КОМПОЗИЦИЯ ДЕТЕКТИРУЮЩИХ АГЕНТОВ ДЛЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК A61K31/519 A61K31/505 A61K31/495 A61K31/5415 A61K31/70 A61K31/19 G01N21/78 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к композиции детектирующих агентов, в частности к композиции детектирующих агентов для эпителиальных опухолевых клеток, основанной на изменении цвета. Изобретение также относится к способу получения композиции детектирующих агентов и набору, включающему композицию детектирующих агентов.

Уровень техники

В настоящее время способы прижизненного окрашивания человеческих эпителиальных опухолевых клеток в основном включают способы, основанные на тесте на ацетопобеление, йодном тесте, тесте с толуидиновым синим, на окрашивании метиленовым синим, окрашивании гематоксилином и т.п.

В частности, в тесте на ацетопобеление смазывают цервикальную/вагинальную эпителиальную ткань раствором уксусной кислоты, например 3~5% раствором уксусной кислоты, и наблюдают, после ожидания в течение некоторого времени, имеется ли на смазанной эпителиальной ткани какой-либо ацетобелый реагирующий участок. Если какой-либо ацетобелый участок имеется, такая эпителиальная ткань предположительно содержит опухолевые клетки. Однако хотя такой метод имеет высокую чувствительность, его специфичность недостаточна, поскольку кроме опухолевых клеток некоторые воспалительные клетки также могут вызывать ацетопобеление, давая, таким образом, ложные положительные результаты. Кроме того, специфичность такого способа сильно зависит от уровня квалификации и опыта оператора.

Механизм йодного теста представляет собой взаимодействие с гликогеном. Он включает смазывание эпителиальных тканей шейки матки раствором Люголя и детекцию путем наблюдения окрашенных йодом эпителиальных клеток, при этом нормальный эпителий становится красно-коричневым или черным, в то время как анормальный эпителий становится густо-горчично-желтым или желтовато-коричневым. Однако если имеется воспаление эпителия, такие области могут не окрашиваться йодом или показывать бесцветную нагрузку. Следовательно, йодный тест имеет плохую специфичность в отношении окрашивания эпителиальных клеток^[1].

Способы с применением толуидинового синего могут вызывать окрашивание обломков ядер нейтрофилов и бактерий, что приводит к высокой ложной положительной оценке. Также трудно окрашивать раковые клетки и лейкоплакию с поверхностной кератинизацией, которая имеет тенденцию вызывать ложный отрицательный результат^[2].

После окрашивания эпителиальных тканей гематоксилином для наблюдения необходим микроскоп с большим увеличением и сложным управлением и высокими требованиями к компетентности и опыту оператора, а также длительное время проверки.

Сродство между метиленовым синим и раковыми клетками делает злокачественные ткани склонными к синему окрашиванию. Сообщается, что его использование для in situ отбора биопсийных проб эпителиальных тканей пищевода имеет эффект улучшения положительной оценки биопсии^[3]. Однако в данной области техники не сообщается о комбинации изменения цвета при окислительно-восстановительной реакции метиленового синего с фолиевой кислотой или комплексом фолиевой кислоты таким образом, чтобы быстро найти и обнаружить эпителиальные опухолевые клетки с помощью окрашивания и реакции с изменением цвета.

Композиция для детекции эпителиальных опухолевых клеток, в частности опухолевых клеток цервикальной/вагинальной эпителиальной ткани, путем окрашивания и изменения цвета, которая имеет высокую чувствительность, высокую специфичность и является простой и быстрой в действии, крайне необходима в данной области техники.

Раскрытие изобретения

Автор изобретения обнаружил, что анормальные эпителиальные ткани могут быть быстро и четко окрашены специфически за счет связывания фолиевой кислоты и/или комплекса фолиевой кислоты с избыточно экспрессированным рецептором фолиевой кислоты в опухолевых клетках, эндоцитоза и изменения цвета метиленового синего в окислительно-восстановительной реакции с фазой восстановления метиленового синего, участвующего в окислительно-восстановительной системе опухолевых клеток, причем посредством этого их отличают от нормальных тканей, и за счет изменения цвета композиции по изобретению быстро становится видно, являются ли испытываемые клетки ткани опухолевыми клетками, причем посредством этого обеспечивается быстрое, простое, точное и чувствительное установление местонахождения и детекция анормальных эпителиальных тканей и тем самым завершается изобретение. Композиция детектирующих агентов по изобретению имеет высокую чувствительность, высокую специфичность, проста в работе и имеет короткое время проверки, и оператор не нуждается в технической подготовке. Кроме того, метиленовый синий как агент, широко применяемый в клинической практике, имеет то преимущество, что он эффективен, безопасен, дешев и легко доступен, позволяя тем самым композиции и способу по изобретению также обладать такими преимуществами.

