ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К CXCR4 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Российский патент 2016 года по МПК C07K16/28 

Данное изобретение относится к новому антителу, в частности, к гуманизированному моноклональному антителу, способному специфически связываться с рецепторами хемокинов (CXCR), а также к амино- и нуклеиновокислотной последовательностям, кодирующим такое антитело. В одном аспекте изобретение относится к новому антителу, производным соединениям или функциональным фрагментам, способным специфически связываться с CXCR4 и имеющим сильную противоопухолевую активность. Изобретение также относится к применению такого антитела в качестве лекарственного средства для профилактического и/или терапевтического лечения рака, а также в процедурах или наборах, связанных с диагностикой рака. Наконец, изобретение относится к композициям, содержащим такое антитело в сочетании или в конъюгации с другим противораковым соединением (соединениями), таким как антитела, токсины, цитотоксические/цитостатические агенты, и к применению их для профилактики и/или лечения некоторых видов рака.

Хемокины представляют собой небольшие секретируемые пептиды, которые контролируют миграцию лейкоцитов по химическому градиенту лиганда, известному как хемокиновый градиент, особенно в иммунных реакциях (Zlotnick A. et al., 2000). Они разделены на два основных подсемейства, СС и СХС, в зависимости от положения их NH₂-концевых остатков цистеина, и связываются с рецепторами, сопряженными с G-белком, два основных подсемейства которых обозначаются как CCR и CXCR. До настоящего времени было обнаружено более 50 человеческих хемокинов и 18 хемокиновых рецепторов.

Многие раки имеют сложную хемокиновую сеть, которая влияет на иммунно-клеточную инфильтрацию опухоли, а также на рост, выживание, миграцию опухолевых клеток и ангиогенез. Иммунные клетки, эндотелиальные клетки и опухолевые клетки сами экспрессируют хемокиновые рецепторы и могут реагировать на хемокиновые градиенты. Исследования образцов биопсии человеческого рака и мышиных моделей рака показали, что экспрессия хемокиновых рецепторов раковыми клетками связана с увеличением метастатического потенциала. Злокачественные клетки от различных типов рака имеют различные профили экспрессии хемокиновых рецепторов, но наиболее распространен хемокиновый рецептор-4 (CXCR4). Клетки по меньшей мере 23 различных типов человеческих раков эпителиального, мезенхимального и гемопоэтического происхождения экспрессируют CXCR4-рецептор (Balkwill F. et al., 2004).

Хемокиновый рецептор-4 (также известный как фузин, CD184, LESTR или HUMSTR) существует в виде двух изоформ, содержащих 352 или 360 аминокислот. Остаток Asn11 гликозилирован, остаток Tyr21 модифицирован путем добавлением сульфатной группы, a Cys109 и Cys186 связаны дисульфидным мостиком на внеклеточной части рецептора (Juarez J. et al., 2004).

Этот рецептор экспрессируется различными видами нормальных тканей, наивными Т-клетки (не Т-клетками памяти), регуляторными Т-клетками, В-клетками, нейтрофилами, эндотелиальными клетками, первичными моноцитами, дендритными клетками, натуральными киллерами, CD34+ гемопоэтическими стволовыми клетками и на низком уровне в сердце, кишечнике, печени, почках и головном мозге. CXCR4 играет ключевую роль в перемещении лейкоцитов, В-клеточном лимфопоэзе и миелопоэзе.

CXCR4-рецептор сверхэкспрессирован в большом числе раков, включая, но не ограничиваясь ими, рак толстой кишки (Ottaiano A. et al., 2004), молочной железы (Kato М. et al., 2003), предстательной железы (Sun Y.X. et al., 2003), легких [мелкоклеточная и немелкоклеточная карцинома (Phillips R.J. et al., 2003)], яичника (Scotton C.J. et al., 2002), поджелудочной железы (Koshiba Т. et al., 2000), почек, головного мозга (Barbero S et al., 2002), глиобластому и лимфомы.

Уникальным лигандом рецептора CXCR4, описанным до настоящего времени, является фактор стромальных клеток-1 (SDF-1) или CXCL12. SDF-1 секретируется в большом количестве в лимфатических узлах, костном мозге, печени, легких и в меньшей степени в почках, головном мозге и коже. CXCR4 также распознается антагонистическим хемокином, вирусным макрофагальным воспалительным белком II (vMIP-II), который кодируется человеческим вирусом герпеса III типа.

CXCR4/SDF-1 ось играет ключевую роль в раке и непосредственно участвует в миграции, инвазии, ведущей к метастазированию. Действительно, раковые клетки экспрессируют CXCR4-рецептор, они мигрируют и входят в системный кровоток. Затем раковые клетки задерживаются в сосудистом русле в органах, которые продуцируют высокие уровни SDF-1, где они пролиферируют, индуцируют ангиогенез и формируют метастатические опухоли (Murphy PM., 2001). Эта ось также участвует в пролиферации клеток через активацию пути внеклеточной сигнал-регулируемой киназы (ERK) (Barbero S. et al., 2003) и ангиогенезе (Romagnani P., 2004). Действительно, CXCR4-рецептор и его лиганд SDF-1 четко усиливает ангиогенез путем стимуляции экспрессии VEGF-A, который в свою очередь увеличивает экспрессию CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. et al., 2002). Известно также, что опухоль-ассоциированные макрофаги (ТАМ) накапливаются в гипоксических областях опухолей и стимулируются к воздействию с опухолевыми клетками и усиливают ангиогенез. Было отмечено, что гипоксия селективно повышает экспрессию CXCR4 в различных типах клеток, включая ТАМ (Mantovani А. et al., 2004). Недавно было показано, что ось CXCR4/SDF-1 регулирует перемещение/хоминг CXCR4+гемопоэтических стволовых клеток/клеток-предшественников (HSC) и может играть роль в неоваскуляризации. Данные свидетельствуют о том, что помимо HSC функциональный CXCR4 также экспрессируется на стволовых клетках из других тканей (ранних тканевых стволовых клетках = TCSC), так что SDF-1 может играть ключевую роль в хемотаксисе CXCR4+TCSC, необходимом для регенерации органа/ткани, но эти TCSC могут также быть клеточным источником развития рака (теория раковых стволовых клеток). Происхождение рака из стволовых клеток было продемонстрировано для человеческой лейкемии и недавно для нескольких солидных опухолей, таких как опухоли головного мозга и молочной железы. Есть несколько примеров CXCR4+опухолей, которые могут происходить из нормальных CXCR4+ ткане-/органоспецифичных стволовых клеток, например лейкемии, опухоли головного мозга, мелкоклеточный рак легких, рак молочной железы, гепатобластома, рак яичников и шейки матки (Kucia M. et al., 2005).

Влияние на метастазы рака путем воздействия на рецептор CXCR4 было продемонстрировано in vivo с помощью моноклонального антитела, направленного против рецептора CXCR4 (Muller A. et al., 2001). Вкратце, было показано, что моноклональное антитело, направленное против CXCR4-рецептора (MKA 173 R&D Systems), значительно уменьшает количество метастазов в лимфатических узлах на модели ортотопического рака молочной железы (MDA-MB231) у мышей SCID. Другое исследование (Phillips R.J et al., 2003) также показало важную роль оси SDF-1/CXCR4 в метастазировании на модели ортотопической карциномы легких (А549) с помощью поликлональных антител против SDF-1, но в данном исследовании не было влияния ни на рост опухоли, ни на ангиогенез. Ряд других исследований также описывает ингибирование либо метастазов in vivo с помощью киРНК-дуплексов CXCR4 (Liang Z. et al., 2005), биоустойчивых антагонистов пептида CXCR4 (Tamamura H. et al., 2003), либо опухолевого роста in vivo с использованием низкомолекулярного антагониста CXCR4, такого как AMD 3100 (Rubin J.B. et al., 2003; De Faico V. et al., 2007), или MKA (патент WO 2004/059285 А2). Таким образом, CXCR4 является утвержденной терапевтической мишенью при раках.

Хемокиновый рецептор-2 (CXCR2), другой хемокиновый рецептор, также описывается как интересная мишень в онкологии. Действительно, CXCR2 передает аутокринный клеточный ростовой сигнал в нескольких типах опухолевых клеток и также может влиять на рост опухоли косвенным путем за счет усиления ангиогенеза (Tanaka Т. et al. 2005).

