ЛЕВОВРАЩАЮЩИЕ ИЗОВАЛЕРИЛ-СПИРАМИЦИНЫ 1, II, III, ИХ ПРЕПАРАТЫ, СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И УПОТРЕБЛЕНИЕ Российский патент 2016 года по МПК C07H17/08 A61K31/7048 A61P31/04 A61P31/10 C12P19/62 

Техническая область

Изобретение относится к новым макролидным антибиотикам в генной инженерии, и особенно левовращающим изовалерил-спирамицинам I, II, III, их кристаллам, их фармацевтическим препаратам, способам приготовления и их употреблению в противоинфекционных средствах.

Техническая среда

Макролидные антибиотики занимают важное место в клинике, обладают хорошей активностью в отношении грамположительных бактерий и микоплазмы, также действуют на грамотрицательные бактерии, обладают благоприятной антибактериальной активностью и проницаемостью тканей в отношении распространяющихся токсоплазмов, легионелл и других трудно контролируемых возбудителей, при пероральном употреблении быстро поглощаются с редкими неблагоприятными действиями, в принципе не оказывают отрицательное воздействие на функцию печени и почки, обладают также потенциальной иммунологической регуляцией, в девяностых годах прошлого года считались соперником β-лактамных препаратов при лечении инфекционных заболеваний дыхательных путей взрослых.

Хиральность (Chirality) - основное свойство трехмерных предметов, является одним из основных свойств природы. В качестве важной основы жизненной деятельности, почти все биологические макромолекулы, как протеин, полисахарид, нуклеиновая кислота, ферменты и т.д., хиральные, и эти макромолекулы, как правило, исполняют важную физиологическую функцию внутри тела. Под хиральными лекарствами (chiral drug) понимаются пары оптических антиподов, являющихся зеркальными отражениями друг друга и полученных после ввода хирального центра в молекулярную структуру лекарства. Эти оптические антиподы обладают принципиально аналогичными физико-химическими свойствами, отличаются только оптической активностью, откуда и выделились R (правовращающие) или S (левовращающие), рацемические. За последние 20 лет углубленные изучения в фармацептии доказали различную стереоспецифичность (stereoselectivity) антиподов лекарственных веществ, они имеют различный аффинитет с рецепторами, в результате чего сильно отличаются фармакологические свойства. Антиподы хиральных лекарств, имеющие повышенную активность, называют оптимальными антиподами (Eutomer); а антиподы, имеющие низкую активность или не имеющие активности, называют неактивными антиподами (Distomer). В большинстве случаев, неактивные антиподы не дают эффективности, но они еще частично нейтрализуют эффективность оптимальных антиподов, иногда даже вызывают серьезные токсичные и побочные реакции, что доказало сложность в разнице эффективности лекарственных средств и значительное отличие терапевтического индексантипод одного антипода от его рацемата, как всем известно, что терапевтическая эффективность синтомицина DL-(+-) составляет только половину хлорамфеникола D(-); а активность L-изомера пропранолола (propranolol) в 100 раз больше чем D-изомер; (-) метадон представляет собой сильное болеутоляющее средство, а (+) не действующее. Сильно отличается и токсичность, например, оба антипода талидомида (thalidomide) обладают аналогичным успокаивающим действием в отношении мышей, но только S(-) изомер и его метаболит обладают зародышевой токсичностью и тератогенезом; кетамин - широко распространенные наркотические и болеутоляющие средства, но они дают галлюцинацию и другие побочные действия. Изучения показали, что S(+) дает эффект в 3-4 раза больше R(-), а токсичные и побочные действия явно связаны с последним. Значительное различие в терапевтической эффективности хиральных лекарств стимулировало развитию работ по разработке, разделению и анализу хиральных лекарств. Применение техники «Хиральность» позволило удалять из лекарственных средств составы, не дающие эффекта или имеющие токсичные и побочные действия, производить чистые хиральные лекарственные вещества, имеющие структуру с одним направлением, что позволило повышать чистоту состава препарата, быстро проявлять терапевтическую эффективность и сокращать курс лечения. В связи с этим, разработка хиральных лекарств стала одним из новых направлений в разработке новых лекарственных средств мира. Правительства и крупные фармацевтические фирмы начали вносить большие средства в разработку хиральных лекарственных препаратов, хирального сырья и хиральных интермедиатов, чтобы завоевать фармацевтический рынок мира хиральных лекарственных веществ. Более того, с непрерывным улучшением хиральной технологии и быстрым распространением жидкостной хроматографии была продвинута работа по разделению, анализу и определению антиподов хиральных лекарств. Хиральные моноэнантиомерные средства получили широкое применение. Карримицин (Carrimycin) - дериват спирамицина нового поколения, разработанный с помощью генной инженерии, носил первоначальное название «Biotechspiramycin», также биотехмицин, Biotechmycin [патент №: ZL97104440.6]. Согласно «Принципу выбора названий лекарственных препаратов Китая» в результате технической проверки и изучения Государственной фармакопейной комиссией Китая было принято решение переименовать Biotechspiramycin в Карримицин (Carrimycin), название на английском языке «Carrimycin». С точки зрения химической структуры основным составом Карримицин (Carrimycin) является 4″-изовалерил-спирамицин, включающий 4″-изовалерил-спирамицины I, II, III, кроме этого, Карримицин (Carrimycin) содержит и примерно 6 видов спирамицином с ацилированной 4-оксигруппой, поэтому он носит общее химическое название «4"-ацилированный спирамицин».

Химическая структура основного состава Карримицин (Carrimycin) показана на (1):

Где: P в изовалерил-спирамицине I выбирают из Ч;

P в изовалерил-спирамицине II выбирают из COCH₃;

R в изовалерил-спирамицине III выбирают из COCH₂CH₃.

Карримицин (Carrimycin) представляет собой шестнадцатичленные макролидные антибиотики, механизм действия заключается в сочетании с тельцем Паладе бактерий для ингибирования синтеза белков.

Результаты фармакокинетических исследований показали, что в Карримицине (Carrimycin) самыми активными составами являются изовалерил-спирамицины I, II, III. После поступления в организм карримицин (Carrimycin) быстро метаболирует с образованием спирамицина, расчет суммы AUC_0-t материнских средств изовалерил-спирамицинов I, II, III и активных метаболитов - спирамицинов I, II, III показал, что при пероральном применении абсолютная биодоступность составляет в среднем 91,6%. По источникам, абсолютная биодоступность спирамицина при пероральном применении для человека составляет в пределах 30-40% (Frydman AM et al. J Antimicrob Chemother. 1988, 22(suppl B):93-103). Чем доказано, что структура изовалерил-спирамицина в значительной степени улучшила биологическую доступность активного вещества - спирамицина. Разовый прием Карримицина (Carrimycin) медленно дает эффект, T_1/2 в пределах 23-27 ч

Результаты теста in vitro показали, что Карримицин (Carrimycin) хорошо воздействует на грамположительные бактерии, особенно некоторые лекарственно-устойчивые микробы (к примеру, золотистый стафилококк, стойкий к β-лактаму, золотистый стафилококк, стойкий к эритромицину и т.д.), не имеет заметной перекрестной устойчивости к подобным лекарственным средствам. Тем временем, обладает хорошей антибактериальной активностью в отношении микоплазмы и хламидии, части грамотрицательных бактерий, обладает благоприятной антибактериальной активностью и проницаемостью тканей в отношении токсоплазм, легионеллы, а также потенциальной иммунологической регуляцией. Антибактериальная активность внутри организма превосходит активность вне организма (ZL200310122420.9). Клинические исследования показали, что прием таблеток Карримицин (Carrimycin) в течение 5-7 дней по 200 мг-400 мг в день, дает положительные эффекты в лечении острого бактериального фарингита и острого гнойного тонзиллита, вызванного streptococcus pyogenes; бактериального хронического синусита и острого бронхита, вызванного сенситивными бактериями; не сильной пневмонии, вызванной пневмококком, гемофильной палочкой и микоплазмой пневмония; негонококкового уретрита, вызванного микоплазмой, хламидией; инфекции кожи и мягких тканей, периодонтита, тимпанита и других инфекционных болезней, вызванных сенситивными бактериями. Общий коэффициент полезного действия составляет 92,68%.

Клинические исследования показали, что Карримицин (Carrimycin) является безопасным и эффективным для перорального применения антибиотиком. Тем не менее Карримицин (Carrimycin) является многокомпонентным лекарственным средством, полученным в результате ферментации, его дальнейшее отделение и очистка оказывается очень трудно. В настоящее время создание высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет отделить образцы Карримицин (Carrimycin) от ацилированных спирамицинов, например, степень отделения изовалерил-спирамицин II от изобутирил-спирамицина III, степень отделения изобутирил-спирамицин II от пропионил-спирамицина III, степень отделения пропионил-спирамицина III от его предыдущих малых компонентов, степень отделения пропионил-спирамицина II от ацетилспирамицина III более 1,5, установленной Китайской фармакопеей; а степень отделения ацетилспирамицин III от его предыдущих малых компонентов составляет 1,2.

В результате многочисленных исследований, регулирования и оптимизации условий культивирования и ферментации изобретателем был получен левовращающий Карримицин (Carrimycin), который обладает более благоприятной противоинфекционной активностью.

В настоящее время применяется высокоэффективная жидкостная хроматография для определения 9 видов ацилированных спирамицинов Карримицина (Carrimycin), в т.ч. общее содержание изовалерил-спирамицинов (I+II+III) не менее 60%, общее содержание ацилированных спирамицинов не менее 80%. В отношении многокомпонентного антибиотика, полученного в результате ферментации, трудно достигать критерия контроля качества средств для инъекций среди химикатов, но в отношении тяжелых больных или больных, которым не подходит пероральное применение лекарства, инъекция дает результаты быстро, ввиду этого разработка однокомпонентного препарата изовалерил-спирамицина имеет очень глубокий смысл. В результате дальнейших исследований левовращающего Карримицина (Carrimycin) был получен однокомпонентный левовращающий изовалерил-спирамицин I чистотой до 98% (масс).

Общее описание изобретения

Первый объект изобретения относится к левовращающему изовалерил-спирамицину I, левовращающему изовалерил-спирамицину II, левовращающему изовалерил-спирамицину III.

Второй объект изобретения относится к препаратам, содержащим левовращающий изовалерил-спирамицин I, левовращающий изовалерил-спирамицин II, левовращающий изовалерил-спирамицин III соответственно.

Третьим объектом изобретения является способ приготовления левовращающего изовалерил-спирамицина I, левовращающего изовалерил-спирамицина II, левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Четвертым объектом изобретения также является употребление левовращающего изовалерил-спирамицина I, левовращающего изовалерил-спирамицина II, левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Пятым объектом изобретения также являются кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, левовращающего изовалерил-спирамицина II и левовращающего изовалерил-спирамицина III, а также препараты, содержащие указанные виды кристалла.

Для осуществления цели изобретения приняли следующие технические решения: Изобретение относится к левовращающему изовалерил-спирамицину I, химическая структура указанного левовращающего изовалерил-спирамицина I приведена в (I),

.

удельная постоянная вращения составляет [α]D=-49°--62°, предпочтительно -51°--60°, более предпочтительно -60°--62°, более предпочтительно -51°--58°, более предпочтительно -53°--58°, более предпочтительно -55°--58°, более предпочтительно -55°--57°, более предпочтительно -58°--60°, более предпочтительно -51°--55°, более предпочтительно -53°--55°, более предпочтительно -49°--51° (C=0,02 г/мл, CHCl₃, 25°C, λ=589,3 нм); точка плавления составляет 116-122°C, предпочтительно 118-120°C;

Изобретение относится к левовращающему изовалерил-спирамицину II, химическая структура указанного левовращающего изовалерил-спирамицина II приведена в (II),

Удельная постоянная вращения составляет [α]D=-55°--61°, предпочтительно -57°--59° (С=0,02 г/мл, CHCl₃, 25°C, λ=589,3 нм); точка плавления 120-128°C, предпочтительно 123-125°C;

Изобретение относится к левовращающему изовалерил-спирамицину III, химическая структура указанного левовращающего изовалерил-спирамицина III приведена в (III),

Удельная постоянная вращения составляет [α]D=(-) -49°--51° (C=0,02 г/мл, CHCl₃, 25°C, λ=589,3 нм); точка плавления составляет 116-118°C.

Изобретение относится к препаратам левовращающего изовалерил-спирамицина I, отличающимся тем, что указанные препараты содержат изовалерил-спирамицин I, фармацевтическую соль изовалерил-спирамицина I, фармацевтически приемлемые для изовалерил-спирамицина I и вспомогательные материалы, или фармацевтически приемлемые для фармацевтической соли изовалерил-спирамицина I вспомогательные материалы. Чистота указанного изовалерил-спирамицина I более 90% (масс.), предпочтительная чистота более 95% (масс.), более предпочтительная чистота более 98% (масс.).

Изобретение относится к препаратам левовращающего изовалерил-спирамицина II, отличающимся тем, что указанные препараты содержат изовалерил-спирамицин II, фармацевтическую соль изовалерил-спирамицина II, фармацевтически приемлемые для изовалерил-спирамицина II и вспомогательные материалы, или фармацевтически приемлемые для фармацевтической соли изовалерил-спирамицина II вспомогательные материалы. Чистота указанного изовалерил-спирамицина II более 90 масс.%, предпочтительная чистота более 95 масс.%, более предпочтительная чистота - более 98 масс.%.

Изобретение относится к препаратам левовращающего изовалерил-спирамицина III, отличающимся тем, что указанные препараты содержат изовалерил-спирамицин III, фармацевтическую соль изовалерил-спирамицина III, фармацевтически приемлемые для изовалерил-спирамицина III и вспомогательные материалы, или фармацевтически приемлемые для фармацевтической соли изовалерил-спирамицина III вспомогательные материалы. Чистота указанного изовалерил-спирамицина III более 90 масс.%, предпочтительная чистота более 95 масс.%, более предпочтительная чистота более 98 масс.%.

Первый предпочтительный вариант изобретения: препараты изобретения могут быть жидкими, твердыми, полутвердыми или газообразными; указанный жидкий препарат выбирают среди раствора для инъекции, трансфузионной среды, раствора, микстуры, сахарного сиропа, настойки, золи, ароматизированной воды, глицеринового раствора, коллоидального раствора, слизи, взвеси или эмульсии; указанный твердый препарат выбирают среди порошка для инъекций, лиофилизированного порошка, таблеток, желатиновых капсул, порошка, пилюль или пленок; указанный полутвердый препарат выбирают среди мази, пластыри, свечи; суппозитория, экстракта, желатинирующего вещества; указанный газообразный препарат выбирают среди аэрозоли или распыляемого раствора, предпочтительны раствор для инъекций, порошок для инъекций и лиофилизированный порошок для инъекций.

Второй предпочтительный вариант изобретения: единичные дозы изовалерил-спирамицина I, содержимого в препаратах изобретения, составляют 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг; единичные дозы изовалерил-спирамицина II, содержимого в препаратах изобретения, составляют 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг; единичные дозы изовалерил-спирамицина II, содержимого в препаратах изобретения, составляют 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг.