Следовательно, изобретение относится к композиции детектирующих агентов, включающей следующие компоненты (в мас. %):

фолиевая кислота 0-5 комплексы фолиевой кислоты 0-10 метиленовый синий 0,01-5 углеводный восстановитель 0,1-10 уксусная кислота 2-6 вода 3-95

В предпочтительном воплощении вышеуказанной композиции детектирующих агентов количество фолиевой кислоты предпочтительно составляет 0-4,5%, предпочтительнее 0-1%.

В другом предпочтительном воплощении количество комплекса фолиевой кислоты предпочтительно составляет 0-8%, предпочтительнее 0-1%.

В еще одном предпочтительном воплощении количество метиленового синего предпочтительно составляет 0,05-4,5%, предпочтительнее 0,05-0,5%.

В еще одном предпочтительном воплощении количество уксусной кислоты составляет предпочтительно 3-5%.

Углеводный восстановитель, используемый в композиции детектирующих агентов по изобретению, включает различные углеводы и их производные, предпочтительно глюкозу, фруктозу, галактозу, гексозу, лактозу, мальтозу и их производные и т.п.

Другой аспект изобретения относится к способу получения детектирующего агента по изобретению, включающему или состоящему из следующих стадий, по порядку:

(a) растворение фолиевой кислоты и/или комплекса фолиевой кислоты в водном растворителе в вышеуказанных мас. % с образованием раствора,

(b) добавление, перемешивание и растворение метиленового синего в растворе (а) в вышеуказанных мас. %,

(c) добавление углеводного восстановителя в раствор (b) в вышеуказанных мас. %,

(d) перемешивание раствора, полученного на стадии (с), в течение 30 минут,

(e) добавление, перемешивание и растворение уксусной кислоты в растворе (d) в вышеуказанных мас. %, и

все вышеуказанные стадии проводят при нормальных температуре и давлении.

В предпочтительном аспекте детектирующий агент по изобретению или детектирующий агент, полученный способом по изобретению, применяют для детекции эпителиальных опухолевых клеток.

Изобретение также относится к способу детекции поражения эпителиальной ткани, включающему:

(a) нанесение агентов по изобретению, детектирующих живые клетки, на поверхность эпителиальной ткани субъекта с помощью носителя;

(b) наблюдение за изменением цвета на носителе; и

(c) определение по изменению цвета, имеется ли поражение в испытываемой эпителиальной ткани.

В предпочтительном воплощении способ детекции поражения эпителиальной ткани также включает:

(d) наблюдение за тем, вызывается ли реакция ацетопобеления на участке поверхности эпителиальной ткани, на которую нанесен детектирующий живые клетки агент по изобретению.

В предпочтительном воплощении в способе детекции поражения эпителиальной ткани в соответствии с изобретением наблюдение на стадии (b) выполняют визуально.

В предпочтительном воплощении в способе детекции поражения эпителиальной ткани в соответствии с изобретением наблюдение и определение на стадиях (b) и (с) проводят, основываясь на следующих стандартах: отсутствие изменения цвета носителя указывает на отсутствие поражения эпителиальной ткани; изменение цвета носителя на светло-голубовато-зеленый указывает на отсутствие анормального поражения эпителиальной ткани; изменение цвета носителя на темно-голубовато-зеленый/черновато-зеленый/пурпурно-черный указывает на анормальное поражение эпителиальной ткани. Кроме того, если цвет носителя изменяется на черновато-зеленый/пурпурно-черный, с согласия пациента, если наблюдение за пациентом не может быть обеспечено, для проверки на патологию может быть отобран с помощью биопсии образец участка в эпителиальной ткани с реакцией ацетопобеления.

В предпочтительном воплощении анормальное поражение представляет собой новообразование (≥CIN II) и канцерогенез внутри эпителиальной ткани.