Хемокиновый рецептор CXCR2 включает 360 аминокислот.Он экспрессируется главным образом в эндотелиальных клетках и специфично во время неоваскуляризации. CXCR2-рецептор связывают несколько хемокинов: CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-f, -β и -γ, которые принадлежат к ERL+ проангиогенным хемокинам. CXCR2-рецептор частично имеет гомологичную последовательность с CXCR4-рецептором: 37% идентичной последовательности и 48% гомологичной последовательности. Ось CXCR2/лиганды вовлечена в несколько механизмов опухолевого роста, таких как метастазирование (Singh RK. et а1., 1994), клеточная пролиферация (Owen J.D. et al., 1997) и ERL+ хемокин-опосредованный ангиогенез (Stricter R.M. et al., 2004; Romagnani et al., 2004). Наконец, опухоль-ассоциированные макрофаги и нейтрофилы являются ключевыми элементами индуцированного воспалением опухолевого роста, и хемокины, такие как CXCL5, IL-8 и GRO-α, инициируют привлечение нейтрофилов.

Димеризация появилась как общий механизм регуляции функции рецепторов, связанных с G-белком, к числу которых относятся хемокиновые рецепторы (Wang J. and Norcross M., 2008). Было показано, что гомо- и гетеродимеризация в ответ на связывание хемокином необходима для инициирования и изменения передачи сигнала от большого количества хемокиновых рецепторов. Все больше фактов поддерживает концепцию, что рецепторные димеры или олигомеры, вероятно, являются основной функциональной единицей хемокиновых рецепторов. Димеры хемокиновых рецепторов присутствуют в отсутствие лигандов, а хемокины индуцируют конформационные изменения рецепторных димеров. CXCR4, как известно, формирует гомодимеры, а также гетеродимеры, например, с 5-опиоидным рецептором (DOR) (Hereld D., 2008) или CCR2 (Percherancier Y. et al., 2005). В последнем примере пептиды, полученные из трансмембранных доменов CXCR4, ингибировали активацию путем блокирования лиганд-индуцированных конформационных переходов димера (Percherancier Y. et al., 2005). Другое исследование показало, что пептид CXCR4-TM4, синтетический пептид трансмембранного участка CXCR4, уменьшает перенос энергии между протомерами гомодимеров CXCR4 и ингибирует SDF-1-индуцированную миграцию и полимеризацию актина в злокачественных клетках (Wang J. et al., 2006). Совсем недавно также было описано, что CXCR7 формирует функциональные гетеродимеры с CXCR4 и усиливает SDF-1-индуцированную передачу сигнала (Sierro F. et al., 2007). Другие примеры конститутивных гетеродимеров включают исследования, показывающие взаимодействие CXCR1 и CXCR2, а также формирование соответствующих гомодимеров. Для любого из них было отмечено отсутствие взаимодействий с другим GPCR (альфа(1А)-адренорецептором), что указывает на специфичность взаимодействия CXCR1 и CXCR2 (Wilson S. et al., 2005).

Как упоминалось ранее, рецепторы CXCR4 и CXCR2 являются интересными опухолевыми мишенями. Влияние на эти рецепторы должно ингибировать опухолевый рост и метастазирование очень эффективным образом путем уменьшения пролиферации опухолевых клеток, ангиогенеза, миграции и инвазии опухолевых клеток, привлечения нейтрофилов и макрофагов в опухоль и путем ингибирования CXCR4-раковых стволовых клеток.

Одним из предлагаемых аспектов данного изобретения является создание гуманизированного моноклонального антитела, индуцирующего конформационные изменения CXCR4-димеров. Изобретение охватывает CXCR4-MKA hz515H7 (или его фрагменты), способное связывать и индуцировать конформационные изменения как гомодимеров CXCR4, так и гетеродимеров CXCR4/CXCR2, и имеющее высокую противоопухолевую активность. Hz515H7 индуцирует конформационные изменения как гомодимеров CXCR4, так и гетеродимеров CXCR4/CXCR2. Это новое свойство должно представлять интерес для применения в терапии рака с учетом важной роли этих двух хемокиновых рецепторов при раке.

Уже обнаружено, что влияние как гомо-, так и гетеродимеров рецепторов усиливает терапевтический эффект MKA. Действительно, было продемонстрировано, например, что MKA (h7C10), влияющее на оба гибридных рецептора IGF-1R и инсулин/IGF-1, более мощно ингибирует опухолевый рост in vivo, чем MKA, влияющее исключительно на IGF-1R (Pandini G., 2007).

Кроме того, анти-CXCR4-MKA hz515H7 является молчащим антагонистом для CXCR4, оно не изменяет базальный сигнал в анализах in vitro, но ингибирует SDF-1-индуцированную передачу сигнала в различных анализах (GTPγS-связывание, высвобождение Са²⁺), а также способно ингибировать SDF-1-индуцированную миграцию опухолевых клеток in vitro.

Молекулы, действующие либо как частичные агонисты, либо как обратные агонисты, демонстрируют внутреннюю активность в отсутствие лигандов. Эти типы молекул стабилизируют, соответственно, высокоаффинное или низкоаффинное состояние GPCR, даже в отсутствие лиганда, тем самым активируя или ингибируя нисходящие сигнальные каскады (Galandin et al., 2007; Kenakin, 2004).

В случае MKA hz515H7 оно ведет себя как молчащий антагонист без какой-либо внутренней активности в отношении CXCR4-рецептора в отсутствие SDF-1. Эта фармакологическая черта может быть связана с менее неблагоприятными побочными эффектами по сравнению с частичными или обратными агонистами, как уже отмечалось для лигандов опиоидных рецепторов (Bosier and Hermans, 2007). Действительно, функциональная активность MKA hz515H7 полностью зависит от наличия SDF-1, и отсутствие модуляции активности рецептора CXCR4 будет наблюдаться в тканях и органах, в которых лиганд SDF-1 не экспрессируется, не секретируется или не доставляется кровотоком. Таким образом, MKA hz515H7, вероятно, будет менее токсичным по сравнению с другими лигандами рецептора CXCR4 с положительной или отрицательной эффективностью. Кроме того, молчащие антагонисты составляют меньшую часть видов в фармакологической области (Wurch et al., 1999, Kenakin, 2004).

Удивительно, но в первый раз изобретателям удалось создать гуманизированное антитело, которое способно связываться с CXCR4, но также способно вызывать конформационные изменения гомодимеров и/или гетеродимеров CXCR4. В частности, антитело изобретения способно вызывать конформационные изменения гомодимеров CXCR4, а также гетеродимеров CXCR4/CXCR2.

В последующей заявке выражение во множественном числе «димеры CXCR4» следует понимать как охватывающее гомодимеры CXCR4, а также гетеродимеры CXCR4/CXCR2.

На данном этапе следует отметить, что такие гуманизированные антитела никогда не были описаны в известном уровне техники. Кроме того, необходимо отметить, что существование гетеродимеров CXCR4/CXCR2 никогда не было описано.

Частью изобретения является открытие существования гетеродимера, образованного CXCR4 и CXCR2.

Так, в частном аспекте данное изобретение относится к выделенному комплексу, включающему или состоящему из гетеродимера CXCR4/CXCR2.

Соединение CXCR4-части указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2 является одной из двух человеческих изоформ CXCR4, выбранных из группы, состоящей из:

- хемокинового (С-Х-С-мотив) рецептора 4 изоформы b [Homo sapiens], имеющего последовательность, указанную под регистрационным номером Genbank NP_003458 (SEQ ID №1);

- хемокинового (С-Х-С-мотив) рецептора 4 изоформы a [Homo sapiens], имеющего последовательность, указанную под регистрационным номером Genbank NP_001008540 (SEQ ID №2);

- альтернативного транскрипционного варианта сплайсинга или природного варианта, имеющего по меньшей мере 95% идентичность с одной из этих изоформ b или а с SEQ ID №1 или 2; и

- его фрагмента, который может специфично распознаваться природным лигандом фактором стромальных клеток-1 (SDF-1) и предпочтительно имеет по меньшей мере 100,150 и 200 аминокислот в длину.

