимическими исследованиями, для оценки влияния препаратов на полноту лечебно-профилактического эффекта со стороны основных органов-«мишеней» патологического воздействия продуктов горения, на 16-й день эксперимента определяли у животных физиологические показатели, такие как частота дыхания (ЧД), отношение вдоха к выдоху, характеризующее степень бронхообтурации, напряжение кислорода в крови (pO₂), показатели систолического артериального давления (АД), частоты сердечных сокращений (ЧСС), мышечной силы и показатели поведения (латентный период в тесте «открытого поля»), количество актов в тесте спонтанной двигательной активности (СДА). Эти показатели характеризуют состояние основных адаптационных систем организма, препятствующих возникновению и развитию патологических процессов. Также при осмотре оценивалось общее состояние животных.

Судя по данным показателям, защитный эффект у заявленного вещества выражен больше, чем у ацизола.

Пример 4. Изучение влияния веществ на физическую выносливость животных

Физическую выносливость оценивали по продолжительности принудительного плавания крыс с нагрузкой, составляющей 10% от веса животного. Тестирование проводилось в стеклянном бассейне цилиндрической формы с вертикальными стенками при температуре воды 20°С. Критерием утомления животного считали погружение ниже уровня воды, при котором оно в течение 10 секунд не может всплыть на поверхность. Крысы, набранные для эксперимента, предварительно проходили отбор и рандомизацию по группам таким образом, чтобы время плавания у каждой особи отличалось от среднего показателя в группе не более чем на 10%. Каждая экспериментальная группа включала по 12 животных. Препараты вводились внутрижелудочно. Результаты сравнивались с группой контрольных животных, получавших вместо препаратов дистиллированную воду.

Эффективность заявленного вещества по сравнению с ацизолом и контролем оценивали в режиме однократного и курсового введения препаратов. В первой методике препарат вводили однократно за 1 ч до тестирования, после чего проводили плавательный тест однократно. В случае курсового режима применения препараты в выбранной дозе (ацизол - 40 мг/кг, заявляемое вещество №1 - 50 мг/кг и №2 - 100 мг/кг) вводили ежедневно 1 раз в сутки на протяжении 7 суток. Тестирование проводили на следующий день после завершения курса, после чего еще раз вводили дозу препарата и через 1 ч повторно проводили плавательный тест.

Таким образом, заявляемое вещество в условиях данной модели заметно эффективнее, чем ацизол, увеличивает физическую выносливость крыс как при однократном, так и курсовом введении препаратов. Также по результатам теста повторного плавания, характеризующего способность препарата ускорять восстановление физической работоспособности после перенесенной нагрузки, заявляемое вещество имеет достоверное преимущество перед ацизолом.

Пример 5. Изучение гепатопротекторного действия заявленного вещества на модели токсического гепатита, вызванного CCl₄

Эксперимент был выполнен на 70 нелинейных крысах-самцах массой 250-270 г, в группе 1 было 20 животных, в остальных группах - по 10 животных.

Экспериментальным животным внутрижелудочно (в/ж) вводили CCl₄ в дозе 1,0 мл/кг в 50% растворе оливкового масла ежедневно в течение 5 дней через атравматический зонд. Через 5 дней наличие токсического гепатита подтверждалось по морфологической картине печени, биохимическим и функциональным показателям. Через 24 часа после последнего введения гепатотоксиканта оставшиеся в живых крысы были рандомизированы по массе и разделены на 6 опытных групп:

группа 1 - CCl₄ (n=20);

группа 2 - CCl₄ + ацизол в/ж 50 мг/кг (n=10);

группа 3 - CCl₄ + производное №1 в/ж 50 мг/кг (n=10);

группа 4 - CCl₄ + производное №2 в/ж 100 мг/кг (n=10);

группа 5 - CCl₄ + производное №3 в/ж 100 мг/кг (n=10);

группа 6 - интактная (n=10).