Третий предпочтительный вариант изобретения: в препаратах массовый процент левовращающего изовалерил-спирамицина I составляет 10-95%, предпочтительно 50-95%), более предпочтительно 75-95%; в препаратах массовый процент левовращающего изовалерил-спирамицина II составляет 10-95%, предпочтительно 50-95%, более предпочтительно 75-95%; в препаратах массовый процент левовращающего изовалерил-спирамицина III составляет 10-95%, предпочтительно 50-95%, более предпочтительно 75-95%.

Изобретение также относится к препаратам, содержащим левовращающий изовалерил-спирамицин I, или левовращающий изовалерил-спирамицин II или левовращающий изовалерил-спирамицин III.

Указанные препараты включают раствор для инъекций, порошок для инъекций или лиофилизированный порошок для инъекций, приготовленный из изовалерил-спирамицина I и, по крайней мере, одного среди лимоннокислоты, адипиновой кислоты, малеиновой кислоты. Указанные препараты включают раствор для инъекций, порошок для инъекций или лиофилизированный порошок для инъекций, приготовленный из изовалерил-спирамицина II и, по крайней мере, одного среди лимоннокислоты, адипиновой кислоты, малеиновой кислоты. Указанные препараты включают раствор для инъекций, порошок для инъекций или лиофилизированный порошок для инъекций, приготовленный из изовалерил-спирамицина III и, по крайней мере, одного среди лимоннокислоты, адипиновой кислоты, малеиновой кислоты.

В т.ч. мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина I к лимоннокислоте составляет 1:0,8-1, мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина I к адипиновой кислоте составляет 1:0,8-1.2, мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина I к малеиновой кислоте составляет 1:0,8-1,2; мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина II к лимоннокислое составляет 1:0,8-1,2, мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина II к адипиновой кислоте составляет 1:0,8-1,2, мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина II к малеиновой кислоте составляет 1:0,8-1,2; мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина III к лимоннокислое составляет 1:0,8-1,2, мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина III к адипиновой кислоте составляет 1:0,8-1,2, мольное отношение левовращающего изовалерил-спирамицина III к малеиновой кислоте составляет 1:0,8-1,2.

Изобретение также относится к способу приготовления левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III, включающему приготовление левовращающего Карримицина (Carrimycin), очистку левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III.

В т.ч. процесс приготовления левовращающего Карримицина (Carrimycin) включает культивирование клонированного штамма WSP-195 бактерий, продуцирующих спирамицин, с содержанием гена 4"-изовалерил-трансферазы, биологическое сбраживание и экстрагирование сбраживаемой жидкости; сбраживание при уровне pH 6,0-9,0, предпочтительно 6,0-8,0, более предпочтительно 6,0-7,5, зависимость уровня pH от времени показывала три непрерывных этапа, первый этап удовлетворяет уравнению y₁=k₁x₁+6,0, где 0,0227≤k₁≤0,1364, 0<x₁≤22; второй этап удовлетворяет уравнению y₂ ⁼k₂x₂+b₂, где -0,0735≤<k₂<0, 6,5<b₂≤10,62, 22≤x₂≤56, третий этап удовлетворяет уравнению y₃=k₃x₃+b₃, где 0<k₃≤0,0078, 6,06≤b₃<6,5, 56≤x₃≤120. Регулировали и оптимизировали условия культивирования и сбраживания, особенно регулировали уровень pH в процессе сбраживания с помощью средства для регулирования уровня рН, чтобы зависимость уровня pH от времени в процессе сбраживания показывала три непрерывных этапа, каждый из этапов удовлетворяет определенному уравнению, таким образом, получали левовращающий Карримицин (Carrimycin) с оптической активностью. Следовательно, получали левовращающий изовалерил-спирамицин I, левовращающий изовалерил-спирамицин II, левовращающий изовалерил-спирамицин III.

Предпочтительно, что условия биологического сбраживания: клонированный штамм WSJ-195 бактерий, продуцирующих спирамицин, с содержанием гена 4″-изовалерил-трансферазы, культивировали в течение 8-15 сут. при pH 6,5-7,5 и 28~38°C на наклонной питательной среде, содержащей муку из бобового жмыха 2%, глюкозу 1%, крахмал 3%, CaCO₃ 0,5%, NaCl 0,4% и агара 2%, засевали на питательную среду семени, содержащую муку из бобового жмыха 1,5%, крахмал 3,0%, NaCl 0,4%, CaCO₃ 0,5%, рыбный пептон 0,3% и KH₂PO₄ 0,05%, культивировали в течение 40-80 ч при pH 6,5-7,5 и 25~30°C, далее засевали прививочную дозу 0,1-20% на питательную ферментационную среду, содержащую глюкозу 0,5%, крахмал 6,0%, сухие дрожжи 0,5%, рыбную муку 2,0%, NH4NO3 0,6%, NaCl 1,0%, CaCCO₃ 0,5%, КН₂РO₄ 0,05%, MgSO₄ 0,1%, бобовое масло 0,5% и противовспениватель 0,02%, культивировали в течение 72-120 ч при pH 6,5-7,5 и 26~30°C, таким образом, получали сбраживаемую жидкость;

В качестве указанного средства для регулирования уровня pH выбирают, по крайней мере, один среди соляной кислоты, уксусной кислоты, нашатырного спирта, каустической соды, гидроокиси калия.

Предпочтительно, что экстрагирование биологически сбраживаемой жидкости по следующим шагам: обрабатывали полученную сбраживаемую жидкость сернокислым алюминием для получения фильтрата, регулировали уровень pH фильтрата до 8,5-9,0, экстрагировали бутилацетатом, промывали бутилацетатный экстракт обессоленной водой и 1% NaH₂PO₄ соответственно, экстрагировали водой pH 2,0-2,5 для получения водофазного экстракта, регулировали уровень pH до 4,5-5,5, удаляли остаточный бутилацетат возгонкой для получения водного экстракта, фильтровали, регулировали уровень pH фильтрата до 8,5-9,0, осаждали, орошали очищенной водой для получения влажного вещества, далее осушали и получали левовращающий Карримицин (Carrimycin).

В т.ч. для регулирования уровня pH применяли, по крайней мере, одну среди соляной кислоты, уксусной кислоты, лимоннокислоты, каустической соды, гидроокиси калия, натрия гидрокарбоната, углекислого натрия.

В т.ч. подробный процесс очистки изовалерил-спирамицинов I, II, III включает: очистку образцов левовращающего. Карримицина (Carrimycin) хроматографическим разделением, градиентную элюцию хроматографической колонной ODS с помощью ацетонитрила и буферного раствора уксуснокислого аммония, выделение целевого пика состава левовращающего изовалерил-спирамицина I, целевого пика состава левовращающего изовалерил-спирамицина II или целевого пика состава левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Предпочтительно, что в процессе очистки левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III, принимали припрепаративную высокоэффективную жидкостную хроматографию, ультрафиолетовый контроль, регистрировали ультрафиолетовую спектрограмму. Собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина I - 44,759 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина II - 43,34 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина III - 48,009 мин.

Более предпочтительно, что в процессе очистки левовращающего изовалерил-спирамицина I, II, III, очищали собранные левовращающие изовалерил-спирамицины I, II или III от ацетонитрила вращающим испарением, потом экстрагировали этилацетатом, удаляли этилацетат из экстракта испарением, получали пастообразные образцы; перерастворяли полученные образцы петролейным эфиром, удаляли петролейный эфир испарением, получали белые порошковые частицы левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III соответственно.

В т.ч. указанной подвижной фазой является смешанный растворитель ацетонитрила A и водного раствора уксуснокислого аммония pH=8,5,150 мМ.

Конкретные условия очистки левовращающего изовалерил-спирамицина I, II или III: применяли линейный градиент: 0-60 мин., A: 25%-65%; 61-90 мин., A: 65%-90%;

Скорость потока: 260 мл/мин;

Объем вводимого образца: 10 мл;

Концентрация вводимого образца: 0.5 г/мл;

Контрольная длина волны: 231 нм;

Способ сбора: ультрафиолетовый пуск

Изобретение также относится к кристаллам левовращающего изовалерил-спирамицина I, порошковая рентгеновская дифракция, измеренная Cu-Kα-лучами, показывала характеристический пик при 2θ, равном, 7,6°, 8,0°, 10,0°, 11,4°, 16,4°, 17,0°, 17,5°, 17,9°, 19,5°, 22,7°, 23,7° и 24,4°. Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции показана на Рис.5.

Способ приготовления указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I заключается в том, что сначала растворяют твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина I в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, потом наливают очищенную воду с одновременным перемешиванием, после налива очищенной воды температура снижается до 5-15°C, при этом продолжают перемешивание до получения кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I.

В т.ч. первое предпочтительное техническое решение по приготовлению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I заключается в том, что объем вводимой очищенной воды в 2-9 раз больше суммы объема этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, предпочтительно 2,5-7,5 раза; скорость ввода очищенной воды 4-10 мл/мин, предпочтительно 6-8 мл/ мин.

Второе предпочтительное техническое решение по приготовлению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I заключается в том, что в примененной смеси растворителей отношение объема этилацетата к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляет 1:0,1-10:0,5-1, предпочтительно 1:2-8:0,8-1.

Третье предпочтительное техническое решение по приготовлению указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I заключается в том, что скорость перемешивания вводимой очищенной воды 30-60 р/мин, предпочтительно 45-60 р/мин; после ввода очищенной воды скорость перемешивания 10-30 р/мин, предпочтительно 10-20 р/мин.

Четвертое предпочтительное техническое решение по приготовлению указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I заключается в том, что скорость охлаждения после ввода очищенной воды 1-3°C /ч, предпочтительно 1-1.5°C 1 ч,

Изобретение также относится к кристаллам левовращающего изовалерил-спирамицина II, порошковая рентгеновская дифракция, измеренная Cu-Kα-лучами, показывала характеристический пик при 2θ, равном, 10,0°, 11,6°, 16,4°, 17,3°, 19,1°, 21,2°, 22,1°, 22,7°, 26,4°, 26,9°, 27,5°, и 31,5°. Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции показана на Рис.6.

Способ приготовления указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II заключается в том, что сначала растворяют твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина II в смеси растворителей безводного метанола, безводного ацетона и абсолютного этилового спирта, потом наливают очищенную воду с одновременным перемешиванием, после налива очищенной воды температура снижается до 5-15°C, при этом продолжают перемешивание до получения кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II.

В т.ч. первое предпочтительное техническое решение по приготовлению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II заключается в том, что объем вводимой очищенной воды в 2-9 раз больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, предпочтительно 2,5-7,5 раза; скорость ввода очищенной воды 4-10 мл/мин, предпочтительно 6-8 мл/мин.

Второе предпочтительное техническое решение по приготовлению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II заключается в том, что в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему безводного ацетона и к объему абсолютного этилового спирта составляет 1:0,1-10:0,5-1, предпочтительно 1:2-8:0,8-1.

Третье предпочтительное техническое решение по приготовлению указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II заключается в том, что скорость перемешивания вводимой очищенной воды 30-60 р/мин, предпочтительно 45-60 р/мин; после ввода очищенной воды скорость перемешивания 10-30 р/мин, предпочтительно 10-20 р/мин.

Четвертое предпочтительное техническое решение по приготовлению указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II заключается в том, что скорость охлаждения после ввода очищенной воды 1-3°C /ч, предпочтительно 1-1,5°C 1 ч.

Изобретение также относится к кристаллам левовращающего изовалерил-спирамицина III, порошковая рентгеновская дифракция, измеренная Cu-Kα-лучами, показывала характеристический пик при 2θ, равном, 8,0°, 10,0°, 11,2°, 11,7°, 16,4°, 19,1°, 19,6°, 20,0°, 21,4°, 22,9°, 23,6° и 29,4°. Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции показана на Рис.7.

Способ приготовления указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III заключается в том, что сначала растворяют твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина III в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, потом наливают очищенную воду с одновременным перемешиванием, после налива очищенной воды температура снижается до 5-15°C, при этом продолжают перемешивание до получения кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III.

В т.ч. первое предпочтительное техническое решение по приготовлению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III заключается в том, что объем вводимой очищенной воды в 2-9 раз больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, предпочтительно 2,5-7,5 раза; скорость ввода очищенной воды 4-10 мл/мин, предпочтительно 6-8 мл/мин.

Второе предпочтительное техническое решение по приготовлению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III заключается в том, что в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляет 1:0,1-10:0,5-1, предпочтительно 1:2-8:0,8-1.

Третье предпочтительное техническое решение по приготовлению указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III заключается в том, что скорость перемешивания вводимой очищенной воды 30-60 р/мин, предпочтительно 45-60 р/мин; после ввода очищенной воды скорость перемешивания 10-30 р/мин, предпочтительно 10-20 р/мин.

Четвертое предпочтительное техническое решение по приготовлению указанных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III заключается в том, что скорость охлаждения после ввода очищенной воды 1-3°C 1 ч, предпочтительно 1-1.5°C 1 ч.

В элементарных ячейках различных форм молекулы имеют различную пространственную конфигурацию, конфирмацию и расположение, их растворимость тоже сильно отличается, препараты имеют различную скорость растворения внутри тела, что оказывало непосредственное воздействие на поглощение, распределение, экскрецию и метаболизм препаратов в теле, в результате чего различная биологическая доступность приведет к получению различных клинических эффектов. В изобретении проводили соответственное сравнение терапевтической эффективности приготовленных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I, кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II или кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III с эффективностью левовращающего изовалерил-спирамицина I, левовращающего изовалерил-спирамицина II или левовращающего изовалерил-спирамицина III, и было обнаружено, что терапевтическая эффективность приготовленных по изобретению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I, превосходит эффективность левовращающего изовалерил-спирамицина I, терапевтическая эффективность приготовленных по изобретению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, превосходит эффективность левовращающего изовалерил-спирамицина II, терапевтическая эффективность приготовленных по изобретению кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина IIII, превосходит эффективность левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Изобретение относится также к препаратам кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I, указанные препараты включают кристаллы изовалерил-спирамицина I, фармацевтическую соль кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I, фармацевтически приемлемые для кристаллов изовалерил-спирамицина I вспомогательные материалы, или фармацевтически приемлемые для фармацевтической соли кристаллов изовалерил-спирамицина I вспомогательные материалы, чистота указанных кристаллов изовалерил-спирамицина I более 99 масс.%.

Изобретение относится также к препаратам кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, указанные препараты включают кристаллы изовалерил-спирамицина II, фармацевтическую соль кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, фармацевтически приемлемые для кристаллов изовалерил-спирамицина II вспомогательные материалы, или фармацевтически приемлемые для фармацевтической соли кристаллов изовалерил-спирамицина II вспомогательные материалы, чистота указанных кристаллов изовалерил-спирамицина II более 99 масс.%.