Соединение CXCR2-части указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2 выбрано из группы, состоящей из:

рецептора бета интерлейкина-8 [Homo sapiens], имеющего последовательность, указанную под регистрационным номером Genbank NP_001548(SEQIDNQ3);

- альтернативного транскрипционного варианта сплайсинга или природного варианта, имеющего по меньшей мере 95% идентичность с этим рецептором бета интерлейкина-8 с SEQ ID №3; и

- его фрагмента, который может специфично распознаваться ИЛ-8 и предпочтительно имеет по меньшей мере 100, 150 и 200 аминокислот в длину.

В данном частном аспекте данное изобретение также включает выделенную РНК или ДНК, кодирующую полипептид, включающий указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2.

Это изобретение также включает нуклеиновую конструкцию, предпочтительно экспрессионный вектор, например плазмиду, кодирующую указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2.

Изобретение также включает композицию, включающую по меньшей мере одну нуклеиновую конструкцию, предпочтительно экспрессионный вектор, например плазмиду, кодирующую CXCR4-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2, и вторую конструкцию, предпочтительно экспрессионный вектор, например плазмиду, кодирующую CXCR2-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2.

В этом аспекте изобретение также раскрывает способ получения рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2, где этот способ включает этап трансформации указанной клетки-хозяина:

а) нуклеиновой конструкцией, предпочтительно экспрессионным вектором, например плазмидой, кодирующей указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2; или

б) по меньшей мере одной нуклеиновой конструкцией, предпочтительно экспрессионным вектором, например плазмидой, кодирующей CXCR4-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2, и второй конструкцией, предпочтительно экспрессионным вектором, например плазмидой, кодирующей CXCR2-часть указанного гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2.

Указанная клетка-хозяин является эукариотической клеткой, например клеткой млекопитающего.

Нуклеиновая конструкция (конструкции), кодирующая указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2, кодирует также первый маркер, который связан (в частности, с помощью ковалентной связи) с CXCR4-последовательностью, например маркер luc (люцефераза), и второй маркер, который связан (в частности, с помощью ковалентной связи) с CXCR2-последовательностью, например маркер GFP (т.е. для анализа BRET).

Изобретение также раскрывает способ выбора соединения, которое проявляет противораковую активность или которое может быть использовано для получения композиции для лечения рака, который характеризуется тем, что включает этап:

а) контактирования рекомбинантной клетки-хозяина данного изобретения, которая экспрессирует указанный гетеродимерный комплекс CXCR4/CXCR2, с анализируемым соединением; и

б) определения того, способно ли это соединение модулировать, предпочтительно ингибировать, активность этого гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2 в рекомбинантной клетке-хозяине.

В первом аспекте предметом данного изобретения является процесс создания и выбора гуманизированных антител в соответствии с изобретением.

В первом аспекте изобретение касается процесса выбора гуманизированного анти-CXCR4-антитела или одного из его функциональных фрагментов или производных, способных ингибировать как лиганд-зависимую, так и лиганд-независимую активацию CXCR4, при этом указанный процесс включает следующие этапы:

i) скрининг созданных гуманизированных антител и выбор антител, способных специфически связывать CXCR4, а также для модулировать CXCR4-активацию;

ii) тестирование антител, выбранных на этапе i), и выбор антител, способных индуцировать конформационные изменения гомодимеров CXCR4, а затем

iii) тестирование антител, выбранных на этапе ii), и выбор антител, способных индуцировать конформационные изменения гетеродимеров CXCR4/CXCR2.

Под выражением «модулировать» следует понимать усиление или ингибирование. Предпочтительно выбранные антитела изобретения должны ингибировать CXCR4-активацию.

Как было объяснено ранее, индукция конформационных изменений димеров CXCR4 является основным аспектом изобретения, так как такие антитела будут представлять реальный интерес для большего количества пациентов.

Создание антитела может быть реализовано любым способом, известным специалистам в данной области, таким как, например, из рекомбинантных гуманизированных антител, разработанных из секвенированных CDR мышиных антител, секретированных при слиянии миеломной клетки с клетками селезенки от иммунизированных мышей или других видов, совместимых с выбранными миеломными клетками [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]. Иммунизированные животные могут включать трансгенных мышей с человеческими иммуноглобулиновыми локусами, которые затем непосредственно продуцируют человеческие антитела. Другое возможное воплощение могло бы состоять в применении методики фагового дисплея для скрининга библиотек.

Этап скрининга i) может быть реализован любым способом или процессом, известным специалистам в данной области. В качестве неограничивающих примеров можно упомянуть ИФА, BIAcore, иммуногистохимию, FACS-анализ и функциональные скрининги. Предпочтительный способ состоит в скрининге с помощью FACS-анализа на CXCR4-трансфектантах и по меньшей мере на опухолевой клеточной линии, чтобы убедиться, что продуцируемые антитела также способны распознавать нативный рецептор на опухолевых клетках. Этот процесс будет описан более точно в последующих примерах.

Под выражением «модулировать CXCR4-активацию» понимается модуляция по меньшей мере одной из активностей, указанных ниже в примерах 4, 5, 7 и 11 для мышиного антитела, 16, 17 и 19 для химерного антитела и 27, 24 и 28 для гуманизированного антитела:

Предпочтительными для модуляции являются:

- специфическое связывание на клеточных мембранах лиганда SDF-1 рецептором CXCR4 (см. примеры 4, 16, 27), в частности, путем конкурирования на мембране трансформированных эукариотических клеток, таких как мембраны СНО-K1, стабильно эксперессирующих человеческий рецептор CXCR4 дикого типа;

- специфическое связывание на клеточных мембран GTPγS рецептором CXCR4 (см. примеры 5, 17, 24), в частности, на мембране трансформированных эукариотических клеток, например клеток NIH-3T3, стабильно и конститутивно эксперессирующих рецептор CXCR4 дикого типа;

- CXCR4-опосредованное ингибирование продукции цАМФ (см. пример 7); и

- CXCR4-рецептор-опосредованная мобилизация внутриклеточных депо кальция (см. примеры 11, 19, 28).

Более предпочтительно эта модуляция по меньшей мере одной из этих видов активности представляет собой ингибирование активности.

В предпочтительном воплощении этапов выбора ii) и iii) процесса изобретения указанные этапы ii) и iii) состоят в оценке антител с помощью BRET-анализа на клетках, экспрессирующих CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP и CXCR4-Rluc/CXCR2-YFP, соответственно, и в выборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40%, предпочтительно 45%, 50%, 55% и наиболее предпочтительно 60% BRET-сигнала.

Методика BRET представляет собой методику, которая известна как репрезентативная для белковой димеризации [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].

Методика BRET, используемая в этапах процесса ii) и iii), хорошо известна специалистам в данной области и будет подробно описана в последующих примерах. Более конкретно BRET (bioluminescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии биолюминесценции) представляет собой нерадиационный перенос энергии, возникающий между биолюминесцентным донором (люциферазой Renilla (Rluc)) и флуоресцентным акцептором, мутантом GFP (green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок) или YFP (yellow fluorescent protein, желтый флуоресцентный белок). В данном случае был использован EYFP (enhanced yellow fluorescent protein, усиленный желтый флуоресцентный белок). Эффективность переноса зависит от ориентации и расстояния между донором и акцептором. Кроме того, передача энергии может происходить только тогда, когда две молекулы находятся в непосредственной близости (1-10 нм). Это свойство используется для проведения анализа белково-белковых взаимодействий. Действительно, в целях изучения взаимодействия между двумя участниками первый из них генетически сливают с люциферазой Renilla, а второй с желтым мутантом GFP. Гибридные белки, как правило, но не обязательно, экспрессируются клетками млекопитающих. В присутствии своего мембранно-проницаемого субстрата (коэлентеразина) Rluc испускает синий свет. Если мутант GFP находится ближе 10 нм к Rluc, то может возникнуть передача энергии, и будет обнаружен дополнительный желтый сигнал. Сигнал BRET измеряется как соотношение между светом, излучаемым акцептором, и светом, излучаемым донором. Таким образом, BRET-сигнал будет увеличиваться по мере сближения двух гибридных белков, или если конформационное изменение сблизит Rluc и GFP-мутант.