Композиция детектирующих агентов для эпителиальных опухолевых клеток по изобретению может быть введена с использованием различных способов. Способы введения включают смазывание и другие способы. Введение может быть выполнено с использованием носителя, который включает, без ограничений, впитывающие ватные тампоны, марлю, микрокапсулы, целлюлозные мембраны, фильтровальную бумагу, наноматериалы, аэрогель и т.п.

Композиция детектирующих агентов для эпителиальных опухолевых клеток по изобретению может быть введена в эпителиальные ткани различных мест, которые включают, но не ограничиваются указанным, эпителиальные ткани шейки матки, влагалища, ротовой полости, пищевода, эпителиальные ткани желудочно-кишечного тракта и т.п.

Все проценты, включенные в изобретение, являются массовыми процентами, если не указано иное.

Осуществление изобретения

В клинических исследованиях показано, что рецепторы фолиевой кислоты избыточно экспрессируются на поверхности большинства опухолевых клеток, в то время как в нормальных клетках они присутствуют только в небольшом количестве. Следовательно, фолиевая кислота и комплексы фолиевой кислоты (производные фолиевой кислоты) могут служить в качестве опухолеспецифических таргетинговых молекул для диагностики и лечения онкозаболеваний^{[4, 5]}.

В изобретении термин «комплекс фолиевой кислоты» определяется как комплекс, образованный при связывании молекулы фолиевой кислоты с одним или с несколькими другими компонентами, при этом карбоксильная группа фолиевой кислоты связывается с одним или несколькими другими компонентами путем присоединения или сопряжения. Один или несколько других компонентов могут представлять собой, например, лекарственные средства, радионуклиды, красители, гены, проявляющие вещества и т.п. Примерами комплекса фолиевой кислоты являются комплекс фолиевая кислота-митомицин и комплекс фолиевая кислота-DTPA и т.п. В композиции и способе по изобретению фолиевая кислота и/или комплекс фолиевой кислоты могут быть введены одновременно или могут быть применены по отдельности. Комплекс фолиевой кислоты, используемый в композиции детектирующих агентов, описанной в изобретении, включает конъюгаты фолиевой кислоты, образованные путем присоединения различных низкомолекулярных соединений к фолиевой кислоте, которые включают, но не ограничиваются указанным, конъюгаты фолиевая кислота-γ-цистеин, (R)-2-(2-(R)-3,4-дигидрокси-5-карбонил-2,5-дигидрофуран)-2-гидроксиэтил-4-(6-(2-амино-4-карбонил-3,4-дигидроптеридин)метиламино)бензоат и т.п.

Количество фолиевой кислоты в композиции по изобретению составляет 0-5 мас. %, предпочтительно 0-4,5 мас. %, 0-4 мас. %, 0-3,5 мас. %, 0-3 мас. %, 0-2,5 мас. %, 0-2 мас. %, 0-1,5 мас. %, предпочтительнее 0-1 мас. %. Количество комплекса фолиевой кислоты в композиции по изобретению составляет 0-10 мас. %, предпочтительно 0-8 мас. %, 0-7 мас. %, 0-6 мас. %, 0-5 мас. %, 0-4 мас. %, 0-3 мас. %, 0-2 мас. %, предпочтительнее 0-1 мас. %.

Метиленовый синий представляет собой краситель, широко применяемый в клинической практике. Его механизм окрашивания и изменения цвета в первую очередь основан на различии в его цветах в окисленном состоянии и восстановленном состоянии. Конкретно, метиленовый синий в восстановленном состоянии бесцветный, в то время как водный раствор метиленового синего в окисленном состоянии показывает синий цвет. Кроме того, окисленный метиленовый синий, когда присутствует в композиции по изобретению, также может проявить голубовато-зеленый, черновато-зеленый (коричневато-зеленый) и пурпурно-черный цвет. Биологический краситель метиленовый синий имеет высокое сродство к раковым клеткам и меланину^[7], окислительно-восстановительное свойство которых вызывает различные изменения в цветовом спектре метиленового синего в окисленном и восстановленном состояниях опухолевых тканей. Такие изменения цвета могут быть непосредственно идентифицированы быстрым визуальным наблюдением.