Изобретение относится также к препаратам кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III, указанные препараты включают кристаллы изовалерил-спирамицина III, фармацевтическую соль кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III, фармацевтически приемлемые для кристаллов изовалерил-спирамицина III вспомогательные материалы, или фармацевтически приемлемые для фармацевтической соли кристаллов изовалерил-спирамицина III вспомогательные материалы, чистота указанных кристаллов изовалерил-спирамицина III более 99 масс.%.

Изобретение относится также к употреблению изоамил-спирамицина I или его кристаллов, и его препаратов в приготовлении лечебных и/или профилактических средств против инфекционных заболеваний. Изобретение относится также к употреблению изоамил-спирамицина II или его кристаллов, и его препаратов в приготовлении лечебных и/или профилактических средств против инфекционных заболеваний. Изобретение относится также к употреблению изоамил-спирамицина III или его кристаллов, и его препаратов в приготовлении лечебных и/или профилактических средств против инфекционных заболеваний. Указанные инфекционные заболевания вызваны заражением грамположительными бактериями, золотистым Стафилококком, пневмококком, микоплазмой пневмония, хламидией пневмониз, уреаплазмой уреалитикум, трахоматозными хламидиями, streptococcus pyogenes, микрококком катаральным, нейссерией гонорея, гемофильной палочкой, легионеллой или анаэробными бактериями.

Изобретение относится также к употреблению изоамил-спирамицина I или его кристаллов, и его препаратов в приготовлении антибактериальных средств, изобретение относится также к употреблению изоамил-спирамицина II или его кристаллов, и его препаратов в приготовлении антибактериальных средств, изобретение относится также к употреблению изоамил-спирамицина III или его кристаллов, и его препаратов в приготовлении антибактериальных средств, указанные бактерии: пневмококк, стрептококк группы A, streptococcus pyogenes, энтерококк, золотистый стафилококк, эпидермальный стафилококк, микрококк катаральный, нейссерия гонорея, гемофильная палочка, колибацилла или кишечная палочка, энтеротоксигенные кишечные палочки, патогенная кишечная палочка, enteroinvasive escherichia coli, синегнойная палочка, клебсиелла пневмонии, протеус вульгарис, тифозная палочка, акинетобактерии, лимоннокислота, цитробактер, serratia marcescens, шигелла зонне, шигелла Флекснера, бацилла, tritirachium album; легионеллы, как легионеллезная пневмония, legionella gormanii, legionella bozemanii, legionella dumoffii, legionella jordanis, legionella micdadei; анаэробные бактерии, как бактероиды фрагилис, bacteroides thetaiotaomicron, бактероиды вульгатус, Bacteroides distasonis, bacteroides ruminicola, prevotella asaccharolyticus, prevotella oralis, палочка Плаута, fusobacterium russii, бифидобактерии, лактобацилла, пептострептококки, пропионибактерии акне, клостридии перфрингенс, дрожжеподобный гриб.

Ниже приведено подробное описание изобретения.

Изобретение относится к левовращающему изовалерил-спирамицину I, который получали путем регулирования и оптимизирования условий культивирования и сбраживания, а также строгого контролирования уровня pH раствора.

Изобретение относится к левовращающему изовалерил-спирамицину II, который получали путем регулирования и оптимизирования условий культивирования и сбраживания, а также строгого контролирования уровня pH раствора.

Изобретение относится к левовращающему изовалерил-спирамицину III, который получали путем регулирования и оптимизирования условий культивирования и сбраживания, а также строгого контролирования уровня pH раствора.

Левовращающие изовалерил-спирамицины I, II и III обладают повышенной антибактериальной активностью, стали новыми ассортиментами антибиотических средств для инъекций, что предоставило новую возможность для решения технической задачи по антибиотикоустойчивости в настоящее время.

В т.ч. метод определения удельной постоянной вращения левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II и III: точно взвешивают указанный препарат, добавляют трихлорметан, растворяют и разбавляют до концентрации 20 мг/1 мл, определяют постоянную вращения калиброванным поляриметром с разрешением до 0,0001° с помощью D-линии спектра натрия (589,3 нм), длина 1 дм, температура 25°C.

Метод определения точки плавления левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III: взвешивают сухой левовращающий изовалерил-спирамицин I, II или III в умеренном количестве, кладут в капилляр для определения точки плавления, повторяют определение три раза и принимают среднюю величину.

Изобретение также относится к препаратам, содержащим левовращающие изовалерил-спирамицины I, II или III. Составом препаратов являются левовращающий изовалерил-спирамицин I и фармацевтически приемлемые носили и/или вспомогательные материалы, в т.ч. частота изовалерил-спирамицинов I, II и III более 90 масс.%, предпочтительно более 95 масс.%, более предпочтительно более 98 масс.%.

Препараты, содержащие левовращающий изовалерил-спирамицин I, II или III или их кристаллы: предпочтительны раствор для инъекций, порошок для инъекций и лиофилизированный порошок для инъекций. Приготавливают раствор для инъекций или порошок для инъекций из препаратов, содержащих однокомпонентный левовращающий изовалерил-спирамицин I, II или III, чтобы левовращающий изовалерил-спирамицин I, II и III был быстро поглощен в организме человека и достигалась антиинфекционная функция.

Препараты изобретения, содержащие левовращающий изовалерил-спирамицин I, включают следующую единичную дозу: левовращающий изовалерил-спирамицин I 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг.

Препараты изобретения, содержащие левовращающий изовалерил-спирамицин II, включают следующую единичную дозу: левовращающий изовалерил-спирамицин II 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг.

Препараты изобретения, содержащие левовращающий изовалерил-спирамицин III, включают следующую единичную дозу: левовращающий изовалерил-спирамицин III 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг.

Препараты изобретения, содержащие кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, включают следующую единичную дозу: кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг.

Препараты изобретения, содержащие кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, включают следующую единичную дозу: кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг.

Препараты изобретения, содержащие кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, включают следующую единичную дозу: кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III 10-1500 мг, предпочтительно 50-1000 мг, более предпочтительно 100-500 мг.

В препаратах изобретения, содержащих левовращающий изовалерил-спирамицин I, массовый процент левовращающего изовалерил-спирамицина I составляет 10-90%, предпочтительно 50-90%, более предпочтительно 75-90%.

В препаратах изобретения, содержащих левовращающий изовалерил-спирамицин II, массовый процент левовращающего изовалерил-спирамицина II составляет 10-90%, предпочтительно 50-90%, более предпочтительно 75-90%.

В препаратах изобретения, содержащих левовращающий изовалерил-спирамицин III, массовый процент левовращающего изовалерил-спирамицина III составляет 10-90%, предпочтительно 50-90%, более предпочтительно 75-90%.

В препаратах изобретения, содержащих кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, массовый процент кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I составляет 10-90%, предпочтительно 50-90%, более предпочтительно 75-90%.

В препаратах изобретения, содержащих кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина И, массовый процент кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II составляет 10-90%, предпочтительно 50-90%, более предпочтительно 75-90%.

В препаратах изобретения, содержащих кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, массовый процент кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III составляет 10-90%, предпочтительно 50-90%, более предпочтительно 75-90%.

Препараты изобретения для приема внутрь могут содержать частоприменяемые воспринимающие средства, как святитель, заполняющие вещества, разбавитель, таблетки, мягчительные средства, дезинтегрант, краситель, приправы и смачиватель, при необходимости покрывают таблетки покровным слоем. В т.ч. применимые заполняющие вещества включают фибрин, маннитол, лактозу и другие подобные заполняющие вещества. Применимый дезинтегрант включает крахмал, поливиниловый пирролидин и дериваты крахмала, например гликолят натрий крахмал. Применимые мягчительные средства включают, например стеарат магния. Применимый смачиватель, приемлемый для лекарственных средств, включает додецил сульфата кантрия.

Твердые препараты для введения внутрь через рот приготавливают смешиванием, наполнением, таблетированием и другими распространенными методами.

Формы жидких препаратов для перорального приема, например водянистая или жирная взвесь, раствор, эмульсия, сахарный сироп или эликсир, или сухой продукт, который можно приготовить вместе с водой или другими подходящими носителями до его применения. Такие жидкие препараты могут содержать обычные добавки, например суспендирующие вещества, как сорбит, сахарный сироп, метилцеллюлоза, желатина, оксиэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гель стеаринового алюминия или пищевой гидрированный жир, эмульсоры, например лецитин, дегидратационный сорбит-олеин или гуммиарабик, неводные носители (могут содержать пищевое масло), например миндальное масло, фракционированное кокосовое масло, как масляный эфир глицерида, пропиленгликоль или этиловый алкоголь; антисептики, например липид-п-гидроксибензойной кислоты или n-гидроксифенилмуравьинопропиловый эфир или сорбиновая кислота, при необходимости могут содержать обычные ароматизирующее вещества или краситель.

Препараты для инъекций могут содержать любые обычные фармацевтические носители и/или воспринимающие средства, стабилизирующие вещества, антиоксиданты, комплексообразователь, а также фармацевтические антисептики, буферы или местно-анестезирующие средства и т.д. Применяют обычные методы приготовления.

Фармацевтически приемлемые носители, применяемые в препаратах изобретения, выбирают среди: маннитола, сорбита, пиросернистокислого натрия, бисульфита натрия, тиосульфата натрия, цистеина гидрохлорида, тиогликовой кислоты, метионина, витамина C, этилендиаминтетраацетата натрия, этилендиаминтетраацетата кальция-натрия, карбоната, ацетатаф, фосфата или его водного раствора, соляной кислоты, уксусной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, аминокислоты, хлористого натрия, хлористого калия одновалентных щелочных металлов, лактата натрия, ксилитола, мальтозы, глюкозы, фруктозы, декстрана, глицина, крахмала, сахарозы, лактозы, лактобиозы, маннитола, деривата кремния, фибрина и его деривата, соли апьгиновой кислоты, желатина, поливинилового пирролидона, глицерина, полисорбата 80, агара, углекислого кальция, гидрокарбоната кальция, поверхностно-активного агента, полиэтиленгликоля, циклодекстрина, р-циклодекстрина, фосфатидных материалов, каолина, талькового порошка, стеаринового кальция, стеаринового магния, стеарата магния и т.д.

Способ применения и дозы препаратов определяют в зависимости от реального состояния пациента, можно внутреннее употребление или введение инъекцией 1-3 раза в день по 1-20 доз.

Эффективность изобретения:

(1) Левовращающий изовалерил-спирамицин I, левовращающий изовалерил-спирамицин II, левовращающий изовалерил-спирамицин III обладают благоприятными антибактериальными свойствами. Согласно современной мармакологии в связи с различной стереоспецифичностью антипода лекарственных "веществ, они имеют различный аффинитет с рецепторами, в результате чего сильно отличаются фармакологические свойства, ввиду этого, левовращающий изовалерил-спирамицин I, левовращающий изовалерил-спирамицин II, левовращающий изовалерил-спирамицин III обладают очень большой фармакологической активностью.

(2) В элементарных ячейках различных форм молекулы имеют различную пространственную конфигурацию, конформацию и расположение, их растворимость тоже сильно отличаются, препараты имеют различную скорость растворения внутри тела, что оказывало непосредственное воздействие на поглощение, распределение, экскрецию и метаболизм препаратов в теле, в результате чего различная биологическая доступность приведет к получению различных клинических эффектов. Проводили сравнение терапевтической эффективности приготовленных по изобретению кристаллов левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III с эффективностью левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III, и было обнаружено, что терапевтическая эффективность приготовленных по изобретению кристаллов левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III превосходит эффективность левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II или III.

(3) Однокомпонентные реагенты для инъекций,- содержащие левовращающий изовалерил-спирамицин I, II или III, однокомпонентные реагенты для инъекций, содержащие кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, II или III, предоставляли тяжелым больным и больным, которым не подходит введение лекарств через рот, возможность применения быстродействующих и приемлемых лекарственных форм.

(4) Однокомпонентные препараты, содержащие левовращающий изовалерил-спирамицин I, II или III, однокомпонентные препараты, содержащие кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, II или III, отличаются стабильной технологией производством и возможностью контроля качества, рассчитаны на масштабное промышленное производство.

Список рисунков

Рис.1: Хроматограмма собранных ультрафиолетовым пуском левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II и III по Примеру 1;

Рис.2: Зависимость уровня pH от времени в процессе браживания по примеру 1 изобретения;

Рис.3: Зависимость уровня pH от времени в процессе браживания по примеру 2 изобретения;

Рис.4: Зависимость уровня pH от времени в процессе браживания по примеру 3 изобретения;

Рис.5: Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции левовращающего изовалерил-спирамицина I изобретения;

Рис.6: Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции левовращающего изовалерил-спирамицина II изобретения;

Рис.7: Диаграмма порошковой рентгеновской- дифракции левовращающего изовалерил-спирамицина III изобретения.

Настоящее изобретение поясняется с помощью нижеследующих примеров, которые нужно рассматривать как пояснительные, а не ограничивающие объем охраны изобретения.

Подробные примеры

Пример 1. Разделение и приготовление левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II и III.

(1) Биологическое сбраживание: клонированный штамм WSJ-195 бактерий, продуцирующих спирамицин, с содержанием гена 4″-изовалерил-трансферазы, культивировали в течение 8-15 сут, при pH 6,5-7,5 и 28~38°C на наклонной питательной среде, содержащей муку из бобового жмыха 2%, глюкозу 1%, крахмал 3%, CaCO₃ 0,5%, NaCl 0,4% и агара 2%, засевали на питательную среду семени, содержащую муку из бобового жмыха 1,5%, крахмал 3,0%, NaCl 0,4%, CaCO₃ 0,5%, рыбный пептон 0,3% и KH₂PO₄ 0,05%, культивировали в течение 40-80 ч при рН 6,5-7,5 и 25~30°C, далее засевали прививочную дозу 0,1-20% на питательную ферментационную среду, содержащую глюкозу 0,5%, крахмал 6,0%, сухие дрожжи 0,5%, рыбную муку 2,0%, NH₄NO₃ 0,6%, NaCl 1,0%, CaCO₃ 0,5%, KH₂PO₄ 0,05%, MgSO₄ 0,1%, бобовое масло 0,5% и противовспениватель 0,02%, культивировали в течение 72-120 ч при pH 6,5-7,5 и 26~30°C, таким образом, получали сбраживаемую жидкость;

В т.ч. строго контролировали уровень pH раствора путем регулирования и оптимизирования условий культирования и сбраживания, проводили сбраживание при уровне pH 6,0-9,0, время сбраживания составляет 120 ч, и зависимость уровня pH от времени показывала три непрерывных этапа, первый этап удовлетворяет уравнению y₁=0,1364x₁+6,0, где 0≤x₁≤22; второй этап удовлетворяет уравнению y₂=-0,0735×₂+10,64, где 22≤x₂≤56; третий этап удовлетворяет уравнению y₃=0,0078x₃+6,06, где 56≤x₃≤120, зависимость уровня pH от времени приведена на Рис.2, таким образом, получали сбраживаемую жидкость.