Если BRET-анализ включен в предпочтительное воплощение, то для измерения конформационных изменений димеров CXCR4 можно использовать любой способ, известный специалистам в данной области. Не ограничивая, можно отметить следующие методики: FRET (fluorescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии флуоресценции), HTRF (homogenous time resolved fluorescence, гомогенная флуоресценция с временным разрешением), FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy, флуоресцентная микроскопия с изображением по времени жизни флуоресценции) или SW-FCCS (single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy, кросс-корреляционная спектроскопия флуоресценции одной длины волны).

Также могут быть использованы другие классические методики, например коиммунопреципитация, Alpha Screen, химическое сшивание, двойной гибрид, аффинная хроматография, ИФА и фар-вестерн-блоттинг.

В частном аспекте процесса в соответствии с изобретением этап ii) состоит в оценке антител с помощью BRET-анализа на клетках, экспрессирующих оба CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP, и в выборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40% BRET-сигнала.

В другом частном аспекте процесса в соответствии изобретением этап iii) состоит в оценке антител с помощью BRET-анализа на клетках, экспрессирующих оба CXCR4-RLuc/CXCR4-YFP, и в выборе антител, способных ингибировать по меньшей мере 40% BRET-сигнала.

Во втором аспекте предметом изобретения является выделенное гуманизированное антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, получаемых указанным способом. Указанное гуманизированное антитело или один из его указанных фрагментов или производных способны специфически связываться с человеческим CXCR4 и, более того, при необходимости предпочтительно способны ингибировать природное присоединение его лиганда; также указанное гуманизированное антитело способно индуцировать конформационные изменения димеров CXCR4.

Выражения «функциональные фрагменты и производные» подробно будут определены ниже в данном описании.

Здесь следует понимать, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть они находятся не в их природной среде, но что они могут быть выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и что они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

В частности, в соответствии с другим аспектом изобретения описано антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, при этом указанное гуманизированное антитело характеризуется тем, что оно содержит по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR), определенный в соответствии с IMGT, выбранный среди CDR, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID №№4-9.

В соответствии со вторым аспектом изобретение связано с выделенным гуманизированным антителом или его производным или функциональным фрагментом, содержащим по меньшей мере один CDR, выбранный среди CDR с последовательностью SEQ ID №№4, 5, 6, 7, 8 или 9, или по меньшей мере один CDR, определенный в соответствии с IMGT, с последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания последовательностям SEQ ID №№4, 5, 6, 7, 8 или 9.

Под «функциональным фрагментом» антитела понимается, в частности, фрагмент антитела, такой как фрагменты Fv, scFv (sc обозначает одну цепь), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc, или димерные антитела или любой фрагмент, с такой же специфичностью к CXCR4, как у родительского антитела, время полужизни которого было увеличено. Такие функциональные фрагменты будут подробно описаны ниже в данном описании.

Под «производным соединением» или «производным» антитела понимается, в частности, связывающий белок, содержащий пептидную матрицу и по меньшей мере один из CDR исходного антитела для поддержания способности распознавать CXCR4. Такие производные соединения, хорошо известные специалистам в данной области, будут описаны более подробно в данном описании. В другом воплощении изобретения, производное соединение или производное может содержать по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно 4, еще более предпочтительно 5 или, наиболее предпочтительно, 6 CDR исходного антитела.

Более предпочтительно изобретение содержит гуманизированные антитела, их производные соединения или их функциональные фрагменты в соответствии с данным изобретением, полученные путем генетической рекомбинации или химического синтеза.

В соответствии с предпочтительным воплощением гуманизированное антитело в соответствии с изобретением или его производные соединения или функциональные фрагменты характеризуются тем, что они состоят из моноклональных антител.

Под «моноклональным антителом» понимается антитело, полученное из популяции существенно однородных антител. Более конкретно отдельные антитела популяции являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минимальных пропорциях. Иными словами, моноклональное антитело представляет собой однородное антитело, полученное в результате роста отдельного клона клеток (например, гибридомы, эукариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело, прокариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело и т.д.), и в целом характеризуется тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела высоко специфичны и направлены против одного антигена. Кроме того, в отличие от получения поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант, или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена.

Здесь следует понимать, что изобретение не относится к гуманизированным антителам в природной форме, то есть они взяты не из их природной среды, но что они выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и, таким образом, они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

В частности, в соответствии с предпочтительным воплощением изобретения гуманизированное антитело или его производные соединения или функциональные фрагменты характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный среди CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID №№4, 5 или 6, или по меньшей мере один CDR последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания последовательностям SEQ ID №№4, 5 или 6; или они содержат легкую цепь, содержащую по меньшей мере один CDR, выбранный среди CDR аминокислотных последовательностей SEQ ID №№7, 8 или 9, или по меньшей мере один CDR последовательности, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентична после оптимального выравнивания последовательностям SEQ ID №№7, 8 или 9.

Предпочтительным образом гуманизированные антитела изобретения или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID №4 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №4;

- CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID №5 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №5; и

- CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID №6 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №6.

В соответствии с частным воплощением антитела или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат тяжелую цепь, содержащую CDR-H1 с последовательностью SEQ ID №4, CDR-H2 с последовательностью SEQ ID №5 и CDR-H3 с последовательностью SEQ ID №6.

Еще более предпочтительно антитела изобретения или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID №7 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №7;

- CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID №8 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №8, и

- CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID №9 или последовательность, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98%, идентичную после оптимального выравнивания последовательности SEQ ID №9.

В соответствии с частным воплощением антитела или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов характеризуются тем, что они содержат легкую цепь, содержащую CDR-L1 с последовательностью SEQ ID №7, CDR-L2 с последовательностью SEQ ID №8 и CDR-L3 с последовательностью SEQ ID №9.

В данном описании термины «полипептиды», «полипептидные последовательности», «пептиды» и «белки», применяемые по отношению к соединениям антителам или их последовательностям, являются взаимозаменяемыми.

Здесь следует понимать, что изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть они взяты не из их природной среды, но они выделены или получены путем очистки из природных источников, либо получены путем генетической рекомбинации, либо путем химического синтеза, и, таким образом, они могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

Уникальная нумерация IMGT была создана для сравнения вариабельных доменов независимо от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, С., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда занимают одну и ту же позицию, например цистеин 23 (1-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT предусматривает стандартизированное разграничение каркасных участков (FR1-IMGT: позиции 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-1MGT: 118-128) и участков, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Т.к. разрывы представляют собой незанятые позиции, то длины CDR-IMGT (показаны в скобках и разделены точками, например [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в 2D-графических представлениях, обозначенных как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D-структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Существует три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Термин «CDR» в единственном или множественном числе используется здесь для обозначения в зависимости от случая одного из этих участков или нескольких, или даже всех этих участков, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинное связывание антитела с антигеном или эпитопом, который оно распознает.

В контексте данного изобретения «процент идентичности» двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей обозначает процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков в двух сравниваемых последовательностях, полученный после оптимального выравнивания; этот процент не чисто статистический, и различия между двумя последовательностями распределяются случайным образом по всей их длине. Сравнение двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей традиционно проводится путем сравнения этих последовательностей после выравнивания их оптимальным образом; указанное сравнение может осуществляться по сегментам или с помощью «окна выравнивания». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено, в дополнение к ручному, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита-Уотермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Нидлмана-Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], с помощью способа поиска сходства Пирсона и Липмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444) или с помощью компьютерного программного обеспечения с использованием этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, либо с помощью программного обеспечения для сравнения BLAST NR или BLAST Р).

Процент идентичности двух нуклеиновокислотных или аминокислотных последовательностей определяют путем сравнения двух последовательностей, выровненных оптимальным образом, при этом сравниваемая нуклеиновокислотная или аминокислотная последовательность может включать добавления или делеции по сравнению с референсной последовательностью для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент идентичности рассчитывается путем определения числа позиций, в которых нуклеотид или аминокислотный остаток идентичен в двух последовательностях, предпочтительно в двух полных последовательностях, деления этого количества идентичных позиций на общее количество позиций в окне выравнивания и умножения полученного результата на 100, чтобы получить процент идентичности этих двух последовательностей.