Вообще антиокислительная способность опухолевых тканей значительно усиливается по сравнению с нормальными тканями. Однако значительный окислительный стресс еще существует в таких опухолевых тканях^[6]. Окислительный стресс указывает на окислительное поражение ткани, которое представляет собой период скрытого патологического развития ткани. Хотя восстановительное свойство опухолевых клеток усиливается, их окислительно-восстановительный баланс по-прежнему склонен к окислению, если опухолевые клетки не находятся в состоянии апоптоза или в заторможенном состоянии. Поэтому во внутриклеточной среде таких живых клеток метиленовый синий в композиции по изобретению окисляется, показывая зеленый, голубовато-зеленый, черновато-зеленый и пурпурно-черный цвет окисленного состояния.

В композиции по изобретению комплекс фолиевой кислоты и небольшое количество фолиевой кислоты могут образовывать с метиленовым синим комплекс фолиевая кислота-метиленовый синий. Из-за связывания между молекулой фолиевой кислоты и рецептором фолиевой кислоты, избыточно экспрессированным на поверхности опухолевых клеток, комплекс фолиевая кислота-метиленовый синий может легче проникнуть в клетки при содействии уксусной кислоты и высвободить метиленовый синий в восстановленном состоянии. Кроме того, в опухолевых клетках при окислительном стрессе метиленовый синий быстро окисляется и таким образом генерирует изменение цвета. При различной степени злокачественности опухоли метиленовый синий изменяет цвет на темно-голубовато-зеленый, черновато-зеленый и пурпурно-черный, в то время как при наличии воспалительного поражения, разрастания по типу «цветной капусты» (заражение вирусом HPV) или поражения CIN I цвет метиленового синего зеленый или светло-голубовато-зеленый.

Термин «углеводный восстановитель» в изобретении относится к любому редуцирующему углеводу, его производным или их комбинациям. Углевод включает, но не ограничивается указанным, моносахарид, дисахарид или полисахарид. Конкрентно углеводный восстановитель может представлять собой глюкозу, фруктозу, галактозу, гексозу, лактозу, мальтозу и т.п. «Производное углевода», описанное в изобретении, определяется как производные, такие как полисахарид, гликопротеин, органическая кислота и т.п., образованные полимеризацией, этерификацией, окислением и т.п. углеводов. Количество углеводного восстановителя в композиции и способе по изобретению составляет 0,1-10%, предпочтительно 0,3-8%, 0,1-3% и 0,05-1%.

Углеводный восстановитель в композиции и способе по изобретению восстанавливает метиленовый синий в окисленном состоянии до бесцветного метиленового синего в восстановленном состоянии. Фолиевая кислота и/или комплекс фолиевой кислоты связываются с рецептором фолиевой кислоты на поверхности опухолевой клетки. В кислой среде с рН 5,0-5,5 фолиевая кислота и/или комплекс фолиевой кислоты опосредует интернализацию и высвобождение метиленового синего в восстановленном состоянии в цитозоль. Метиленовый синий в восстановленном состоянии участвует в окислительном стрессе опухолевых тканей. Метиленовый синий в восстановленном состоянии переходит в окислительное состояние. Между тем осмотическое давление внутриклеточной жидкости увеличивается, заставляя метиленовый синий в окисленном состоянии высвобождаться из клеток и немедленно показывать различные изменения цвета. Такой высвободившийся метиленовый синий может присоединиться к носителю для введения по изобретению, тем самым сразу же заставляя композицию на носителе показывать изменение цвета. Конкретно цвет композиции меняется от светло-желтовато-коричневого до темно-голубовато-зеленого, черновато-зеленого и пурпурно-черного. Между тем опухолевые клетки имеют увеличенные ядра и повышенное содержание ядерного белка, которые осаждаются и коагулируются уксусной кислотой, вызывая переходный ответ, при котором анормальная эпителиальная ткань видна как ацетобелый чувствительный участок, который может обеспечить установление местоположения для отбора патологического образца анормальной эпителиальной ткани.

Термин «уксусная кислота», используемый в изобретении, обозначает этановую кислоту. Композиция по изобретению включает 2-6 мас. % уксусной кислоты. Уксусная кислота, используемая в композиции по изобретению и в способе ее получения, обеспечивает кислотный рН, предпочтительно рН 5,0-5,5. Кроме того, использование уксусной кислоты помогает композиции по изобретению быстро проникать в клетку, таким образом взаимодействуя с содержимым клетки так, что способствует развитию окраски. Кроме того, как упоминалось выше, после того как метиленовый синий - компонент, который используют для демонстрации изменения цвета, высвобождается из клетки, реакция ацетопобеления, вызываемая уксусной кислотой на анормальной эпителиальной ткани, дополнительно обеспечивает основу для установления местоположения анормальной эпителиальной ткани.