(2) Экстрагирование биологически сбраживаемой жидкости: обрабатывали сбраживаемую жидкость, полученную по п.(1), сернокислым алюминием для получения фильтрата, регулировали уровень pH фильтрата до 8,5, экстрагировали бутилацетатом, промывали бутилацетатный экстракт обессоленной водой и 1% NaH₂PO₄ соответственно, экстрагировали водой pH 2,0 для получения водофазного экстракта, регулировали уровень pH до 4,5, удаляли остаточный бутилацетат возгонкой для получения водного экстракта, фильтровали, регулировали уровень pH фильтрата до 8,5, осаждали, орошали очищенной воды для получения влажного вещества, далее осушали и получали левовращающий Карримицин (Carrimycin).

(3) Очистка левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III: очищали образцы, полученные после предварительного выделения, ' препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией, приготавливали хроматографическую колонну из ODS, проводили градиентную элюцию с помощью ацетонитрила и буферного раствора уксуснокислого аммония, ультрафиолетовый контроль, регистрировали ультрафиолетовую спектрограмму выделения, собирали целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина I, целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина II, целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Хроматографическая колонна: приготовление хроматографической колонны из ODS; Подвижная фаза: ацетонитрил (А),100 мМ водный раствор уксуснокислого аммония (B);

Градиент: применяли линейный градиент 0-60 мин, A: 25%-65%; 61-90 мин, A: 65%-90.

Скорость потока 260 мл/мин Объем вводимого образца 10 мл Концентрация вводимого образца 0,5 г/мл Контрольная длина волны 231 нм Способ сбора ультрафиолетовый пуск

Собирали образцы изовалерил-спирамицина I согласно времени выдержки изовалерил-спирамицина I - 44,759 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина II - 43,34 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина III - 48,009 мин.

Очищали собранные образцы от ацетонитрила вращающим испарением, потом экстрагировали однократным этилацетатом, удаляли этилацетат из экстракта вращающим испарением, получали пастообразные образцы; перерастворяли полученные образцы петролейным эфиром, удаляли петролейный эфир вращающим испарением, получали белые порошковые частицы изовалерил-спирамицинов I, II или III соответственно. Пример 2: Разделение и приготовление левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II и III

(1) Биологическое сбраживание: клонированный штамм WSJ-195 бактерий, продуцирующих спирамицин, с содержанием гена 4″-изовалерил-трансферазы, культивировали в течение 12 суток при pH 7,2 и 32°С на наклонной питательной среде, содержащей муку из бобового жмыха 2%, глюкозу 1%, крахмал 3%, CaCO₃ 0,5%, NaCl 0,4% и агара 2%, засевали на питательную среду семени, содержащую муку из бобового жмыха 1,5%, крахмал 3,0%, NaCl 0,4%, CaCO₃ 0,5%, рыбный пептон 0,3% и КН₂РО₄ 0,05%, культивировали в течение 70 ч при pH 7,2 и 27°C, далее засевали прививочную дозу 12% на питательную ферментационную среду, содержащую глюкозу 0,5%, крахмал 6,0%, сухие дрожжи 0,5%, рыбную муку 2,0%, NH₄NO₃ 0,6%, NaCl 1,0%, CaCO₃ 0,5%, KH₂PO₄ 0,05%, MgSO₄ 0,l%, бобовое масло 0,5% и противовспениватель 0,02%, культивировали в течение 100 ч при pH 6,0-9,0 и 26~30°C, таким образом, получали сбраживаемую жидкость; проводили сбраживание при уровне pH 6,0-8,0, время сбраживания составляет 110 ч, и зависимость уровня pH от времени показывала три непрерывных этапа, первый этап удовлетворяет уравнению y₁=0,0909x₁+6,4, где 0<x₁<22; второй этап удовлетворяет уравнению у₂=-0,0441x₂+7,8, где 22<х₂<56; третий этап удовлетворяет уравнению y₃=0,0078x₃+6,06, где 56≤x₃≤110, зависимость уровня pH от времени приведена на Рис.3, таким образом, получали сбраживаемую жидкость. Подробная зависимость показана на Рис.3.

(2) Экстрагирование биологически сбраживаемой жидкости: обрабатывали сбраживаемую жидкость, полученную по п.(1), сернокислым алюминием для получения фильтрата, регулировали уровень pH фильтрата до 8,6, экстрагировали бутилацетатом, промывали бутилацетатный экстракт обессоленной водой и 1% NaH₂PO₄ соответственно, экстрагировали водой pH 2,3 для получения водофазного экстракта, регулировали уровень pH до 5,0, удаляли остаточный бутилацетат возгонкой для получения водного экстракта, фильтровали, регулировали уровень pH фильтрата до 8,6, осаждали, орошали очищенной воды для получения влажного вещества, далее осушали и получали левовращающий Карримицин (Carrimycin).

(3) Очистка левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III: очищали образцы, полученные после предварительного выделения, препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией, приготавливали хроматографическую колонну из ODS, проводили градиентную элюцию с помощью ацетонитрила и буферного раствора уксуснокислого аммония, ультрафиолетовый контроль, регистрировали ультрафиолетовую спектрограмму выделения, собирали целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина I, целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина II, целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Хроматографическая колонна: приготовление хроматографической колонны из ODS;

Подвижная фаза: ацетонитрил (A),100 мМ водный раствор уксуснокислого аммония (В);

Градиент применяли линейный градиент 0-60 мин, А: 25%-65%; 61-90 мин, A: 65%-90%.

Скорость потока 260 мл/мин Объем вводимого образца 10 мл Концентрация вводимого образца 0,5 г/мл Контрольная длина волны 231 нм Способ сбора ультрафиолетовый пуск

Собирали образцы левовращающего изовалерил-спирамицина I согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина I - 44,759 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина II - 43,34 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина III - 48,009 мин.

Очищали собранные образцы от ацетонитрила вращающим испарением, потом экстрагировали однократным этилацетатом, удаляли этилацетат из экстракта вращающим испарением, получали пастообразные образцы; перерастворяли полученные образцы петролейным эфиром, удаляли петролейный эфир вращающим испарением, получали белые порошковые частицы изовалерил-спирамицинов I, II или III соответственно. Пример 3. Разделение и приготовление левовращающих изовалерил-спирамицинов I II, III.

(1) Культивирование и сбраживание: культивировали клонированный штамм WSJ-195 бактерий, продуцирующих спирамицин, с содержанием гена 4″-изовалерил-трансферазы, на наклонной питательной среде, потом засевали на питательную среду семени, культивировали, далее засевали на питательную ферментационную среду, контролировали процесс сбраживания с помощью глюкозы и лимоннокислоты. проводили сбраживание при уровне pH 6,0-7,5, время сбраживания 115 ч, зависимость уровня pH от времени показывала три непрерывных этапа, первый этап удовлетворяет уравнению y₁=0,0682x₁+6,0, где 0<x₁<22; второй этап удовлетворяет уравнению у₂=-0,0294х₂+8,147, где 22<х₂<56; третий этап удовлетворяет уравнению уз=0,0078x₃+6,06, где 56<x₃<115, зависимость уровня pH от времени приведена на Рис.4, таким образом, получается сбраживаемая жидкость.

(2) Экстрагирование биологически сбраживаемой жидкости: обрабатывали сбраживаемую жидкость, полученную по п.(1), сернокислым алюминием для получения фильтрата, регулировали уровень pH фильтрата до 8,6, экстрагировали бутилацетатом, промывали бутилацетатный экстракт обессоленной водой и 1% NaH₂PO₄ соответственно, экстрагировали водой pH 2,3 для получения водофазного экстракта, регулировали уровень pH до 5,0, удаляли остаточный бутилацетат возгонкой для получения водного экстракта, фильтровали, регулировали уровень pH фильтрата до 8,6, осаждали, орошали очищенной воды для получения влажного вещества, далее осушали и получали левовращающий Карримицин (Carrimycin).

(3) Очистка левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III: очищали образцы, полученные после предварительного выделения, препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией, приготавливали хроматографическую колонну из ODS, проводили градиентную элюцию с помощью ацетонитрила и буферного раствора уксуснокислого аммония, ультрафиолетовый контроль, регистрировали ультрафиолетовую спектрограмму выделения, собирали целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина I, целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина II, целевой пик состава левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Хроматографическая колонна: приготовление хроматографической колонны из ODS; Подвижная фаза: ацетонитрил (A), 100 мМ водный раствор уксуснокислого аммония (B);

Градиент применяли линейный градиент 0-60 мин, А 25%-65%; 61-90 мин, A: 65%-90%.

Скорость потока 260 мл/мин Объем вводимого образца 10 мл Концентрация вводимого образца 0,5 /мл Контрольная длина волны 231 нм Способ сбора ультрафиолетовый пуск

Собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина I - 44,759 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина II - 43,34 мин, собирали образцы согласно времени выдержки левовращающего изовалерил-спирамицина III - 48,009 мин.

Очищали собранные образцы от ацетонитрила вращающим испарением, потом экстрагировали однократным этилацетатом, удаляли этилацетат из экстракта вращающим испарением, получали пастообразные образцы; перерастворяли полученные образцы петролейным эфиром, удаляли петролейный эфир вращающим испарением, получали белые порошковые частицы изовалерил-спирамицинов I, II или III соответственно. Пример 4. Приготовление раствора для инъекций левовращающего изовалерил-спирамицина I

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин I 100 мг с адипиновой кислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, и получали желтоватый прозрачный раствор уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Проводили заправку, герметизацию, стерилизацию, проверку и упаковку в стерильных условиях.

Пример 5. Приготовление раствора для инъекций изовалерил-спирамицина I

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин I 100 мг с лимоннокислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистиллированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор, уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Проводили заправку, герметизацию, стерилизацию, проверку и упаковку в стерильных условиях.

Пример 6. Приготовление раствора для инъекций изовалерил-спирамицина I

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин I 100 мг с малеиновой кислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Проводили заправку, герметизацию, стерилизацию, проверку и упаковку в стерильных условиях.

Пример 7. Приготовление порошка для инъекций левовращающего изовалерил-спирамицина I

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин I 100 мг с лимоннокислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор, уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Добавляли маннитол 30-150 мг в качестве расклинивающего агента лиофилизированного порошка, быстро замораживали в течение 9 ч в криогенном режиме, замораживали и осушали, получали желтоватый рыхлый массив, устанавливали крышку, проверяли и упаковывали в стерильных условиях.

Пример 8. Приготовление порошка для инъекций левовращающего изовалерил-спирамицина I.

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин I 100 мг с малеиновой кислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Добавляли маннитол 30-150 мг в качестве расклинивающего агента лиофилизированного порошка, быстро замораживали в течение 9 ч в криогенном режиме, замораживали и осушали, получали желтоватый рыхлый массив, устанавливали крышку, проверяли и упаковывали в стерильных условиях.

Пример 9. Приготовление порошка для инъекций левовращающего изовалерил-спирамицина I

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин I 100 мг с лимоннокислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор, уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Добавляли маннитол 30-150 мг в качестве расклинивающего агента лиофилизированного порошка, быстро замораживали в течение 9 ч в криогенном режиме, замораживали и осушали, получали желтоватый рыхлый массив, устанавливали крышку, проверяли и упаковывали в стерильных условиях.

Пример 10. Таблетки Левовращающий изовалерил-спирамицин I (1000 таблеток)

Рецептура:

левовращающий изовалерил-спирамицин I 100 г оксипропилцеллюлоза с низкой степенью замещения (5%) 9,25 г карбоксиметил-крахмал натрия (3%) 5,55 г стеарат магния (1%) 1,85 г крахмал общий вес - вес прочих сырья и вспомогательных материалов общий вес 185 г

Технология приготовления: взвешивали крахмал в подходящем количестве, растворяли до концентрации 15%, нагревали до пастообразного состояния, чтобы получить связитель; просеивали на сите в 100 меш основное сырье Карримицин (Carrimycin), вспомогательные материалы - крахмал, оксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, карбоксиметил-крахмал натрия, и стеарат магния, взвешивали основное сырье и вспомогательные материалы в необходимом количестве согласно рецептуре; равномерно перемешивали левовращающий изовалерил-спирамицин I, крахмал и оксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, приготавливали мягкий агент с помощью крахмальной пасты концентрацией крахмала 15%, гранулировали на сите в 14 меш, осушали при 50-60°C, обеспечивали влажность в пределах 3-5%, формировали гранулы на сите в 14 меш, добавляли карбоксиметил-крахмал натрия и стеариновый магний, и перемешивали, определяли содержание частиц; согласно содержанию частиц рассчитывали вес таблетки, таблетировал (шампон диаметром 9 мм с неглубокой впадиной), проверяли разницу веса таблетки; после получения положительных результатов проводили упаковку.

Пример 11. Желатиновые капсулы Левовращающий изовалерил-спирамицин I (1000 капсул)

Рецептура:

сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина I 100 г крахмал (фармацевтический) 108 - вес сырого порошка левовращающего изовалерил-спирамицина I фармацевтическая капсула #3 100 шт. жидкий парафин 5 мл

Технология приготовления: взвешивали основное сырье - левовращающий изовалерил-спирамицин I и вспомогательные материалы - фармацевтический крахмал согласно рецептуре, положили в миксер и равномерно перемешивали в течение 1,5-2 ч; отобрали пробы и проверяли содержание, результаты должны принципиально соответствовать теоретическим данным (содержимое в каждой капсуле примерно 0,105 г), положили проверенные с положительными результатами фармацевтические капсулы #3 и перемешанную смесь в загрузочный аппарат для наполнения капсул согласно требованиям к эксплуатации автоматизированной капсулонаполнительной машины, проверяли разницу наполненных капсул (в пределах ±10%, менее 0,3 г), скорость растворения отвечала требованиям, потом положили проверенные с положительными результатами капсулы в фармацевтическую полировочную машину, куда наливали жидкий парафин для проведения полирования в течение 15-20 мин, далее вынимали, проводили упаковку конечных продуктов и проверку.

Пример 12 Дражированные таблетки Левовращающий изовалерил-спирамицин I (1000 таблеток)

Рецептура: то же, как Пример 10.

Технология приготовления: согласно Примеру 11 положили годные таблетки-ядра в сосуд для нанесения сахарного слоя, медленно положили приготовленный сахарный сироп (концентрация 65-70%) в сосуд, постепенно повышали температуру до 40°C, добавляли умеренное количество талькового порошка, осушали несколько раз подачей воздуха по 25-30 мин, после выравнивания талькового слоя, покрывали сахарным слоем в течение 15-20 мин, после выравнивания сахарного слоя наносили покровный слой нужного цвета, положили приготовленную густотертую краску в сахарный сироп, равномерно перемешивали и положили в сосуд, повторяли процесс перемешивания по 15-20 мин.