Например, программа BLAST «BLAST 2 sequences» (Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250), доступная на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, может быть использована с параметрами по умолчанию (в частности, с параметрами «штраф за открытие делеции»: 5 и «штраф за удлинение делеции»: 2; выбранной матрицей будет, например, матрица «BLOSUM 62», предложенная в программе); процентная идентичность двух сравниваемых последовательностей рассчитывается непосредственно в программе.

Среди аминокислотных последовательностей, имеющих по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98% идентичности с референсной аминокислотной последовательностью, предпочтительными примерами являются те, которые содержат референсную последовательность, определенные модификации, в частности делецию, добавление или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или удлинение. В случае замены одной или более чем одной последовательной или непоследовательной аминокислоты предпочтительными являются такие замены, в которых замененные аминокислоты заменены «эквивалентными» аминокислотами. Выражение «эквивалентные аминокислоты» используется здесь для обозначения любых аминокислот, которые могут быть заменены одной из структурных аминокислот, но без значительной модификации биологических активностей соответствующих антител и таких специфических примеров, какие будут определены позже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо на основании их структурной гомологии с аминокислотами, которые они заменяют, либо по результатам сравнительных исследований биологической активности различных антител, на которую они способны.

В качестве неограничивающего примера приведенная ниже таблица 1 показывает замены, возможные без получения значительной модификации биологической активности соответствующего модифицированного антитела; обратные замены, разумеется, также возможны в тех же условиях.

Таблица 1 Исходный остаток Замена(ы) Ala (A) Val, Gly, Pro Arg (R) Lys, His Asn (N) Gln Asp (D) Glu Cys (С) Ser Gln (Q) Asn Glu (G) Asp Gly (G) Ala His (H) Arg Ile (I) Leu Leu (L) Ile, Val, Met Lys (K) Arg Met (M) Leu Phe (F) Tyr Pro (P) Ala Ser (S) Thr, Cys Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Phe, Trp Val (V) Leu, Ala

Специалистам в данной области известно, что на текущем уровне техники наибольшая вариабельность (длины и состава) среди шести CDR находится в трех CDR тяжелой цепи, и, в частности, в CDR-H3 этой тяжелой цепи. Следовательно, будет очевидно, что предпочтительными характерными CDR антител изобретения или одного из их производных соединений или функциональных фрагментов будут три CDR тяжелой цепи.

Другое воплощение изобретения раскрывает антитело или его производные соединения или функциональные фрагменты, содержащие тяжелую цепь с тремя следующими CDR:

CDR-H1 с последовательностью SEQ ID №4 или с последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентичной после оптимального соответствия последовательности SEQ ID №4;

CDR-H2 с последовательностью SEQ ID №5 или с последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентичной после оптимального соответствия последовательности SEQ ID №5; и

CDR-H3 с последовательностью SEQ ID №6 или с последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентичной после оптимального соответствия последовательности SEQ ID №6;

и легкую цепь с тремя следующими CDR:

CDR-L1 с последовательностью SEQ ID №7 или с последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентичной после оптимального соответствия последовательности SEQ ID №7;

CDR-L2 с последовательностью SEQ ID №8 или с последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентичной после оптимального соответствия последовательности SEQ ID №8; и

CDR-L3 с последовательностью SEQ ID №9 или с последовательностью, по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 85%, 90%, 95% и 98% идентичной после оптимального соответствия последовательности SEQ ID №9.

Другой аспект изобретения относится к функциональным фрагментам гуманизированного антитела, описанного выше. Специалисту в данной области будет очевидно, что функциональный фрагмент обязательно является связывающим фрагментом, т.е. фрагментом, способным связываться с той же мишенью, что и родительское антитело. Кроме того, функциональный фрагмент сохраняет функцию родительского антитела. В частности, функциональный фрагмент изобретения способен модулировать активацию CXCR4. Более предпочтительно, функциональный фрагмент в соответствии с изобретением способен ингибировать активацию CXCR4. В одном воплощении активация CXCR4 является лиганд-зависимой; в другом воплощении указанная активация CXCR4 является лиганд-независимой.

В предпочтительном воплощении функциональный фрагмент изобретения сохраняет функцию родительского антитела, состоящую в модуляции активности гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2. Предпочтительно, указанные функциональные фрагменты сохраняют способность ингибировать активность гетеродимерного комплекса CXCR4/CXCR2.

Более конкретно, изобретение нацелено на антитело или его производные соединения или функциональные фрагменты, характеризующиеся тем, что указанный функциональный фрагмент выбран среди фрагментов Fv, Fab, F(ab')₂, Fab', scFv, scFv-Fc или димерных антител или любых фрагментов, время полужизни которых было увеличено, например пегилированных фрагментов.

Такие функциональные фрагменты антитела в соответствии с изобретением состоят, например, из фрагментов Fv, scFv (sc обозначает одну цепь), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc, или димерных антител или любых фрагментов, время полужизни которых было увеличено в результате химической модификации, такой как добавление полиалкиленгликоля, такого как полиэтиленгликоль (пегилирование) (пегилированные фрагменты называются Fv-ПЭГ, scFv-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab')₂-ПЭГ или Fab'-ПЭГ), либо путем включения в липосому; микросферу или PLGA (частицы на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот), при этом указанный фрагмент имеет по меньшей мере один характерный CDR гуманизированного антитела изобретения, который способен проявлять в общем виде даже частичную активность антитела, из которого он взят.

Предпочтительно указанные функциональные фрагменты будут состоять из или включать частичную последовательность вариабельной тяжелой или легкой цепи антитела, из которого они получены, при этом указанная частичная последовательность должна быть достаточной, чтобы сохранить такую же специфичность связывания, как у антитела, из которого она получена, и достаточную аффинность, предпочтительно равную по меньшей мере 1/100, более предпочтительно по меньшей мере 1/10 аффинности антитела, из которого она получена.

Такой функциональный фрагмент будет содержать как минимум 5 аминокислот, предпочтительно 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 или 100 последовательных аминокислот последовательности антитела, из которого он получен.

Предпочтительно этими функциональными фрагментами будут фрагменты типа Fv, scFv, Fab, F(ab')₂, F(ab'), scFv-Fc или димерные антитела, которые в целом имеют такую же специфичность связывания, как и антитело, из которого они получены. В соответствии с данным изобретением фрагменты антитела изобретения могут быть получены из антител описанными выше способами, такими как расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщепление дисульфидных мостиков путем химического восстановления. Фрагменты антитела также могут быть получены с помощью методик генетической рекомбинации, также известных специалистам в данной области, или путем пептидного синтеза, например с помощью автоматических пептидных синтезаторов, например, поставляемых компанией Applied Biosystems, и т.д.

Более конкретно, изобретение относится к различным вариантам гуманизированного антитела мышиного MKA 515Н7, которые рассматриваются в данном описании как i) MKA HZ515H7, Hz515H7 или nz515H7, ii) MKA HZ515H7-2, Hz515H7-2 или hz515H7-2, или iii) любое сочетание легкой цепи и/или тяжелой цепи указанных вариантов антител.

Для большей ясности в таблице 2а ниже представлены различные аминокислотные последовательности, соответствующие CDR гуманизированных вариантов (также называемых формами) nz515H7 и hz515H7-2 изобретения; в таблице 2b приведены различные аминокислотные последовательности, соответствующие вариабельным доменам и последовательностям полной длины различных вариантов гуманизированной формы nz515H7 изобретения; в таблице 2 с приведены различные аминокислотные последовательности, соответствующие вариабельным доменам и последовательностям полной длины гуманизированной формы hz515H7-2 изобретения.