Клетки, которые могут быть окрашены композицией по изобретению, представляют собой опухолевые клетки, предпочтительно эпителиальные опухолевые клетки. Указанные эпителиальные ткани включают, но не ограничивается указанным, эпителий шейки матки, эпителий влагалища, эпителий желудочно-кишечного тракта, эпителий ротовой полости и т.п. Такие клетки могут поступать из образцов биопсии ткани.

Клетки по изобретению могут быть получены от субъектов-млекопитающих, указанные млекопитающие включают человека, но не ограничиваются им.

Изобретение дополнительно иллюстрируется приведенными ниже примерами и сравнительными примерами. В нижеследующих примерах и сравнительных примерах в качестве объекта для проверки используют эпителиальную ткань шейки матки, и результаты проверки на патологию тканей шейки матки используют в качестве стандарта для сравнения, чувствительность используют для иллюстрации степени детекции детектирующего агента: чем выше чувствительность, тем сильнее способность к обнаружению анормальной эпителиальной ткани; и специфичность используют для иллюстрации точности детектирующего агента: чем выше специфичность, тем выше соответствие между обнаруженной анормальной эпителиальной тканью и результатами проверки на патологию.

В изобретении чувствительность и специфичность определяют и вычисляют следующим образом:

Чувствительность = число истинно положительных результатов/(число истинно положительных результатов + число ложноотрицательных результатов)·100%,

Специфичность = число истинно отрицательных результатов/(число истинно отрицательных результатов + число ложноположительных результатов)·100%.

Пример 1

При нормальных температуре и давлении каждый их различных компонентов, определенных в приведенной ниже таблице 1, растворяют по отдельности в водном растворителе, к раствору добавляют биологический детектирующий агент метиленовый синий, перемешивают и растворяют с последующим добавлением глюкозы как восстановителя и перемешиванием в течение 30 минут, затем добавляют аналитически чистую уксусную кислоту, перемешивают, смешивают и получают композицию детектирующих агентов. В композицию детектирующих агентов погружают большой тампон и композицию наносят мазком на эпителиальную ткань шейки матки. Тампон немедленно извлекают и сразу наблюдают изменение цвета тампона. Если цвет тампона светло-желтовато-коричневый, это указывает на отсутствие поражения эпителиальной ткани; если цвет тампона светло-голубовато-зеленый, это указывает на воспалительное поражение, разрастание по типу «цветной капусты» (заражение вирусом HPV) или поражение CIN I; если цвет тампона темно-голубовато-зеленый, черновато-зеленый и пурпурно-черный, это указывает на наличие анормального поражения CIN II или выше. Между тем рекомендуется кольпоскопия для отбора живых тканей из нескольких мест для гистопатологического исследования, и затем проверяют чувствительность и специфичность детектирующего агента с использованием результатов гистопатологического тестирования в качестве стандарта. Результаты тестирования приводятся в таблице 1.

Пример 2

Повторяют способ примера 1 с использованием различных компонентов, количества которых указаны в следующей далее таблице 1, за исключением того, что вместо фолиевой кислоты используют комплекс фолиевой кислоты фолиевая кислота-γ-цистеин. Результаты тестирования приводятся в таблице 1.

Пример 3

Повторяют способ примера 1 с использованием различных компонентов, количества которых указаны в следующей далее таблице 1, за исключением того, что в водном растворителе совместно растворяют фолиевую кислоту и комплекс фолиевой кислоты и (R)-2-(2-(R)-3,4-дигидрокси-5-карбонил-2,5-дигидрофуран)-2-гидроксиэтил-4-(6-(2-амино-4-карбонил-3,4-дигидроптеридин)метиламино)бензоата. Результаты тестирования приводятся в таблице 1.

Пример 4

Повторяют способ примера 1 с использованием различных компонентов, количества которых указаны в следующей далее таблице 1, за исключением того, что в водном растворителе совместно растворяют фолиевую кислоту и комплекс фолиевой кислоты и (R)-2-(2-(R)-3,4-дигидрокси-5-карбонил-2,5-дигидрофуран)-2-гидроксиэтил-4-(6-(2-амино-4-карбонил-3,4-дигидроптеридин)метиламино)бензоата и вместо восстановителя глюкозы используют восстановитель производное гексозы. Результаты тестирования приводятся в таблице 1.