Пример 13. Сахарный сироп Левовращающий изовалерил-спирамицин I (1000 пакетов)

Рецептура:

сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина 1125 г лимонная кислота (0,5%) (лимоннокислота) 1,5 г сахароза общий вес - вес прочих сырья и вспомогательных материалов общий вес примерно 50 г пигмент (куркумин) примерно 0,1 г

Технология приготовления: измельчали сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина I, лимонную кислоту и сахарозу высокоскоростным измельчителем до частицы, рассеивали 85% частиц на сите в 300 меш, 15% - на сите в 180 меш, далее взвешивали измельченный мелкозернистый порошок по рецептуре и равномерно перемешивали в течение 1-1,5 ч, определяли содержание и рассчитывали вместимость (теоретическая вместимость 500 мг /пакет), далее вмещали смесь в упаковочную машину, устанавливали алюминиевую фольгу, сортировали согласно требованиям к эксплуатации сортировочной машины, разница вместимости в пределах ±5%, после этого проверяли и проводили наружную упаковку.

Пример 14. Кишечно-растворимая таблетка Левовращающий изовалерил-спирамицин I (1000 таблеток)

Рецептура: то же, как Пример 10.

Технология приготовления: таблетки-ядра приготавливали по Примеру 5, положили годные таблетки-ядра в сосуд для нанесения сахарного слоя, покрывали трем нижним слоем с помощью сахарного сиропа концентрацией 60~70% и талькового порошка, потом покрывали изоляционным слоем, добавляли 10%-спиртовый раствор зеина, продували вращением в течение 10-15 мин, далее закапывали в сосуд диэтилфталат, ацетон, ацетатфталат целлюлозы, спиртовой раствор, т.е. кишечно-растворимый раствор, 2-3 раза продували вращением в течение 10-15 мин. После проверки с получением положительных результатов покрывали слоем сахара по Примеру 13.

Пример 15. Желудочно-растворимая таблетка Левовращающий изовалерил-спирамицин I (1000 таблеток)

Рецептура: то же, как Пример 10.

Технология приготовления: таблетки-ядра приготавливали по Примеру 11, положили годные таблетки-ядра в высокоэффективную машину для нанесения покровного слоя, потом приготавливали из годного порошка (включая липорастворимый и водорастворимый порошок) раствор для нанесения покровного слоя, далее положили раствор для нанесения покровного слоя в коллоид, измельчали и фильтровали. Подогревали высокоэффективный сосуд для нанесения покровного слоя с загруженными таблетками-ядрами при скорости вращения в пределах 5-10 р/мин и температуре в пределах 45-60°C, опрыскивали аэрозольным соплом (более 300 меш) в сосуд раствор для нанесения покровного слоя, потом осушали 8-12 раз по 25-35 мин до равномерного нанесения, осушали естественным способом, проверяли и упаковывали.

Пример 16. Гранулы Левовращающий изовалерил-спирамицин I (1000 пакетов)

Рецептура:

сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина 1125 г сахарная пудра 2000 г декстрин 900 г 5%PVP-K30 в умеренном количестве

Технология приготовления: рассеивали сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина I, сахарную пудру и декстрин на сите в 120, взвешивали левовращающий изовалерил-спирамицин I, сахарную пудру и декстрин согласно рецепту и равномерно перемешивали, приготавливали мягкий агент из равномерно перемешенных вышеуказанных материалов с помощью плазмагеля 5%PVP-K30, осушали и формировали колеблющие гранулы при 70°C, проверяли с положительными результатами и проводили сортировку.

Пример 17. Приготовление раствора для инъекций Левовращающий изовалерил-спирамицин II.

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин II 100 мг с адипиновой кислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, и получали желтоватый прозрачный раствор уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Проводили заправку, герметизацию, стерилизацию, проверку и упаковку в стерильных условиях.

Пример 18. Приготовление раствора для инъекций Левовращающий изовалерил-спирамицин II.

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин II 100 мг с лимоннокислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистиллированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор, уровнем рН 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Проводили заправку, герметизацию, стерилизацию, проверку и упаковку в стерильных условиях.

Пример 19. Приготовление порошка для инъекций Левовращающий изовалерил-спирамицин II.

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин II 100 мг с лимоннокислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор, уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Добавляли маннитол 30-150 мг в качестве расклинивающего агента лиофилизированного порошка, быстро замораживали в течение 9 ч в криогенном режиме, замораживали и осушали, получали желтоватый рыхлый массив, устанавливали крышку, проверяли и упаковывали в стерильных условиях.

Пример 20. Таблетки Левовращающий изовалерил-спирамицин II (1000 таблеток)

Рецептура:

левовращающий изовалерил-спирамицин II 100 г оксипропилцеллюлоза с низкой степенью замещения (5%) 9,25 г карбоксиметил-крахмал натрия (3%) 5,55 г стеариновый магний (1%) 1,85 г крахмал общий вес - вес прочих сырья и вспомогательных материалов общий вес 185 г

Технология приготовления: взвешивали крахмал в подходящем количестве, растворяли до концентрации 15%, нагревали до пастообразного состояния, чтобы получить связитель; просеивали на сите в 100 меш основное сырье Карримицин (Carrimycin), вспомогательные материалы - крахмал, оксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, карбоксиметил-крахмал натрия, и стеарат магния, взвешивали основное сырье и вспомогательные материалы в необходимом количестве согласно рецепту; равномерно перемешивали левовращающий изовалерил-спирамицин II, крахмал и оксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, приготавливали мягкий агент с помощью крахмальной пасты концентрацией крахмала 15%, гранулировали на сите в 14 меш, осушали при 50-60°C, обеспечивали влажность в пределах 3-5%, формировали гранулы на сите в 14 меш, добавляли карбоксиметил-крахмал натрия и стеариновый магний, и перемешивали, определяли содержание частиц; согласно содержанию частиц рассчитывали вес таблетки, таблетировал (шампон диаметром 9 мм с неглубокой впадиной), проверяли разницу веса таблетки; после получения положительных результатов проводили упаковку.

Пример 21. Желатиновые капсулы Левовращающий изовалерил-спирамицин II (1000 капсул)

Рецептура:

сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина II 100 г крахмал (фармацевтический) 108 - вес сырого порошка левовращающегоизовалерил-спирами цина II фармацевтическая капсула #3 100 шт. жидкий парафин 5 мл

Технология приготовления: взвешивали основное сырье - левовращающий изовалерил-спирамицин II и вспомогательные материалы - фармацевтический крахмал согласно рецепту, положили в миксер и равномерно перемешивали в течение 1,5-2 ч; отобрали пробы и проверяли содержание, результаты должны принципиально соответствовать теоретическим данным (содержимое в каждой капсуле примерно 0,105 г), положили проверенные с положительными результатами фармацевтические капсулы #3 и перемешанную смесь в загрузочный аппарат для наполнения капсул согласно требованиям к эксплуатации автоматизированной капсулонаполнительной машины, проверяли разницу наполненных капсул (в пределах ±10%, менее 0,3 г), скорость растворения отвечала требованиям, потом положили проверенные с положительными результатами капсулы в фармацевтическую полировочную машину, куда наливали жидкий парафин для проведения полирования в течение 15-20 мин, далее вынимали, проводили упаковку конечных продуктов и проверку.

Пример 22. Приготовление раствора для инъекций Изовалерил-спирамицин III

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин III 100 мг с малеиновой кислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Проводили заправку, герметизацию, стерилизацию, проверку и упаковку в стерильных условиях.

Пример 23. Приготовление порошка для инъекций Левовращающий изовалерил-спирамицин III

(1) Равномерно перемешивали изовалерил-спирамицин III 100 мг с малеиновой кислотой эквимолекулярных количеств, растворяли в дистилированной воде 1-5 мл, получали желтоватый прозрачный раствор уровнем pH 4,6-5,6.

(2) Наливали активный уголь 0,1% (объем) в приготовленный по п.(1) раствор и фильтровали.

(3) Добавляли маннитол 30-150 мг в качестве расклинивающего агента лиофилизированного порошка, быстро замораживали в течение 9 ч в криогенном режиме, замораживали и осушали, получали желтоватый рыхлый массив, устанавливали крышку, проверяли и упаковывали в стерильных условиях.

Пример 24. Желатиновые капсулы Левовращающий изовалерил-спирамицин III (1000 капсул)

Рецептура:

сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина III 100 г крахмал (фармацевтический) 108 г - вес сырого порошка левовращающего изовалерил-спирамицина III   фармацевтическая капсула #3 100 шт. жидкий парафин 5 мл

Технология приготовления: взвешивали основное сырье - левовращающий изовалерил-спирамицин III и вспомогательные материалы - фармацевтический крахмал согласно рецепту, положили в миксер и равномерно перемешивали в течение 1,5-2 ч; отобрали пробы и проверяли содержание, результаты должны принципиально соответствовать теоретическим данным (содержимое в каждой капсуле примерно 0,105 г), положили проверенные с положительными результатами фармацевтические капсулы #3 и перемешанную смесь в загрузочный аппарат для наполнения капсул согласно требованиям к эксплуатации автоматизированной капсулонаполнительной машины, проверяли разницу наполненных капсул (в пределах ±10%, менее 0,3 г), скорость растворения отвечала требованиям, потом положили проверенные с положительными результатами капсулы в фармацевтическую полировочную машину, куда наливали жидкий парафин для проведения полирования в течение 15-20 мин, далее вынимали, проводили упаковку конечных продуктов и проверку.

Пример 25. Сахарный сироп Левовращающий изовалерил-спирамицин III (1000 пакетов)

Рецептура:

сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина III 125 г лимонная кислота (0,5%) (лимоннокислота) 1,5 г сахароза общий вес - вес прочих сырья и вспомогательных материалов общий вес примерно 50 г пигмент (куркумин) примерно 0,1 г

Технология приготовления: измельчали сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина III, лимонную кислоту и сахарозу высокоскоростным измельчителем до частицы, рассеивали 85% частиц на сите в 300 меш, 15% - на сите в 180, далее взвешивали измельченный мелкозернистый порошок по рецепту и равномерно перемешивали в течение 1-1,5 ч, определяли содержание и рассчитывали вместимость (теоретическая вместимость 500 мг/пакет), далее вмещали смесь в упаковочную машину, устанавливали алюминиевую фольгу, сортировали согласно требованиям к эксплуатации сортировочной машины, разница вместимости в пределах ±5%, после этого проверяли и проводили наружную упаковку.

Пример 26. Гранулы Левовращающий изовалерил-спирамицин III (1000 пакетов)

Рецептура:

сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина III 125 г сахарная пудра 2000 г декстрин 900 г 5%PVP-K30 в умеренном количестве

Технология приготовления: рассеивали сырой порошок левовращающего изовалерил-спирамицина III, сахарную пудру и декстрин на сите в 120, взвешивали левовращающий изовалерил-спирамицин III, сахарную пудру и декстрин согласно рецепту и равномерно перемешивали, приготавливали мягкий агент из равномерно перемешенных вышеуказанных материалов с помощью плазмагеля 5%PVP-K30, осушали и формировали колеблющие гранулы при 70°C, проверяли с положительными результатами и проводили сортировку.

Пример 27.

Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина I, полученных по Примеру 1.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина I, полученные по Примеру 1, в смеси растворителей этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема этилацетата к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляло 1:10:1;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 2,5 раза больше суммы объема этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 4 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 30 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 5°С, скорость понижения температуры 1°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 10 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I.

Порошковая рентгеновская дифракция полученных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I, измеренная Cu-Kα-лучами, показывала характеристический пик при 20, равном, 7,6°, 8,0°, 10,0°, 11,4°, 16,4°, 17,0°, 17,5°, 17,9°, 19,5°, 22,7°, 23,7° и 24,4°, диаграмма порошковой рентгеновской дифракции показана на Рис.5.

Пример 28.

Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина I, полученных по Примеру 1.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина I в смеси растворителей этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема этилацетата к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляло 1:10:1;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 9 раз больше суммы объема этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 10 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 60 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 15°C, скорость понижения температуры 3°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 10 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I, измеренная Cu-Kα-лучами аналогична Рис.5.

Пример 29. Приготовление раствора для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, полученные по Примеру 27, для приготовления раствора для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 30. Приготовление порошка для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, полученные по Примеру 28, для приготовления порошка для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 31. Приготовление таблеток кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина I

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, полученные по Примеру 27, для приготовления таблеток по вышеуказанному способу.

Пример 32. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученных по Примеру 1.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина И, полученные по Примеру 1, в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему безводного ацетона и к объему абсолютного этилового спирта составляло 1:10:1;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 2.5 раза больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 4 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 30 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 5°С, скорость понижения температуры 1°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 10 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II.

Порошковая рентгеновская дифракция полученных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, измеренная Cu-Kα-лучами, показывала характеристический пик при 2θ, равном, 10,0°, 11,6°, 16,4°, 17,3°, 19,1°, 21,2°, 22,1°, 22,7°, 26,4°, 26,9°, 27,5° и 31,5°, диаграмма порошковой рентгеновской дифракции показана на Рис.6.

Пример 33. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученных по Примеру 1.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина II в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему безводного ацетона и к объему абсолютного этилового спирта составляло 1:10:0,8;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 9 раз больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 10 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 60 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 15°C, скорость понижения температуры 3°С в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 10 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина И.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, измеренная Cu-Kα-лучами аналогична Рис.6.

Пример 34

Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученных по Примеру 2.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина II в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему безводного ацетона и к объему абсолютного этилового спирта составляло 1:5:1;

2. Наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 7.5 раза больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 6 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 40 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 10°C, скорость понижения температуры 2°С в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 15 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, измеренная Cu-Kα-лучами аналогична Рис.6.

Пример 35. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего

изовалерил-спирамицина II, полученных по Примеру 3.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина II в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему безводного ацетона и к объему абсолютного этилового спирта составляло 1:3:1;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 7,5 раза больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 8 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 45 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 12°C, скорость понижения температуры 2,5°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 20 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, измеренная Cu-Kα-лучами аналогична Рис.6. Пример 36. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученных по Примеру 3.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина II в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему безводного ацетона и к объему абсолютного этилового спирта составляло 1:6:0,8;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 5 раз больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 7 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 60 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 12°C, скорость понижения температуры 1,2°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 15 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II, измеренная Cu-Kα-лучами аналогична Рис.5.

Пример 37. Приготовление раствора для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученные по Примеру 34, для приготовления раствора для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 38. Приготовление раствора для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученные по Примеру 33, для приготовления раствора для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 39. Приготовление порошка для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученные по Примеру 36, для приготовления порошка для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 40. Приготовление порошка для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученные по Примеру 35, для приготовления порошка для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 41. Приготовление таблеток кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученные по Примеру 36, для приготовления таблеток по вышеуказанному способу.

Пример 42. Приготовление желатиновых капсул кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученные по Примеру 32, для приготовления желатиновых капсул по вышеуказанному способу.