Таблица 2а Антитело Hz515H7 Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID № CDR CDR-H1 - 4 CDR-H2 - 5 CDR-H3 - 6 - CDR-L1 7 - CDR-L2 8 - CDR-L3 9

Таблица 2b Антитело Hz515H7 Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID № Вариабельные домены VH1 - 10 VH1 D76N - 11 VH1 V48L D76N - 12 VH2 - 13 - VL1 14 - VL1T59AE61D 15 - VL2 16 - VL2.1 17 - VL2.2 18 - VL2.3 19 - VL3 20 Полные последовательности (без сигнального пептида) VH1 - 21 VH1 D76N - 22 VH1 V48L D76N - 23 VH2 - 24 - VL1 25 - VL1 T59AE61D 26 - VL2 27 - VL2.1 28 - VL2.2 29 - VL2.3 30 - VL3 31 Таблица 2с Антитело Hz515H7 Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID № Вариабельные домены «консенсусные» - 85 - «консенсусные» 86 VH1 - 87 - VL1 88 Полные последовательности (без сигнального пептида) «консенсусные» - 89 - «консенсусные» 90 VH1 - 91 - VL1 92

В качестве примера, во избежание сомнений, выражение «VH1» подобно выражениям «VH Вариант 1», «VH вариант 1», «VH Var 1» или «VH var 1». Получение «консенсусных» последовательностей описано в примере 22.

Другой конкретный аспект данного изобретения относится к гуманизированному антителу или его производным соединениям или функциональным фрагментам, характеризующимся тем, что константные участки легкой цепи и тяжелой цепи, полученные из человеческого антитела, являются соответственно участками лямбда или каппа и гамма-1, гамма-2 или гамма-4.

Изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать моноклональное антитело, зарегистрированной во Французской коллекции культур микроорганизмов (CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция) 25 июня 2008 под номером 1-4019. Указанная гибридома была получена путем слияния спленоцитов иммунизированных мышей Balb/c и клеток миеломной линии Sp 2/O-Ag 14.

Мышиное моноклональное антитело, обозначаемое в данном документе как 515Н7, секретируется гибридомой, зарегистрированной в CNCM 25 июня 2008 под номером 1-4019.

Изобретение также описывает химерные антитела.

Химерное антитело представляет собой антитело, которое содержит природный вариабельный участок (легкой цепи и тяжелой цепи), полученный из антитела данного вида, в сочетании с константными участками легкой цепи и тяжелой цепи антитела вида, гетерологичного указанному данному виду.

Эти антитела или их химерные фрагменты могут быть получены с помощью методик генетической рекомбинации. Например, химерное антитело может быть получено путем клонирования рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельный участок нечеловеческого, особенно мышиного, моноклонального антитела в соответствии с изобретением, и последовательность, кодирующую константный участок человеческого антитела. Химерное антитело в соответствии с изобретением, закодированное таким рекомбинантным геном, будет, например, химерой мыши и человека, при этом специфичность этого антитела будет определяться вариабельным участком, полученным из мышиной ДНК, а его изотип будет определяться константным участком, полученным из человеческой ДНК. Для способов получения химерных антител можно, например, сослаться на Verhoeyn etal. (BioEssays, 8:74, 1988).

В другом воплощении изобретение относится к тяжелой цепи химерного антитела (называемой с515Н7 VH), содержащей вариабельный участок с последовательностью SEQ ID №83.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи химерного антитела (называемой с515Н7 VL), содержащей вариабельный участок с последовательностью SEQ ID №84.

В частном предпочтительном воплощении химерное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент изобретения содержит последовательность тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID №83, и последовательность легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID №84.

Термин «гуманизированное антитело», используемый в данном документе, относится к антителу, которое содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, при этом указанные тяжелая и легкая цепи содержат CDR-участки, полученные из антитела нечеловеческого происхождения, а другие части молекулы антитела получены из одного (или нескольких) человеческих антител. Под выражением «гуманизированное антитело» данное изобретение также подразумевает антитела только с одной гуманизированной цепью, второй химерной или мышиной цепью. Предпочтительно, «гуманизированное антитело» изобретения состоит из двух гуманизированных цепей, т.е. и тяжелая цепь, и легкая цепь являются гуманизированными.

Гуманизированные антитела изобретения или их фрагменты могут быть получены с помощью методик, известных специалистам в данной области (например таких, которые описаны в документах Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; и Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). Такие Гуманизированные антитела являются предпочтительными для их применения в способах, используемых в диагностике in vitro или профилактике и/или терапевтическом лечении in vivo. Другой методикой гуманизации, также известной специалистам в данной области, является, например, методика «CDR-прививки», описанная PDL в патентах ЕР 0451261, ЕР 0682040, ЕР 09127, ЕР 0566647 или US 5530101, US 6180370, US 5585089 и US 5693761. Также можно отметить патенты США 5639641 или 6054297, 5886152 и 5877293.

Изобретение относится к гуманизированным антителам, полученным из мышиного антитела 515Н7, описанного выше.

В предпочтительном виде константные участки легких цепей и тяжелых цепей, полученные из человеческого антитела, являются, соответственно, участками лямбда или каппа и гамма-1, гамма-2 или гамма-4.

Более конкретно, изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела, содержащей i) каркасный участок, гомологичный соответствующему каркасному участку тяжелой цепи человеческого антитела, и ii) CDR, гомологичные соответствующим CDR антитела, полученного из различных видов млекопитающих, где указанные CDR включают CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащие соответственно последовательности SEQ ID №№4, 5 и 6

Другими словами, изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела, содержащей CDR, состоящие из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, при этом указанные CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 соответственно содержат последовательности SEQ ID №№4, 5 и 6. Специалисту в данной области будет очевидно, что различные зародышевые линии могут быть выбраны для гуманизации антитела 515Н7, давая затем различные формы гуманизированного 515Н7. В частности, в предпочтительном не ограничивающем воплощении различные зародышевые линии могут быть использованы для кодирования последовательности v-генов, в то время как те же зародышевые линии будут сохранять j-гены.

Для данного изобретения зародышевые линии, которые могут быть использованы, выбраны на основании двух дополнительных критериев:

- длина в аминокислотах для каждого CDR должна быть идентична для мышиного CDR и эквивалентной зародышевой линии, и

- зародышевая последовательность по аминокислотам должна иметь по меньшей мере 70% идентичность с родительской мышиной последовательностью.

Во избежание сомнений, здесь напоминается о том, что данное изобретение охватывает две предпочтительные не ограничивающие гуманизированные формы (также называемые версиями) одного и того же антитела 515Н7. Первая из них, называемая Hz515H7, состоит из гуманизированного антитела, полученного с зародышевыми линиями IGHV3-49*04 (SEQ ID №77) и IGHJ4*01 (SEQ ID №81) для тяжелой цепи и IGKV4-1*01 (SEQ ID №78) и IGKJ1*01 (SEQ ID №82) для легкой цепи. Вторая, называемая Hz515H7-2, состоит из гуманизированного антитела, полученного с зародышевых линий IGHV3-73*01 (SEQ ID №79) и IGHJ4*01 (SEQ ID №81) для тяжелой цепи и IGKV2D-40*01 (SEQ ID №80) и IGKJ1*01 (SEQ ID №82) для легкой цепи.

В другом воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела Н515Н7, содержащей вариабельную область с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№10, 11, 12, 13, 85 или 87.

В другом воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела Н515Н7, содержащей вариабельную область с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№10, 11, 12 или 13.

В другом воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела H515H7-2, содержащей вариабельную область с последовательностью SEQ ID №85.

В другом воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2, содержащей вариабельную область с последовательностью SEQ ID №87.

В еще одном воплощении изобретение относится к вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2 с последовательностью SEQ ID №87, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H35S, V48L, R50F, A61D, D76N и A81L.

В еще одном воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела, содержащей полную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №№21, 22, 23, 24, 89 или 91.

В еще одном воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела, содержащей полную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №№21, 22, 23 или 24.

В другом воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2, содержащей полную последовательность SEQ ID №89.

В другом воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2, содержащей полную последовательность SEQ ID №91.

В еще одном воплощении изобретение относится к тяжелой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2 с последовательностью SEQ ID №91, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H35S, V48L, R50F, A61D, D76N и A81L.

Более конкретно, изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела, содержащей i) каркасный участок, гомологичный соответствующему каркасному участку легкой цепи человеческого антитела, и ii) CDR, гомологичные соответствующим CDR антитела, полученного из различных видов млекопитающих, где указанные CDR включают CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно последовательности SEQ ID №№7, 8 и 9.