Заявленное вещество и ацизол вводили перорально в водном растворе ежедневно в течение 10 дней, группа контроля получала воду. Оценку биохимических показателей проводили на 11-й день эксперимента.

Для дифференциальной диагностики основных патологических синдромов определяли активность ферментов печеночного происхождения в сыворотке крови. Оценку степени выраженности цитолитического, холестатического и мезенхимально-воспалительного синдромов проводили с помощью стандартных биохимических методик. При исследовании уровня индикаторных ферментов цитолитического синдрома определяли активность глутатион-трансфераз (γ-ΓΤΦ), кислой фосфатазы (КФ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Экскреторную функцию печени оценивали также по содержанию билирубина и активности экскреционного фермента - маркера холестаза ЩФ. Содержание в крови липидов определяли по уровню холестерина и общих липидов, диспротеинемию - по уровню общего белка.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) и активность антиоксидантной системы печени оценивали по содержанию восстановленного глутатиона в печени, резерву сульфгидрильных групп в крови.

При проведении гексеналовой пробы крысам вводили внутрибрюшинно гексенал в дозе 80 мг/кг. Продолжительность наркоза животных позволяет оценить скорость метаболизма гексенала, осуществляемого микросомальными оксигеназами печени, и характеризует состояние антитоксической функции печени.

Кроме вышеперечисленных параметров об эффективности лечения судили по клинической картине и выживаемости животных.

Для изучения морфофункционального состояния печени крыс все подопытные животные подвергались патологоанатомическому вскрытию.

Эффективность препаратов оценивалась по нескольким группам показателей: морфометрическим, биохимическим и функциональным. Кроме этого, наблюдали клиническую картину интоксикации. У всех крыс, получавших CCl₄ без лечения, клиническая картина характеризовалась гиподинамией, заторможенностью, взъерошенностью шерсти и неопрятностью животных, кровоточивостью из носовых ходов, уменьшением потребления корма и снижением массы тела. Все выжившие животные были малоактивными, окраска шерсти приобретала желтушный оттенок.

Применение гепатопротекторов снижало смертность животных в группах и значительно улучшало общее состояние крыс, в то время как отсутствие лечения негативно сказывалось на выживаемости крыс. Перед гибелью у крыс наблюдали геморрагические высыпания вокруг носа, диарею и резкую потерю в весе.

Результаты по выживаемости на 15-й день приведены в таблице 8.

По результатам исследования (выживаемости, клинической картине, биохимическим и функциональным показателям), а также по результатам гистологического исследования можно сделать вывод, что после введения CCl₄ была сформирована модель тяжелой степени отравления.

Применение заявляемого вещества в большей степени, чем ацизол, увеличивало процент выживших животных, снижая при этом проявления интоксикации, что подтверждалось результатами морфометрических и биохимических (таблица 9) исследований.

Из представленных в таблице 9 данных видно, что у крыс после проведенной терапии достоверно уменьшались проявления цитолиза. Об этом свидетельствовало снижение степени активности индикаторных ферментов в сыворотке крови по отношению к активности этих ферментов в группе без лечения. Одновременно под действием исследуемых средств происходила коррекция синтетической и пигментообразующей функции печени, о чем говорило увеличение сывороточного содержания общего белка, общих липидов и снижение содержания общего билирубина.

Существенным звеном в патогенезе поражений печени является холестаз. О степени его выраженности судили по показателям холестерина, щелочной фосфатазе и уровню билирубина. Все производные заявленного вещества ослабляли холестаз, снижая активность ЩФ, гипербилирубинемию и гиперхолестеринемию.

Применение заявленного вещества сопровождалось восстановлением детоксикационной функции печени, что выражалось в достоверном сокращении длительности гексеналового сна. Параллельно с этим снижался отек печени и восстанавливалась первоначальная масса животных. Судя по полученным данным, лечение устраняло прооксидантное действие CCl₄, что выражалось в достоверном увеличении содержания сульфгидрильных групп и восстановленного глутатиона по сравнению с группой без лечения.