Пример 43. Приготовление гранул кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина II

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, полученные по Примеру 33, для приготовления гранул по вышеуказанному способу.

Пример 44. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученных по Примеру 1.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученные по Примеру 1, в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляет 1:10:1;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 2.5 раза больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 4 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 30 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 5°C, скорость понижения температуры 1°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 10 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Порошковая рентгеновская дифракция полученных кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III, измеренная Cu-Kα-лучами, показывала характеристический пик при 2θ, равном, 8,0°, 10,0°, 11,2°, 11,7°, 16,4°, 19,1°, 19,6°, 20,0°, 21,4°, 22,9°, 23,6° и 29,4°, диаграмма порошковой рентгеновской дифракции показана на Рис.7.

Пример 45. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученных по Примеру 2.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина III в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляет 1:10:1;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 9 раз больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 10 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 60 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 15°C, скорость понижения температуры 3°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 10 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III, измеренная Cu-Kα-лучами, аналогична Рис.7.

Пример 46. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученных по Примеру 2.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III: 1 Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина III в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляет 1:5:0,8;

2 Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 7,5 раза больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 6 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 40 р/мин;

3 После налива очищенной воды температура снижалась до 10°C, скорость понижения температуры 2°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 15 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III, измеренная Cu-Кα-лучами аналогична Рис.7.

Пример 47. Приготовление кристаллов из белых порошковых частиц левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученных по Примеру 3.

Способ приготовления кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III:

1. Растворяли твердые частицы левовращающего изовалерил-спирамицина III в смеси растворителей безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, в примененной смеси растворителей отношение объема безводного метанола к объему абсолютного этилового спирта и к объему безводного ацетона составляет 1:2:1;

2. Потом наливали очищенную воду с одновременным перемешиванием, объем налитой воды в 7.5 раза больше суммы объема безводного метанола, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, скорость ввода очищенной воды 8 мл/мин; скорость перемешивания при наливе очищенной воды 45 р/мин;

3. После налива очищенной воды температура снижалась до 12°C, скорость понижения температуры 2,5°C в час, при этом продолжали перемешивание скоростью 20 р/мин; таким образом, получали кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III.

Диаграмма порошковой рентгеновской дифракции кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III, измеренная Cu-Кα-лучами, аналогична Рис.7.

Пример 48. Приготовление раствора для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученные по Примеру 44, для приготовления раствора для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 49. Приготовление порошка для инъекций кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученные по Примеру 45, для приготовления порошка для инъекций по вышеуказанному способу.

Пример 50. Приготовление таблеток кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученные по Примеру 46, для приготовления таблеток по вышеуказанному способу.

Пример 51. Приготовление желатиновых капсул кристаллов левовращающего изовалерил-спирамицина III

Применяли кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, полученные по Примеру 47, для приготовления желатиновых капсул по вышеуказанному способу. Опытный пример 1 Испытание на острую токсичность левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III

I. Метод испытания

Введение через рот лекарств (левовращающие изовалерил-спирамицины I, II, III, полученные по Примеру 1) мышам и крысам

До испытания мыши и крысы находились под наблюдением 2 дня, и те, у которых не была обнаружена аномалия, стали подопытными. До испытания мыши и крысы прошли голодание на ночь. Результаты предварительных испытаний показали, что введение лекарства в дозе 4000 мг/кг прямо в желудок мышей и крыс не вызывало гибель подопытных животных. Ввели лекарство в дозе 4000 мг/кг прямо в желудок мышей и крыс, мышам по 100 мг/мл, объем раствора, вводимого в желудок 0,6-0,8 мл/особь; крысам по 173 мг/мл, объем раствора, вводимого в желудок 0,8-1,0 мл/50 г. Наблюдали токсическую реакцию и число гибели животных в течение одной недели после введения лекарства в желудок.

II. Результаты испытания приведены на табл.1 и табл.2.

Табл.1 Острая токсичность при введении через рот для мыши (LD₅₀) Испытуемые средства Доза (мг/кг) Число животных (особь) Число погибших животных (особь) Смертность (%) LD₅₀ (мг/кг) Левовращающий изовалерил-спирамицин I 4000 20 7 35 >4000 Левовращающий изовалерил-спирамицин II 4000 20 7 35 >4000 Левовращающий изовалерил-спирамицин III 4000 20 7 35 >4000 Табл.2 Острая токсичность при введении через рот для крыс (LD₅₀) Испытуемые средства Доза (мг/кг) Число животных (особь) Число погибших животных (особь) Смертность (%) LD₅₀ (мг/кг) Левовращающий изовалерил-спирамицин I 4500 20 3 15 >4500 Левовращающий 4500 20 3 15 >4500

изовалерил-спирамицин II           Левовращающий изовалерил-спирамицин III 4500 20 3 15 >4500

Левовращающие изовалерил-спирамицины I, II, III или препараты левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III, приготовленные для остальных примеров изобретения, прошли одинаковые испытания и дали аналогичные результаты.

Опытный пример 2

Эффективность препарата левовращающих изовалерил-спирамицинов III, III и их кристаллов in vivo

Метод испытания: приготовление раствора с заразными бактериями: взяли раствор с тестовыми бактериями, хранившийся в холодильнике при -80°C, оставили при комнатной температуре в течение 1 ч, взяли по 0,1 мл раствор с бактериями пневмококк, stpeptococcus pyogenes, энтерококк и засеяли в 2 мл раствор МН соответственно (с добавкой 10% инактивированной лошадиной сыворотки), засеяли раствор с золотистым стафилококком 0,1 мл в раствор МН 2 мл по вышеуказанному способу, положили в инкубатор 37°C и культивировали в течение 18 ч, получили основной раствор с бактериями, его растворяли 5% желудочной слизью и получили раствор с заразными бактериями, который стал летальной дозой (ЛД100).

Предполагается пероральное применение Карримицина (Carrimycin) в клинике, поэтому для испытания Карримицина (Carrimycin) выбирают введение прямо в желудок. Левовращающий изовалерил-спирамицин I (полученный по Примеру 1), кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I (полученные по Примеру 27) ввели внутримышечно.

После введения в брюшную полость мышей 0,5 мл в летальной дозе животные проявляли заметное понижение двигательной активности, покой, взъерошенную шерсть и другие симптомы. После заражения ввели лекарства в дозе 0,2 мл прямо в желудок каждой мыши через 0,5-6 ч, не было никаких неблагоприятных воздействий. Наблюдали смертность особей в течение 7 дней, рассчитали среднюю эффективную дозу (ED₅₀) лекарственных форм для зараженных мышей, используя программу Bliss, провели сравнение защитной эффективности с другими формами.

Результаты теста in vivo:

Табл.3   Сравнение терапевтической эффективности 5 видов антибиотиков у мышей, зараженных 6 штаммами Стрептококк в брюшной полости  

Испытуемые грибы Ударная доза (CFU/0,5 мл/мышь) Лекарственные средства MIC (цг/мл) ED₅₀ (мг/кг) Пневмококк 3 6,4×104 изовалерил-спрамицин I 0,12 9,73 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,12 8,39 Карримицин (Carrimycin) 0,12 10,41 Азитромицин 0,12 18,29 ацетилспирамицин 0,5 66,96 эритромицин 1 85,08 Пневмококк 18 9,6×104 изовалерил-спрамицин I 0,03 9,51 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,03 8,65 Карримицин (Carrimycin) 0,03 10,06 Азитромицин 0,06 14,87 ацетилспирамицин 0,06 37,93 эритромицин 0,06 57,08 Пневмококк 57 8,8×104 изовалерил-спрамицин I 0,06 13,86 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,06 12,82 Карримицин (Carrimycin) 0,12 16,02 Азитромицин 0,12 19,02 ацетилспирамицин 1 398,01 эритромицин 10,25 102,33 Streptococcus pyogenes 772 6,9×103 изовалерил-спрамицин I 0,06 26,15 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,06 23,37 Карримицин (Carrimycin) 0,12 26,30 Азитромицин 0,25 46,89 ацетилспирамицин 0,25 98,11 эритромицин 0,5 101,33 Streptococcus pyogenes 102 7,8×104 изовалерил-спрамицин I 0,12 66,40 Кристаллы изовалерил-спирамицина I) 0,12 60,99 Карримицин (Carrimycin 0,25 87,84 Азитромицин 0,5 159,06 ацетилспирамицин 0,5 227,07 эритромицин 0,5 361,01 Streptococcus pyogenes 119 4,9×104 изовалерил-спрамицин I 0,12 57,25 Кристаллы изовалерил-спирамицина 1 0,12 54,58 Карримицин (Carrimycin) 0,5 117,53 Азитромицин 0,25 68,48 ацетилспирамицин 0,25 68,48 эритромицин 0,5 233,72

Табл.4 Сравнение терапевтической эффективности 5 видов антибиотиков у мышей, зараженных 6 штаммами Стрептококк в брюшной полости Испытуемые грибы Ударная доза (CFU/0,5 мл/мышь) Лекарственные средства MIC (цг/мл) ED₅₀ (мг/кг)

Энтерококк 32 5,4×104 изовалерил-спрамицин I 0,5 77,55 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,5 62,11 Карримицин (Carrimycin) 0,5 89,29 Азитромицин 1 146,51 ацетилспирамицин 1 130,34 эритромицин 2 175,23 Золотистый стафилококк 16 5,2×103 изовалерил-спрамицин I 0,5 23,54 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,5 21,33 Карримицин (Carrimycin) 0,5 31,98 Азитромицин 0,5 31,98 ацетилспирамицин 1 43,58 эритромицин 1 82,36 Золотистый стафилококк 76 5,8×104 изовалерил-спрамицин I 0,5 24,40 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,5 22,26 Карримицин (Carrimycin) 0,5 31,50 Азитромицин 1 58,79 ацетилспирамицин 1 66,63 эритромицин 1 64,17 Золотистый стафилококк 12 4,8×104 изовалерил-спрамицин I 1 110,24 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 1 107,46 Карримицин (Carrimycin) 2 120,35 Азитромицин 2 120,35 ацетилспирамицин 2048 >500 эритромицин 256 266,11 Золотистый стафилококк 21 4,2×104 изовалерил-спрамицин I 0,5 42,67 Кристаллы изовалерил-спирамицина I 0,5 38,00 Карримицин (Carrimycin) 1 59,30 Азитромицин 4 142,99 ацетилспирамицин 2048 >500 эритромицин   213,67

Результаты теста in vivo:

Терапевтическая эффективность изовалерил-спирамицина I при лечении мышей, зараженных 12 штаммами бактерий, приведена на табл.3 и табл.4, что показало благоприятную защитную эффективность; а кристаллы изовалерил-спирамицина I проявляли более благоприятную защитную эффективность у мышей, зараженных 12 штаммами бактерий.

Левовращающий изовалерил-спирамицин I, кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I или препараты, содержащие левовращающий изовалерил-спирамицин I или кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина I, приготовленные для остальных примеров изобретения, прошли одинаковые испытания и дали аналогичные результаты.

Опытный пример 3: Эффективность препарата левовращающего

изовалерил-спирамицина II и его кристаллов in vivo

Применяли левовращающий изовалерил-спирамицин II, приготовленный по Примеру 1, и кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, приготовленные по Примеру 36, и способ испытания, приведенный в Опытном примере 2.

Результаты теста in vivo приведены на табл.5 и табл.6.

Табл.5 Сравнение терапевтической эффективности 5 видов антибиотиков у мышей, зараженных 6 штаммами Стрептококк в брюшной полости Испытуемые грибы Ударная доза (CFU/0,5 мл/мышь) Лекарственные средства MIC (цг/мл) ED₅₀ (мг/кг) Пневмококк 3 6,4×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,12 8,99 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,12 7,69 Карримицин (Carrimycin) Азитромицин 0,12 0,12 10,41 18,29 ацетилспирамицин 0,5 66,96 эритромицин 1 85,08 Пневмококк 18 9,6×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,03 8,98 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,03 8,09 Карримицин (Carrimycin) Азитромицин 0,03 0,06 10,06 14,87 ацетилспирамицин 0,06 37,93 эритромицин 0,06 57,08 Пневмококк 57 8,8×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,06 13,10 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,06 12,04 Карримицин (Carrimycin) Азитромицин 0,12 0,12 16,02 19,02 ацетилспирамицин 1 398,01 эритромицин 0,25 102,33 Streptococcus
pyogenes 772 6,9×10³ Изовалерил-спрамицин II 0,06 24,61 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,06 21,90 Карримицин (Carrimycin) 0,12 26,30 Азитромицин 0,25 46,89 ацетилспирамицин 0,25 98,11 эритромицин 0,5 101,33 Streptococcus
pyogenes 102 7,8×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,12 63,21 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,12 58,00 Карримицин (Carrimycin) 0,25 87,84 Азитромицин 0,5 159,06 ацетилспирамицин 0,5 227,07 эритромицин 0,5 361,01

Streptococcus pyogenes 119 4,9×10⁴ Изовалерил-спрамицин 11 0,12 52,77 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,12 49,94 Карримицин (Carrimycin) 0,25 68,48 Азитромицин 0,25 68,48 ацетилспирамицин 0,5 117,53 эритромицин 0,5 233,72

Табл.6 Сравнение терапевтической эффективности 5 видов антибиотиков у мышей, зараженных энтерококком и золотистым стафилококком в брюшной полости Испытуемые грибы Ударная доза (CFU/0,5 мл/мышь) Лекарственные средства MIC (цг/мл) ED₅₀ (мг/кг) Энтерококк 32 5,4×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,25 70,16 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,25 56,16 Карримицин (Carrimycin) 0,5 89,29 Азитромицин 1 146,51 ацетилспирамицин 1 130,34 эритромицин 2 175,23 Золотистый стафилококк 16 5,2×10³ Изовалерил-спрамицин II 0,25 20,87 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,25 16,18 Карримицин (Carrimycin) 0,5 31,98 Азитромицин 0,5 31,98 ацетилспирамицин 1 43,58 эритромицин 1 82,36 Золотистый стафилококк 76 5,8×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,25 22,26 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,25 18,71 Карримицин (Carrimycin) 0,5 31,50 Азитромицин 1 58,79 ацетилспирамицин 1 66,63 эритромицин 1 64,17 Золотистый стафилококк 12 4,8×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 1 108,04 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 1 104,67 Карримицин (Carrimycin) 2 120,35 Азитромицин 2 120,35 ацетилспирамицин 2048 >500 эритромицин 256 266,11 Золотистый стафилококк 21 4,2×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,5 38,90 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,5 36,09 Карримицин (Carrimycin) 1 59,30 Азитромицин 4 142,99 ацетилспирамицин 2048 >500 эритромицин 4 213,67

Результаты теста in vivo:

Терапевтическая эффективность кристаллов изовалерил-спирамицина II при лечении мышей, зараженных 12 штаммами бактерий, приведена на табл.13 и табл.14, что проявляло благоприятную защитную эффективность и превосходство перед изовалерил-спирамицином II.

Кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II или препараты, содержащие кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина II, приготовленные для остальных примеров изобретения, прошли одинаковые испытания и дали аналогичные результаты.

Опытный пример 4.

Эффективность препарата левовращающего

изовалерил-спирамицина III и его кристаллов in vivo

Применяли левовращающий изовалерил-спирамицин III, приготовленный по Примеру 1, и кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, приготовленные по Примеру 45, и способ испытания, приведенный в Опытном примере 2.

Результаты теста in vivo приведены на табл.7 и табл.8:

Табл.7 Сравнение терапевтической эффективности 5 видов антибиотиков у мышей, зараженных 6 штаммами Стрептококк в брюшной полости Испытуемые грибы Ударная доза (CFU/0,5 мл/мышь) Лекарственные средства MIC (цг/мл) ED₅₀ (мг/кг) Пневмококк 3 6,4×10⁴ изовалерил-спрамицин III 0,12 8,99 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,12 6,45 Карримицин (Carrimycin) Азитромицин 0,12 0,12 10,41 18,29 ацетилспирамицин 0,5 66,96 эритромицин 1 85,08 Пневмококк 18 9,6×10⁴ изовалерил-спрамицин III 0,03 8,98 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,03 8,68 Карримицин (Carrimycin) Азитромицин 0,03 0,06 10,06 14,87 ацетилспирамицин 0,06 37,93 эритромицин 0,06 57,08 Пневмококк 57 8,8×10⁴ Изовалерил-спрамицин II 0,06 13,10 Кристаллы изовалерил-спирамицина II 0,06 11,08 Карримицин (Carrimycin) Азитромицин 0,12 0,12 16,02 19,02 ацетилспирамицин 1 398,01 эритромицин 0,25 102,33 Streptococcus pyogenes 772 6,9×10³ изовалерил-спрамицин III 0,06 24,61 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,06 22,81 Карримицин (Carrimycin) 0,12 26,30 Азитромицин 0,25 46,89 ацетилспирамицин 0,25 98,11 ¹ эритромицин 0,5 101,33 Streptococcus pyogenes 102 7,8×10⁴ изовалерил-спрамицин III 0,12 63,21 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,12 52,91 Карримицин (Carrimycin) 0,25 87,84 Азитромицин 0,5 159,06 ацетилспирамицин 0,5 227,07 эритромицин 0,5 361,01

Streptococcus pyogenes 119 4,9×10⁴ изовалерил-спрамицин III 0,12 52,77 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,12 49,94 Карримицин (Carrimycin) 0,25 68,48 Азитромицин 0,25 68,48 ацетилспирамицин 0,5 117,53 эритромицин 0,5 233,72

Табл.8: Сравнение терапевтической эффективности 5 видов антибиотиков у мышей, зараженных энтерококком и золотистым стафилококком в брюшной полости Испытуемые грибы Ударная доза (CFU/0,5 мл/мышь) Лекарственные средства MIC (иг/мл) ED₅₀ (мг/кг) Энтерококк 32 5,4×10⁴ изовалерил-спрамицин III 0,25 70,16 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,25 65,89 Карримицин (Carrimycin) 0,5 89,29 Азитромицин 1 146,51 ацетилспирамицин 1 130,34 эритромицин 2 175,23 Золотистый стафилококк 16 5,2×10³ изовалерил-спрамицин III 0,25 20,87 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,25 19,29 Карримицин (Carrimycin) 0,5 31,98 Азитромицин 0,5 31,98 ацетилспирамицин 1 43,58 эритромицин 1 82,36 Золотистый стафилококк 76 5,8×10⁴ изовалерил-спрамицин III 0,25 22,26 Кристаллы изовалерил-спирамицина III) 0,25 18,71 Карримицин (Carrimycin 0,5 31,50 Азитромицин 1 58,79 ацетилспирамицин 1 66,63 эритромицин 1 64,17 Золотистый стафилококк 12 4,8×10⁴ изовалерил-спрамицин III 1 108,04 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 1 105,24 Карримицин (Carrimycin) 2 120,35 Азитромицин 2 120,35 ацетилспирамицин 2048 >500 эритромицин 256 266,11 Золотистый стафилококк 21 4,2×10⁴ изовалерил-спрамицин III 0,5 38,90 Кристаллы изовалерил-спирамицина III 0,5 36,09 Карримицин (Carrimycin) 1 59,30 Азитромицин 4 142,99 ацетилспирамицин 2048 >500 эритромицин 4 213,67

Результаты теста in vivo:

Терапевтическая эффективность кристаллов изовалерил-спирамицина III при лечении мышей, зараженных 12 штаммами бактерий, приведена на табл.7 и табл.8, что проявляло благоприятную защитную эффективность и превосходство перед изовалерил-спирамицином III.

Кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III или препараты, содержащие кристаллы левовращающего изовалерил-спирамицина III, приготовленные для остальных примеров изобретения, прошли одинаковые испытания и дали аналогичные результаты. Опытный пример 5

Тест in vitro

I. Определение клинически дислоцированных бактерий:

Метод испытания: применение метода двойного разбавления в плоскодонном сосуде: налили плавленый агар в определенном количестве в плоскодонный сосуд с различной концентрацией лекарственных средств, равномерно перемешали с лекарственным раствором (добавили стрептококк и энтерококк в 5% дефибринированную кровь овцы для получения кровяной питательной среды, гемофильную палочку в 7% дефибринированную кровь овцы для получения кровяной питательной среды, питательную среду с нейссерией гонорея в 7% дефибринированную кровь овцы для получения шоколадной питательной среды), после затвердения, растворили свежий культивированный раствор с бактериями до 10⁶ CFU/мл, засеяли многоточечным шприцем в агар плоскодонного сосуда, содержащий антибактериальные лекарственные средства, культивировали в течение 18 ч при 37°C; культивировали нейссерию гонорея в 5% CO₂ инкубаторе в течение 24 ч; культивировали легионеллу в 5% CO₂ инкубаторе в течение 48 ч; культивировали анаэробную бактерию в анаэробной банке в течение 48 ч при 37°C. Наблюдали минимальную ингибирующую концентрацию, при которой антибактериальные средства смогут ингибировать выращивание бактерий, т.е. минимальную бактериостатическую концентрацию (MIC), рассчитали MIC50 и MIC90 средства и провели сравнение с контрольными лекарственными средствами.

Примечание: MIC50 - 50% минимальная ингибирующая концентрация;

MIC₉₀ - 90% минимальная ингибирующая концентрация.

Результаты испытания приведены на табл.9

Табл.9 Сравнение распространения чувствительности бактерий, клинически диссоцированных изовалерил-спирамицинами I, II, III и других антибиотиков Бактерии и количество Лекарственные средства Диапазон MIC (цг/мл) MIC50 (цг/мл) MIC90 (цг/мл) Пневмококк 012) изовалерил-спрамицин I 0,005->32 0,12 2 Изовалерил-спрамицин II 0,005->32 0,12 2 изовалерил-спрамицин III 0,005->64 0,12 4 Карримицин (Carrimycin) 0,005->64 0,12 4 Азитромицин 0,005->64 0,25 8 ацетилспирамицин 0,005->64 0,12 >64 эритромицин 0,005->64 0,25 64 Streptococcus pyogenes изовалерил-спрамицин I 0,06->32 0,25 32

Бактерии и количество Лекарственные средства Диапазон MIC (цг/мл) MIC50 (цг/мл) MIC90 (цг/мл) (93) Изовалерил-спрамицин II 0,06->32 0,25 32 изовалерил-спрамицин III 0,06->32 0,25 32 Карримицин (Carrimycin) 0,06->64 0,25 64 Азитромицин 0,25->64 0,5 >64 ацетилспирамицин 0,005->64 0,25 >64 эритромицин 0,06->64 0,5 >64 Энтерококк (106) изовалерил-спрамицин I 0,12->32 1 32 Изовалерил-спрамицин II 0,12->32 1 16 изовалерил-спрамицин III 0,12->64 2 64 Карримицин (Carrimycin) 0,5->64 2 64 Азитромицин 0,25->64 8 >64 ацетилспирамицин 0,12->64 4 >64 эритромицин 0,5->64 4 >64 Золотистый стафилококк (155) изовалерил-спрамицин I 0,06->64 1 64 Изовалерил-спрамицин II 0,06->64 1 32 изовалерил-спрамицин III 0,06->64 2 32 Карримицин (Carrimycin) 0,06->64 2 64 Азитромицин 0,5->64 2 >64 ацетилспирамицин 0,12->64 64 >64 эритромицин 0,12->64 1 >64 Эпидермальный стафилококк (115) изовалерил-спрамицин I 0,12->32 1 32 Изовалерил-спрамицин II 0,12->64 1 64 изовалерил-спрамицин III 0,12->32 1 32 Карримицин (Carrimycin) 0,12->64 2 >64 Азитромицин 0,12->64 8 >64 ацетилспирамицин 0,03->64 64 >64 эритромицин 0,06->64 8 >64 Гемофильная палочка (37) изовалерил-спрамицин I 0,03-32 0,12 1 Изовалерил-спрамицин II 0,03-32 0,12 1 изовалерил-спрамицин III 0,03-32 0,12 1 Карримицин (Carrimycin) 0,03-32 0,12 1 Азитромицин 0,03->64 0,25 2 ацетилспирамицин 0,03->64 0,12 4 эритромицин 0,03->64 0,06 32 Нейссерия гонорея (10) изовалерил-спрамицин I 0,12-16 1 4 Изовалерил-спрамицин II 0,12-16 1 4 изовалерил-спрамицин III 0,12-16 1 4 Карримицин (Carrimycin) 0,12-16 2 8 Азитромицин 0,12-64 2 8 ацетилспирамицин 0,12-64 4 8 эритромицин 0,12-64 1 8

II. Определение устойчивости к трахоматозным хламидиям и хламидии пневмониз во внешней среде

Метод испытания:

1. Засевали клетки НЕр-2 и McCoy на пластине для культирования клеток с 96 дырочками (Фирмы Costap), 37°C, 5% CO₂ культивировали в течение 48 ч, получали однослойные клетки.

2. Растворили вакцинируемые бактерии до 10000-20000 ifu (единица, формирующая хламидийное включение)/мл, засеяли по 0,1 мл/дырочка. Засеяли серотипные B/TW-5/OT, D/UW-3/Сх трахоматозных хламидий на пластину для культирования клеток McCoy, засеяли хламидию пневмониз CWL-029 на пластину для культирования клеток НЕр-2. Сначала всосали раствор для культивирования клеток из пластины с 96 дырочками, потом засеяли по 0,1 мл/дырочка. В т.ч. не засевали в 4 дырочки (A11-D11)h2 дырочки (С 12 и D12).

3. После засева центрифугировали пластину для культивирования клеток с 96 дырочками на центрифуге J-6MC производства Компании Beckman-Coulter при центробежной силе xl500g и 35°C в течение 60 мин.

4. По завершении центробежной обработки, всосали засеянные трахоматозные хламидий или хламидия пневмониз, налили 4 вида разбавленные антибиотиковых средств по 0,1 мл/дырочка соответственно.

5. Культивировали при 37°C в 5% CO₂, далее культивировали на пластине для испытания на чувствительность к трахоматозным хламидиям в течение 48 ч, культивировали на пластине для испытания на чувствительность к хламидиям пневмониз в течение 72 ч. После культивирования взяли раствор с антибиотиковыми средствами и промыли два раза PBS(0.01M, pH 7,4), обработали 100% метанолом при комнатной температуре в течение 15 мин.

6. Идентификация непрямым иммунофлюоресцентным окрашиванием: на пластину для испытания на чувствительность к трахоматозным хламидиям и к хламидиям пневмониз налили очищенные моноклональное антитело (N54 клонирование), устойчивое к трахоматозным хламидиям, и моноклональное антитело (P33 клонирование), устойчивое к хламидиям пневмониз по 50 мкл/дырочка, культивировали во влажной камере при 37°C в течение 30 мин., потом четыре раза промыли пластину с помощью специального аппарата, далее наливали Pabbit ami pat fluopescent antibody (Фирма Sigma) no 50 мкл/дырочка, культивировали и промыли пластину по тому же методу и при тех же условиях. Налили глицерин с уплотнителем по 100 мкл/дырочка, наблюдали результаты под инвертированным флуоресцентным микроскопом Nikon (Diaphot-200).

7 Определение MIC: минимальная концентрация разбавленных антибиотиков на испытательной пластине с 96 дырочками, при которой полностью ингибировано выращивание тельца трахоматозных хламидий или хламидий пневмониз (во всех дырочках не было обнаружено включение с флуоресцентным окрашиванием).

Табл. 10 Сравнение минимальной бактериостатической концентрации (MIC) внетелесных воздействий 5 видов макролидных антибиотиков в отношении трахоматозных хламидий или хламидий пневмониз   Изовалерил-спрамицин I (получ, по Примеру 1) Изовалерил-спрамицин II (получ, по Примеру 1) Изовалерил-спрамицин III (получ, по Примеру 1) Карримицин (Carrimycin) Ацетил-спирамици н (AT-SPM) Эритромицин (EM) Азитромицин (AM) трахоматозные хламидий B/TW-5/OT 0,25µг/мл 0,25 µг/мл 0,25 µг/мл 0,25 µг/мл 4 µг/мл 0,5 µг/мл 0,5 µг/мл трахоматозные хламидий
D/UW-3/Сх 0,25 µг/мл 0,25 µг/мл 0,25 µг/мл µцг/мл 2 µг/мл 0,5 µг/мл 0,25 µг/мл хламидия пневмониз
CWL-029 0,016 µг/мл 0,016 µг/мл 0,016 µг/мл 0,016 µг/мл 0,5 µг/мл ≤0,016 µг /мл 0,032 µг/м л

1. В отношении серотипных B/TW-5/OT трахоматозных хламидий, изовалерил-спирамицины I, II, III превосходят Карримицин (Carrimycin), эритромицин, азитромицин, ацетилспирамицин (MIC - 4цг/мл) чуть хуже.

2. В отношении серотипных D/UW-3/Сх трахоматозных хламидий, изовалерил-спирамицины I, II, III и Карримицин (Carrimycin), азитромицин обладают аналогичным внетелесным эффектом, MIC - 0.25 µг/мл, относятся к чувствительным; далее идет эритромицин (0.5 µцг/мл), ацетилспирамицин (MIC - 2 µг/мл) чуть хуже.

3. В отношении хламидий пневмониз CWL-029, изовалерил-спирамицин II и эритромицин являются самыми чувствительными, М1С≤0.016 µт/мл, азитромицин и Карримицин (Carrimycin), изовалерил-спирамицин I, изовалерил-спирамицин III более чувствительны, ацетилспирамицин (MIC - 0.5 µг/мл) чуть хуже.

4. В общем говоря, изовалерил-спирамицин обладает лучшим эффектом в отношении хламидий против других испытуемых лекарственных средств.