Сравнительный пример 1

При нормальных температуре и давлении в 95 мл дистиллированной воды при перемешивании добавляют 5 мл уксусной кислоты и получают 5% раствор уксусной кислоты. В раствор погружают большой ватный тампон и раствор наносят мазком на эпителиальную ткань шейки матки. После ожидания в течение одной минуты наблюдают наличие или отсутствие ацетобелого участка на эпителиальной ткани вблизи границы плоскоклеточной колонки шейки матки и осматривают ее границу, толщину, цвет и наблюдают время ответа. Если имеется ацетобелый участок с четкой границей, это указывает на повреждение CIN I или выше. Проводят кольпоскопию для отбора живых тканей из нескольких мест для гистопатологического исследования и затем проверяют чувствительность и специфичность 5% раствора уксусной кислоты, используя результаты гистопатологического тестирования в качестве стандарта. Результаты тестирования приводятся в таблице 1.

Сравнительный пример 2

При нормальных температуре и давлении 10 г йодида калия растворяют в 100 мл дистиллированной воды, к раствору добавляют 5 г йода, перемешивают и растворяют и получают йодный раствор Люголя. В раствор погружают большой ватный тампон и раствор наносят мазком на эпителиальную ткань шейки матки и наблюдают, окрашивается ли эпителиальная ткань йодом. Нормальный эпителий показывает красновато-коричневый или черный цвет, в то время как анормальный эпителий показывает густо-горчично-желтый или желтовато-коричневый цвет. Проводят кольпоскопию для отбора живых тканей из нескольких мест для гистопатологического исследования и затем проверяют чувствительность и специфичность йодного раствора Люголя с использованием результатов гистопатологического тестирования в качестве стандарта. Результаты тестирования приводятся в таблице 1.

Из приведенной выше таблицы 1 можно видеть, что все примеры с применением композиции детектирующих агентов по настоящему изобретению имеют значительные преимущества по чувствительности и специфичности по сравнению с детектирующими агентами в сравнительных примерах, что указывает, что композиция по изобретению может быть чувствительной и может специфически использоваться для детекции анормальной эпителиальной ткани.

Литература

1. Qiao Youlin, Zhang Wenhua, Zhao Fanghui, Pan Qinjing, Li Ling, "Screen, Early Diagnosis, and Early Treatment Solutions for Cervical Cancer", July, 2003.

2. Mashberg A., J. Amer. Dent. Assoc., 1983, 106-112.

3. Canto M.I., Setrakian S., Willis J. et al., Methylene blue-directed biopsies improve detection intestinal metaplasia and dysplasia in Barrett′s esophagus [J]. Gastrointest. Endosc., 2000, 5:560.

4. Zhao X.B., Lee R.J., Tumor-selective targeted delivery of genes and antisen seo ligo deoxyribonuc leo tides via the folate receptor [J]. Adv. Drug Deliv. Rev., 2004, 56(8): 191-193.

5. Reddy J.A., Allagadda Vm., Leamon C.P., Targeting therapeutic and imaging agents to folate receptor positive tumors [J]. Current Pham. Biotech., 2005, 6, 131-150.

6. Wu Chenheng, "Oxidative and Reductive States of Malignant Tumor Tissues: First Exploration of the Relation between Change of Antioxidation Capacity and Apoptosis and Mechanism Therefore", April 26, 2005.

7. Link E.M., Blower P.J., Costa D.C. et al,, Early detection of melanoma metastases with radioiodinated methylene blue [J]. Eur. J. Nuclear Med., 1998, 25(9): 1322.

8. Leamon C.P., Deprince R.B., Hendren R.W., Folate-mediated drug delivery: effect of alternative conjugation chemistry [J]. Drug Target., 1999, 7: 157-169.

9. Leamon C.P., Cooper S.R., Hardee G.E., Folate-liposome-mediated antisense oligodeoxynucleotide targeting to cancer cells: evaluation in vitro and vivo [J]. Bioconjug. Chem., 2003, 14: 738-747.

Изобретение относится к композиции детектирующих агентов для живых клеток, в частности для эпителиальных опухолевых клеток; композиция содержит 0-5% фолиевой кислоты, 0-10% комплекса фолиевой кислоты, 0,01-5% метиленового синего, 0,1-10% углеводного восстановителя, 2-6% уксусной кислоты и 3-95% воды. Также настоящее изобретение относится к способу получения композиции детектирующих агентов и наборам, содержащим композицию детектирующих агентов. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.