Таким образом, полученные данные по выживаемости, биохимическим показателям и клинической картине продемонстрировали в модели патологии печени, вызванной воздействием CCl₄, что заявляемое вещество превосходит ацизол по гепатопротекторной эффективности.

Пример 6. Изучение противоязвенного действия заявленного вещества на модели экспериментальной язвы желудка

С целью изучения влияния лечебного действия заявленного вещества при язве желудка была использована классическая экспериментальная модель ацетатной язвы, индуцированной введением в желудочную область 10%-ной уксусной кислоты. Эксперимент был выполнен на 50 нелинейных крысах-самцах массой 250-270 г. Для этого было сформировано 5 групп по 10 животных в каждой:

группа 1 - контроль (без лечения);

группа 2 - ацизол в/ж 50 мг/кг;

группа 3 - производное №1 в/ж 50 мг/кг;

группа 4 - производное №2 в/ж 50 мг/кг;

группа 5 - производное №3 в/ж 50 мг/кг.

Подопытным животным вводили ежедневно препараты на протяжении 21 суток в дозе 50 мг/кг. Оценку морфофункционального состояния слизистой оболочки желудка подопытных и контрольных животных проводили гистологическими исследованиями. Для этого пробы тканей из области язвенного поражения желудка, участков прилежащих к язве и участков, более отдаленных от язвы, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином, после чего определяли площадь повреждения.

Результаты оценки заживляющего действия заявленного вещества на язву желудка приведены в таблице 10.

Как видно, заявленные вещества обладают выраженным язвозаживляющим действием, значительно превосходя прототип (ацизол).

Гистологические исследования свидетельствуют, что на 7-е сутки все животные имеют поражение слизистой оболочки, включая подслизистую основу и мышечную оболочку желудка. При макроскопическом осмотре слизистой оболочки желудка отмечается отечность, сглаженность рельефа, гиперемия, пылевидные кровоизлияния, единичные эрозии. У контрольных животных в 100% случаях отмечались точечные кровоизлияния, эрозии. В случае животных, леченных заявленным веществом, выраженность этих дефектов значительно меньше, чем в случае лечения ацизолом. Наиболее быстро протекает заживление язвы в случае производных №2 и №3 заявленного вещества.

Пример 7. Изучение острой токсичности заявленного вещества в сравнении с ацизолом при внутрижелудочном введении крысам-самцам

Для этого заявленное вещество в дозах, кратных 100 мг, вводили соответствующим группам животных. Число животных в каждой группе составляло 5 особей. Все вещества вводили крысам в виде водного раствора. Количество павших животных оценивали на третьи сутки после введения веществ. На основе этих данных рассчитывали среднесмертельную дозу ЛД-50, вызывающую гибель 50% животных. Результаты исследования приведены в таблице 11.

Полученные результаты свидетельствуют, что острая токсичность заявляемого вещества в 3,7-10,9 раз ниже, чем у ацизола.

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии, и описывает антидот окиси углерода и гепатотоксических веществ. Антидот представляет собой аммиачно-цинковую соль растворимого окисленного лигнина с общей формулой (C_xH_yO_z)_n(NH₃)_k(Zn)_m, где х=14-16; у=11-13; z=5-7; n=1,0-20; k=1-30; m=1-1,2. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения и профилактики отравлений угарным газом (СО) и гепатотоксическими веществами и может быть использовано для лечения гипоксических состояний различной этиологии. 7 пр., 11 табл.

Антидот окиси углерода и гепатотоксических веществ, представляющий собой аммиачно-цинковую соль растворимого окисленного лигнина с общей формулой
(C_xH_yO_z)_n(NH₃)_k(Zn)_m,
где х=14-16;
y=11-13;
z=5-7;
n=1,0-20;
k=1-30;
m=1-1,2.