III. Устойчивость к уреаплазмам уреалитикум и трахоматозным хламидиям во внешней среде

1. Метод испытания: наливали в дырочку стерильной пластины для культивирования клеток с 12 дырочками U-PPLO 0,8 мл (в контрольную дырочнку для раствора с бактериями налили 0,9 мл, в контрольную дырочку для питательной среды налили 1,0 мл).

2. В тестовую дырочку налили 0,1 мл раствор с бактериями Uu 10⁴ СС11/мл, окончательное количество бактерий в дырочке 10³ ССи/мл (в контрольную дырочку для питательной среды не наливали раствор с бактериями).

3. Разбили на три группы (основной антибиотиковый раствор 100 µг/мл, 10 µг/мл, 1 µг/мл), в экспериментальные дырочки), налили антибиотики для испытания с помощью стерильного Tip по двукратно убывающей концентрации: 100 мкл, 50 мкл, 25 мкл, 12.5 мкл (не наливали антибиотики в контрольные дырочки для раствора с бактериями, контрольные дырочки для питательной среды, тем временем, установили контрольные дырочки для антибиотика).

4. Равномерно перемешали вышеуказанные дырочки, уплотнили пластину клейкой лентой, положили в ингибитор для культивирования при 37°C.

5. Наблюдали и регистрировали результаты выращивания Uu в 17-24 ч после испытания. Когда в контрольных дырочках для раствора с бактериями Uu показывает положительный рост, в этом случае под минимальной MIC данной формы понимается минимальная концентрация антибиотика, при которой можно ингибировать рост Uu, под окончательной MIC (24 ч) понимается MIC, измеренная по окончании испытания.

Четыре раза определяли MIC штаммов, устойчивых к уреаплазме уреалитикум и трахоматозным хламидиям, ниже приведены результаты определения:

Величина MIC изовалерил-спирамицина I: 0,025-0,125 µ/мл;

Величина MIC изовалерил-спирамицина II: 0,025-0,125 µг/мл,

Величина MIC изовалерил-спирамицина III: 0,025-0,125 µг/мл,

Карримицин (Carrimycin): 0,025-0,125 µг/мл,

Ацетилспирамицин: 0,5 µг/мл,

Эритромицин: 5 µг/мл,

Азитромицин: 0,025-0,125 µг/мл.

Вышеприведенные результаты показали, что изовалерил-спирамицины I, II, III, Карримицин (Carrimycin) обладают благоприятной устойчивостью к Uu, как азитромицин, превосходят ацетилспирамицин, среди образцов форм данной группы эритромицин обладает наихудшей устойчивостью к Uu.

Левовращающие изовалерил-спирамицины I, II, III или препараты левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III, приготовленные для остальных примеров изобретения, прошли одинаковые испытания и дали аналогичные результаты.

Опытный пример 4

Клинические испытания левовращающих изовалерил-спирамицинов I II, III

Терапевтическая эффективность и безопасность левовращающими изовалерил-спирамицинами I, II, III (полученными по Примеру 1), азитромицином при лечении острой инфекции дыхательных путей у взрослых, в т.ч. острый бактериальный фарингит, гнойный тонзиллит, острый трахеобронхит, не сильная пневмония и т.д., вызванные сенситивными бактериями.

Применяли мультицентрические, случайные, двойные слепые испытания и контролируемые испытания двойной имитацией. Испытания проводились одновременно в 5 клиниках по одинаковому варианту клинических испытаний.

I. Критерий включения испытуемых

1. Взрослые больные (мужчины и женщины) возрастом от 18 до 65 лет;

2. Острая инфекция дыхательных путей, вызванная сенситивными бактериями, в т.ч. острый бактериальный фарингит, острый гнойный тонзиллит, острый трахеобронхит, не сильная пневмония и острый назосинусит и т.д.;

3. Необходимо подписание формы информированного согласия до включения;

4. Все испытуемые должны принимать противозачаточные средства в процессе исследования и не менее трех месяцев после введения лекарства.

II. Критерий исключения испытуемых

1. Больные, у которых печеночно-почечная недостаточность (Cr в крови >1,5 мг/дл ALT>нормальный верхний предел);

2. Беременная женщина или кормилица;

3. Больные, заболевшие желудочно-кишечными заболеваниями, которым не подходит пероральный прием лекарства;

4. Больные, принимавшие антибактериальные средства в течение недели до включения;

5. Человек, длительно злоупотребляющий алкоголем.

Результаты статистики показали, что клиническая эффективность (FAS): Терапевтическая эффективность изовалерил-спирамицина I, изовалерил-спирамицина

II, изовалерил-спирамицина III и азитромицин составляет 92,30%, 92,30%, 92,30%), 89,61% соответственно.

Клиренс бактерий:

Клиренс бактерий изовалерил-спирамицина I, изовалерил-спирамицина II, изовалерил-спирамицина III и азитромицин составляет 97,56%, 97,56%, 97,56%, 92,86% соответственно. Неблагоприятные действия:

Неблагоприятные действия изовалерил-спирамицина I, изовалерил-спирамицина II, изовалерил-спирамицина III и азитромицин составляет 2,5%, 2,5%, 2,5%, 7,6% соответственно.

Клинические испытания показали, что изовалерил-спирамицины I, II, III являются безопасными и эффективными новыми противоинфекционными средствами.

Левовращающие изовалерил-спирамицины I, II, III или препараты левовращающих изовалерил-спирамицинов I, II, III, приготовленные для остальных примеров изобретения, прошли одинаковые испытания и дали аналогичные результаты.

Изобретение относится к кристаллическому соединению левоизовалерилспирамицина I, характеризующемуся химической структурной формулой (I)

с температурой плавления 116~122°С и дифракцией рентгеновских лучей на порошке кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I, измеренной с применением излучения Cu-Kα, с характерными пиками при 2θ=7,6°, 8,0°, 10,0°, 11,4°, 16,4°, 17,0°, 17,5°, 17,9°, 19,5°, 22,7°, 23,7° и 24,4°; препарату на его основе для лечения инфекционных заболеваний, а также способу приготовления указанного соединения, который включает растворение твердого соединения левоизовалерилспирамицина I в смешанном растворе этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, добавление дистиллированной воды при одновременном перемешивании смеси, охлаждение до 5°С~15°С после добавления дистиллированной воды, продолжение перемешивания при охлаждении, затем получение кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I, при этом объемное соотношение этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона в смешанном растворителе составляет 1:0,1~10:0,5~1. Предложено новое кристаллическое вещество, эффективное для лечения бактериальных инфекций. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 56 пр., 10 табл., 7 ил.

1. Кристаллическое соединение левоизовалерилспирамицина I, характеризующееся химической структурной формулой (I)

с температурой плавления 116~122°С и дифракцией рентгеновских лучей на порошке кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I, измеренная с применением излучения Cu-Kα, с характерными пиками при 2θ=7,6°, 8,0°, 10,0°, 11,4°, 16,4°, 17,0°, 17,5°, 17,9°, 19,5°, 22,7°, 23,7° и 24,4°;
причем при растворении указанного кристаллического соединения в хлороформе при 25°С и концентрации 0,02 г/мл, измеренный угол оптического вращения [α]_D составляет -49°~ -62°.

2. Препарат для лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний, содержащий кристаллическое соединение левоизовалерилспирамицина I по п. 1, отличающийся тем, что
препарат содержит кристаллическое соединение левоизовалерилспирамицина I; кристаллическое соединение левоизовалерилспирамицина I и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество; чистота кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I превышает 90% по массе.

3. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что препарат содержит следующую стандартную дозу: содержание кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I составляет 10~1500 мг.

4. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что массовая доля кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I составляет 10~95%.

5. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что препарат включает порошок для инъекций или лиофилизированный порошок, содержащий кристаллическое соединение левоизовалерилспирамицина I и, по крайней мере, одно из следующего: лимонная кислота, адипиновая кислота, малеиновая кислота.

6. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что чистота кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I превышает 95% по массе.

7. Препарат по п. 2, отличающийся тем, что чистота кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I превышает 98% по массе.

8. Препарат по п. 3, отличающийся тем, что содержание кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I составляет 100~500 мг.

9. Препарат по п. 4, отличающийся тем, что массовая доля кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I составляет 75~95%.

10. Способ приготовления кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I по п. 1, отличающийся тем, что способ включает
растворение твердого соединения левоизовалерилспирамицина I в смешанном растворе этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона, добавление дистиллированной воды при одновременном перемешивании смеси, охлаждение до 5°С~15°С после добавления дистиллированной воды, продолжение перемешивания при охлаждении, затем получение кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I, при этом объемное соотношение этилацетата, абсолютного этилового спирта и безводного ацетона в смешанном растворителе составляет 1:0,1~10:0,5~1.

11. Способ приготовления кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I по п. 10, отличающийся тем, что он
включает: приготовление левокарримицина и очищение левоизовалерилспирамицина I, II или III, отличающийся тем, что процесс приготовления левокарримицина включает: культивирование и биологическое ферментирование клонированных грибковых штаммов WSP-195, осуществляемое с применением спирамицин-содержащего гена 4′′-изовалерилтрансферазы и экстрагирование ферментационной жидкости;
при этом
процесс культивирования способа приготовления левокарримицина заключается в культивировании клонированных грибковых штаммов WSP-195, осуществляемом с применением спирамицин-содержащего гена 4′′-изовалерилтрансферазы на поверхности среды скошенного агара, содержащей 2% муки соевого жмыха, 1% глюкозы, 3% крахмала, 0,5% СаСО₃, 0,4% NaCl и 2% агара в течение 8-15 суток при рН 6,5-7,5 и температуре 28~38°С, последующем посеве на поверхность среды для посева, содержащей 1,5% муки соевого жмыха, 3,0% крахмала, 0,4% NaCl, 0,5% СаСО₃, 0,3% рыбного пептона и 0,05% KH₂PO₄ и культивировании в течение 40-80 часов при рН 6,5-7,5 и температуре 25-30°С, введении в среду ферментации, содержащую 0,5% глюкозы, 6,0% крахмала, 0,5% сухих дрожжей, 2,0% рыбной муки, 0,6% NH₄NO₃, 1,0% NaCl, 0,5% CaCO₃, 0,05% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄, 0,5% соевого масла и 0,02% противовспенивающей добавки и культивировании в течение 72-120 часов при 26-30°С, 0,1-20% количества посева для получения ферментационной жидкости,
ферментация осуществляется в условиях рН 6,0-9,0, кривые изменения рН со временем показывают три непрерывные фазы, отличающиеся тем, что первая фаза удовлетворяет формуле y₁=0,1364x₁+6,0 или y₁=0,0909x₁+6,4 или y₁=0,0682x₁+6,0, где, 0≤x₁≤22; вторая фаза удовлетворяет формуле у₂=-0,0735х₂+10,64 или у₂=-0,0441х₂+7,8 или у₂=-0,0294х₂+8,147, где 22≤х₂≤56; и третья фаза удовлетворяет формуле у₃=0,0078х₃+6,06, где 56≤х₃≤120; при этом x₁, x₂ и х₃ являются часами соответственно, у₁, у₂ и у₃ являются значением рН соответственно, в ходе каждого процесса ферментации;
этап экстрагирования биологической ферментационной жидкости включает: обработку ферментационной жидкости сульфатом алюминия для получения фильтрата, стабилизирование рН фильтрата на уровне 8,5~9,0, применение бутилацетата для экстрагирования, очищение экстракта бутилацетата несоленой водой и раствором 1% NaH₂PO₄, затем применение воды с рН 2,0~2,5 для экстрагирования с получением водосодержащего экстракта, стабилизирование рН на уровне 4,5~5,5, испарение и устранение остаточного бутилацетата для получения водного экстракта, фильтрацию и стабилизирование рН на уровне 8,5-9,0, осаждение фильтрата и промывание дистиллированной водой для получения влажного продукта и его сушку для получения левокарримицина;
этап очищения левоизовалерилспирамицина I включает: очищение пробы левокарримицина методом хроматографии, выполнение градиентного элюирования и выделение пиков мишеней компонентов левоизовалерилспирамицина I с применением хроматографической колонки ODS в буферном растворе ацетонитрила и ацетата аммония,
при очищении левоизовалерилспирамицина I регистрацию диаграммы УФ-спектра левоизовалерилспирамицина I с применением препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии и УФ-детектирования и отбор пробы левоизовалерилспирамицина I на основании времени удерживания в 44,759 мин;
подвижная фаза представляет смешанный растворитель ацетонитрила А и 150 мМ раствора ацетата аммония с рН 8,5,
условия, необходимые для очищения левоизовалерилспирамицина I, являются следующими: линейный градиент: 0~60 минут, А - 25%~65%; и 61~90 минут, А - 65%~90%;
скорость фильтрации: 260 мл/мин;
объем пробы: 10 мл;
концентрация пробы: 0.5 г/мл;
длина волны измерения: 231 нм;
способ отбора: отбор с применением УФ-триггера;
при очищении левоизовалерилспирамицина I, устранение ацетонитрила в собранном левоизовалерилспирамицине I с применением метода роторного испарения, затем применение этилацетата для экстрагирования, устранение этилацетата из экстракта путем испарения для получения пастообразной пробы; повторное растворение пробы с применением петролейного эфира, устранение петролейного эфира посредством испарения для получения белого порошка левоизовалерилспирамицина I.

12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что
объемное соотношение абсолютного метанола, безводного ацетона и абсолютного этилового спирта в смешанном растворителе составляет 1:2-8:0,8-1.

13. Применение кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I по п. 1 или препарата в соответствии с любым из пп. 3-9 для приготовления лекарственных средств для лечения и/или профилактики инфекционных заболеваний.

14. Применение кристаллического соединения левоизовалерилспирамицина I в соответствии с п. 1 или препарата в соответствии с любым из пп. 3-9 для приготовления лекарственных средств, относящихся к антибиотикам, воздействующим на бактерии, включая стрептококки пневмонии, стрептококки группы А, пиогенные стрептококки, энтерококки, золотистые стафилококки, эпидермальные стафилококки, катаральные кокки, гонококки, гриппозные бациллы, кишечные палочки, энтеротоксигенные кишечные палочки, энтеропатогенные кишечные палочки, энтероинвазивные кишечные палочки, синегнойные палочки, палочки Фридлиндера, вульгарный протей, брюшнотифозные палочки, ацинетобактерии, нитробактерии, серрации, шигеллы Зонне, шигеллы Флекснера, грибок Tritirachium album; легионеллы, такие как легионелла pneumophila, легионелла gormanii, легионелла bozemanii, легионелла dumoffii, легионелла jordanis и легионелла micdadei; анаэробы, такие как бактероиды фрагилис, бактероиды thetaiotaomicron, бактероиды vulgatus, бактероиды distasonis, бактероиды prevotella, превотелла asaccharolyticus, превотелла oralis, палочка Плаута, фузобактерии russell, бифидобактерии, лактобациллы, пептострептококки, пропионовые бактерии акне, клостридии перфрингенс и дрожжеподобные грибки.