1. Композиция детектирующих агентов, включающая следующие компоненты, мас. %:
фолиевая кислота 0-5% комплекс фолиевой кислоты 0-10% метиленовый синий 0,01-5% углеводный восстановитель 0,1-10% уксусная кислота 2-6% вода 3-95%

и в которой количество фолиевой кислоты и/или комплекса фолиевой кислоты не равно 0.

2. Композиция по п. 1, в которой количество фолиевой кислоты составляет 0-4,5%, предпочтительно 0-1%.

3. Композиция по п. 1 или 2, в которой количество комплекса фолиевой кислоты составляет 0-8%, предпочтительно 0-1%.

4. Композиция по п. 3, в которой количество комплекса фолиевой кислоты составляет 0-8%, предпочтительно 0-1%.

5. Композиция по пп. 1, 2 или 4, в которой количество метиленового синего составляет 0,05-4,5%, предпочтительно, 0,05-0,5%.

6. Композиция по п. 3, в которой количество метиленового синего составляет 0,05-4,5%, предпочтительно 0,05-0,5%.

7. Композиция по пп. 1, 2, 4 или 6, в которой углеводный восстановитель выбирают из углеводов и их производных.

8. Композиция по п. 3, в которой углеводный восстановитель выбирают из углеводов и их производных.

9. Композиция по п. 5, в которой углеводный восстановитель выбирают из углеводов и их производных.

10. Композиция по п. 7, в которой углеводный восстановитель выбирают из глюкозы, фруктозы, галактозы, гексозы, лактозы, мальтозы и их производных.

11. Композиция по п. 8 или 9, в которой углеводный восстановитель выбирают из глюкозы, фруктозы, галактозы, гексозы, лактозы, мальтозы и их производных.

12. Композиция по любому из пп. 1, 2, 4, 6, 8, 9 или 10, в которой количество уксусной кислоты составляет 3-5%.

13. Композиция по п. 3, в которой количество уксусной кислоты составляет 3-5%.

14. Композиция по п. 5, в которой количество уксусной кислоты составляет 3-5%.

15. Композиция по п. 7, в которой количество уксусной кислоты составляет 3-5%.

16. Композиция по п. 11, в которой количество уксусной кислоты составляет 3-5%.

17. Способ получения композиции детектирующих агентов по любому из пп. 1-16, характеризующийся тем, что включает следующие стадии:
(a) растворение фолиевой кислоты и/или комплекса фолиевой кислоты в водном растворителе;
(b) добавление, перемешивание и растворение метиленового синего в вышеуказанном растворе;
(c) добавление в раствор углеводного восстановителя;
(d)) перемешивание раствора в течение 30 минут;
(e) добавление уксусной кислоты при перемешивании,
причем все вышеуказанные стадии проводят при нормальной температуре и давлении.

18. Набор для детекции эпителиальных опухолевых клеток, включающий композицию детектирующих агентов по любому из пп. 1-16 и, при необходимости, носитель, предпочтительно, носитель выбирают из впитывающих ватных тампонов, марли, микрокапсул, целлюлозных мембран, фильтровальной бумаги, наноматериалов и аэрогеля.

19. Композиция детектирующих агентов по п. 1, в которой комплекс фолиевой кислоты представляет собой комплекс фолиевая кислота - γ-цистеин, (R)-2-(2-(R)-3,4-дигидрокси-5-карбонил-2,5-дигидрофуран)-2-гидроксиэтил-4-(6-(2-амино-4-карбонил-3,4-дигидроптеридин)метиламино)бензоат.

20. Способ по п. 17, в котором комплекс фолиевой кислоты представляет собой комплекс фолиевая кислота - γ-цистеин, (R)-2-(2-(R)-3,4-дигидрокси-5-карбонил-2,5-дигидрофуран)-2-гидроксиэтил-4-(6-(2-амино-4-карбонил-3,4-дигидроптеридин)метиламино)бензоат.

21. Набор по п. 18, в котором комплекс фолиевой кислоты представляет собой комплекс фолиевая кислота - γ-цистеин, (R)-2-(2-(R)-3,4-дигидрокси-5-карбонил-2,5-дигидрофуран)-2-гидроксиэтил-4-(6-(2-амино-4-карбонил-3,4-дигидроптеридин)метиламино)бензоат.