Другими словами, изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела с CDR, включающими CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где указанные CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 соответственно содержат SEQ ID №№7, 8 и 9.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела, содержащей вариабельную область с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 или 88.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела Н515Н7, содержащей вариабельную область с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела H515H7-2, содержащей вариабельную область с последовательностью SEQ ID №86.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2, содержащей вариабельную область с последовательностью SEQ ID №88.

В еще одном воплощении изобретение относится к вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2 с последовательностью SEQ ID №88, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из L9S, I21M, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y и/или V89L.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела, содержащей полную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №№25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 или 92.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела Н515Н7, содержащей полную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №№25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2, содержащей полную последовательность SEQ ID №90.

В другом воплощении изобретение относится к легкой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2, содержащей полную последовательность SEQ ID №92.

В еще одном воплощении изобретение также относится к легкой цепи гуманизированного антитела Н515Н7-2 с последовательностью SEQ ID №92, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из L9S, I21M, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y и/или V89L.

Более конкретно, изобретение относится к гуманизированному антителу или его производному соединению или функциональному фрагменту, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую и легкую цепи, каждая из которых имеет i) каркасные участки, гомологичные соответствующим каркасным участкам тяжелой и легкой цепей человеческого антитела, и ii) CDR, гомологичные соответствующим CDR антитела, полученного от различных видов млекопитающих, где указанные CDR включают CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 тяжелой цепи, содержащие соответственно последовательности SEQ ID №№4, 5 и 6, и CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащие соответственно последовательности SEQ ID №№7, 8 и 9.

Другими словами, изобретение относится к гуманизированному антителу или его производному соединению или функциональному фрагменту, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую и легкую цепи, где указанная тяжелая цепь имеет CDR, включающие CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, а указанная легкая цепь имеет CDR, включающие CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где указанные CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 содержат соответственно последовательности SEQ ID №№4, 5 и 6, а указанные CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат соответственно SEQ ID №№7, 8 и 9.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№10, 11, 12, 13, 83, 85 или 87, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 84, 86 или 88.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №№10, 11, 12 или 13, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №85 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID №86.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID №88.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №85 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID №88.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID №86.

В еще одном воплощении изобретение также относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H35S, V48L, R50F, A61D, D76N и A81L, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из D40A, L43Q, Y59A, A61D, S69T, G74E и D76Y.

В еще одном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу, содержащему гуманизированную тяжелую цепь в сочетании с химерной легкой цепью.

В еще одном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу, содержащему химерную тяжелую цепь в сочетании с гуманизированной легкой цепью.

В частности, изобретение описывает гуманизированное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 или 88.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №14.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL1 Т59А E61D или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №15.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №16.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL2.1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №17.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL2.2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №18.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL2.3 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №19.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL3 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №20.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №86.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу с515Н7 VH/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №83 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88.

В другом воплощении изобретение описывает гуманизированное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, содержащей из SEQ ID №№10, 11, 12, 13, 85 или 87, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №84.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1/c515H7 VL или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №10 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №84.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 D76N/c515H7 VL или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №84.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 V48L D76N/c515H7 VL или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №12 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №84.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH2/c515H7 VL или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №13 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №84.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №85 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №84.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/c515H7 VL или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №84.

В еще одном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№21, 22, 23, 24, 89 или 91, и легкую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№25, 26, 27, 28,29,30, 31, 90 или 92.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7, содержащему тяжелую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№21, 22, 23 или 24, и легкую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №89 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №90.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92.

В другом воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Н515Н7-2, содержащему тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H35S, V48L, R50F, A61D, D76N и A81L, и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92, которая содержит одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из D40A, L43Q, Y59A, A61D, S69T, G74E и D76Y.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 D76N VL2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №16.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 D76N VL2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №27.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL2.1 D76N или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №17.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL2.1 D76N или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №28.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL2.2 D76N или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №18.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL2.2 D76N или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №29.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL2.3 D76N или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №19.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL2.3 D76N или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №30.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1, или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №12 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №14.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 V48L D76N VL1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №23 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №25.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 V48L D76N Т59А VL1 E61D или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №12 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №15.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 V48L D76N Т59А VL1 E61D или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №23 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №26.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №10 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №14.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 VL1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №21 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №25.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №10 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 D76N/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 V48L D76N/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №12 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH2/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №13 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №21 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 D76N/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1 V48L D76N/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №23 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92.

В другом предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH2/Hz515H7 VL1-2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №24 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №14.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL1 Т59А E61D или или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №15.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №16.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №17.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №18.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.3 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №19.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL3 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №20.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №25.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL1 Т59А E61D или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №26.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №27.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.1 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №28.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.2 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №29.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL2.3 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №30.

В предпочтительном воплощении изобретение относится к гуманизированному антителу Hz515H7 VH1-2/Hz515H7 VL3 или его производному соединению или функциональному фрагменту, содержащим тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №31.

Следует понимать, что приведенные выше примеры комбинаций VH/VL не являются ограничивающими. Специалист в данной области мог бы, конечно, без излишних расходов и без применения изобретательских навыков переставить все VH и VL, раскрытые в данном описании. Специалист может, таким образом, получить все гуманизированные антитела, соответствующие всем комбинациям всех VH и VL, раскрытых в данной заявке.

Новый аспект данного изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, характеризующейся тем, что она выбрана среди следующих нуклеиновых кислот (включая любой вырожденный генетический код):

а) нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, кодирующей тяжелую цепь гуманизированного антитела или ее производное соединение или функциональный фрагмент в соответствии с данным изобретением;

б) нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, кодирующей легкую цепь гуманизированного антитела, или ее производное соединение или функциональный фрагмент в соответствии с данным изобретением;

в) нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, кодирующей гуманизированное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент в соответствии с данным изобретением;

г) нуклеиновой кислоты, комплементарной нуклеиновой кислоте, определенной в а), б) или в);

д) нуклеиновой кислоты длиной не менее 18 нуклеотидов, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости по меньшей мере с тяжелой цепью, содержащей нуклеиновокислотные последовательности SEQ ID №№38-41, 49-52, 93 или 95, предпочтительно по меньшей мере с тремя CDR в соответствии с CDR-нумерацией IMGT или Кабата; и

е) нуклеиновой кислоты длиной не менее 18 нуклеотидов, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости по меньшей мере с легкой цепью, содержащей нуклеиновокислотные последовательности SEQ ID №№42-48, 53-59, 94 или 96, предпочтительно по меньшей мере с тремя CDR в соответствии с CDR-нумерацией IMGT или Кабата.

Изобретение также относится к выделенной нуклеиновокислотной молекуле, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, при этом нуклеотидная последовательность указанной вариабельной области тяжелой цепи содержит нуклеотидную последовательность CDR-H1 SEQ ID №32, нуклеотидную последовательность CDR-H2 SEQ ID №33 и нуклеотидную последовательность CDR-H3 SEQ ID №34.

Изобретение также относится к выделенной нуклеиновокислотной молекуле, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, при этом нуклеотидная последовательность указанной вариабельной области легкой цепи содержит нуклеотидную последовательность CDR-L1 SEQ ID №35 или 60; нуклеотидную последовательность CDR-L2 SEQ ID №36 или 61 и нуклеотидную последовательность CDR-L3 SEQ ID №37 или 62.

Изобретение также относится к выделенной нуклеиновокислотной молекуле, содержащей нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела,

при этом нуклеотидная последовательность указанной вариабельной области тяжелой цепи включает нуклеотидную последовательность CDR-H1 SEQ ID №32; нуклеотидную последовательность CDR-H2 SEQ ID №33 и нуклеотидную последовательность CDR-H3 SEQ ID №34;

а нуклеотидная последовательность указанной вариабельной области легкой цепи включает нуклеотидную последовательность CDR-L1 SEQ ID №35 или 60, нуклеотидную последовательность CDR-L2 SEQ ID №36 или 61 и нуклеотидную последовательность CDR-L3 SEQ ID №37 или 62.

В таблице 3а ниже представлены оптимизированные нуклеотидные последовательности, соответствующие CDR антитела hz515H7 изобретения; в таблице ЗЬ приведены различные оптимизированные нуклеотидные последовательности, соответствующие вариабельным доменам и последовательностям полной длины различных вариантов гуманизированного антитела hz515H7 изобретения. В таблице 3с приведены различные оптимизированные нуклеотидные последовательности, соответствующие вариабельным доменам и последовательностям полной длины гуманизированной версии hz515H7-2 изобретения.

Таблица 3а Антитело Hz515H7 Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID № оптимизированный CDR CDR-H1 - 32 CDR-H2 - 33 CDR-H3 - 34 - CDR-L1 35   CDR-L1 (bis) 60 - CDR-L2 36   CDR-L2 (bis) 61 - CDR-L3 37   CDR-L3 (bis) 62

Таблица 3b Антитело Hz515H7 Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID № Вариабельные домены VH1 - 38 VH1 D76N - 39 VH1 V48L D76N - 40 VH2 - 41 - VL1 42 - VL1 T59AE61D 43 - VL2 44 - VL2.1 45 - VL2.2 46 - VL2.3 47 - VL3 48 Полные последовательности (без сигнального пептида) VH1 - 49 VH1 D76N - 50 VH1 V48L D76N - 51 VH2 - 52 - VL1 53 - VL1 T59AE61D 54 - VL2 55 - VL2.1 56 - VL2.2 57 - VL2.3 58 - VL3 59 Таблица 3с Антитело Hz515H7-2 Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID № Вариабельные домены VH1 - 93 - VL1 94 Полные последовательности (без сигнального пептида) VH1 - 95 - VL1 96

Выражение «оптимизированная последовательность» означает, что кодоны, кодирующие конститутивные аминокислоты белка, представляющего интерес (в данном случае это Вариабельные домены антитела), были оптимизированы для лучшего распознавания машиной трансляции в специальном типе клеток, в данном случае в клетках млекопитающих. В связи с этим, аминокислотная последовательность данного белка, кодируемая оптимизированной последовательностью, идентична неоптимизированной последовательности, но нуклеотидные последовательности различаются. Оптимизация также включает адаптацию содержания G/C и предотвращение стабильной вторичной структуры РНК (в качестве примера см. Kim et al., 1997 Gene199(1-2):293-301).

Например, нуклеотидная последовательность мышиного CDR-H1 (SEQ ID №71) была оптимизирована и соответствует нуклеотидной последовательности гуманизированного CDR-H1 (SEQ ID №32), где кодоны ggg, act и gat (кодирующие остатки Gly, Thr и Asp, соответственно) были заменены на кодоны ggc, асе и дас, соответственно (также кодирующие остатки Gly, Thr и Asp, соответственно).

Что касается CDR-H2 и CDR-H3 (SEQ ID №№72 и 73, соответственно), они также были оптимизированы и соответствовали CDR с SEQ ID №№33 и 34, соответственно.

То же самое и для трех CDR легкой цепи (SEQ ID №№74, 75 и 76, соответственно) с двумя оптимизированными гуманизированными формами, соответствующими VL1, VL2 и VL3 (SEQ ID №№35, 36 и 37, соответственно) и VL2.1, VL2.2 и VL2.3 (SEQ ID №№60, 61 и 62, соответственно).

В следующей таблице 4 приведены исходные CDR, т.е. мышиные неоптимизированные последовательности.

Таблица 4 Антитело 515Н7 Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID № мышиный CDR1 CDR-H1 - 71 CDR-H2 - 72 CDR-H3 - 73 - CDR-L1 74 - CDR-L2 75 - CDR-L3 76

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность», «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двуцепочечной ДНК, либо одноцепочечной ДНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать выделенные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью клеток-хозяев, или полученные путем химического синтеза.

Под «нуклеиновыми последовательностями, демонстрирующими процент идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно 85%, 90%, 95% и 98%, после оптимального выравнивания с предпочтительной последовательностью» понимают нуклеиновые последовательности, демонстрирующие по сравнению с референсной нуклеотидной последовательностью определенные модификации, такие как, в частности, делецию, усечение, удлинение, химерное слияние и/или замещение, в частности, точечное. Предпочтительно это последовательности, которые кодируют те же самые аминокислотные последовательности, что и референсная последовательность, и связаны с вырождением генетического кода, или комплементарные последовательности, которые могут специфически гибридизироваться с референсными последовательностями, предпочтительно в условиях высокой жесткости, в частности таких, которые определены ниже.

Гибридизация в условиях высокой жесткости означает, что температурные условия и условия ионной силы выбирают таким образом, чтобы они позволяли сохранять гибридизацию двух комплементарных фрагментов ДНК. Исключительно в качестве примера, условия высокой жесткости этапа гибридизации для определения полинуклеотидных фрагментов, описанных выше, преимущественно являются следующими.

ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизацию осуществляют в два этапа: (1) прегибридизация при 42°С в течение трех часов в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,5), содержащем 5×SSC (цитратно-солевой буфер) (1×SSC соответствует раствору 0,15 М NaCl+0,015 М цитрата натрия), 50% формамида, 7% додецилсульфата натрия (SDS), 10× раствор Денхардта, 5% сульфата декстрана и 1% ДНК спермы лосося; (2) собственно гибридизация в течение 20 часов при температуре в зависимости от длины зонда (например: 42°С для зонда длиной более 100 нуклеотидов), а затем два 20-минутных промывания при температуре 20°С в 2×SSC+2% SDS, одно 20-минутное промывание при 20°С в 0,1×SSC+0,1% SDS. Последнее промывание осуществляют в 0,1×SSC+0,1% SDS в течение 30 минут при температуре 60°С для зонда длиной более 100 нуклеотидов. Гибридизационные условия высокой жесткости, описанные выше для полинуклеотида определенного размера, специалист в данной области может адаптировать для олигонуклеотидов большей или меньшей длины в соответствии с процедурами, описанными в Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001).

Изобретение также относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту, описанную в изобретении.

Изобретение особенно нацелено на клонирующие и/или экспрессионные векторы, которые содержат такую нуклеотидную последовательность.

Векторы изобретения предпочтительно содержат элементы, которые позволяют экспрессировать и/или секретировать нуклеотидные последовательности в данной клетке-хозяине. Таким образом, вектор должен содержать промотор, сигналы инициации и терминации трансляции, а также подходящие участки регуляции транскрипции. Он должен быть способен поддерживать в стабильном состоянии клетку-хозяина и дополнительно может иметь специфические сигналы, которые обуславливают секрецию транслированного белка. Специалисты в данной области выбирают и оптимизируют эти различные элементы в соответствии с используемой клеткой-хозяином. С этой целью нуклеотидные последовательности могут быть вставлены в векторы автономной репликации в выбранном хозяине, или могут быть интегративными векторами выбранного хозяина.

Такие векторы получают с помощью способов, использующихся в настоящее время специалистами в данной области, и полученные клоны могут быть введены в подходящего хозяина с помощью стандартных способов, таких как липофекция, электропорация, тепловой шок или химические способы.

Векторы представляют собой, например, векторы плазмидного или вирусного происхождения. Они используются для трансформации клеток-хозяев, чтобы клонировать или экспрессировать нуклеотидные последовательности изобретения.

Изобретение также включает клетки-хозяева, трансформированные с помощью вектора, описанного в данном изобретении, или содержащие его.

Клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотических или эукариотических систем, например, бактериальных клеток, а также дрожжевых клеток или клеток животных, в частности клеток млекопитающих. Можно также использовать клетки насекомых или растений.

Изобретение также касается животных, за исключением человека, которые содержат по меньшей мере одну трансформированную клетку в соответствии с изобретением.

Другой аспект изобретения связан со способом продукции антитела в соответствии с изобретением или одного из его функциональных фрагментов, который характеризуется тем, что включает следующие этапы:

а) культивирование клетки-хозяина в соответствии с изобретением в среде в подходящих культуральных условиях; и

б) выделение указанного антитела или одного из его функциональных фрагментов, полученных таким образом, из культуральной среды или указанных культивируемых клеток.

Трансформированные клетки в соответствии с изобретением могут быть использованы в способах получения рекомбинантных полипептидов в соответствии с изобретением. Способы получения полипептида в соответствии с изобретением в рекомбинантной форме, характеризующиеся использованием вектора и/или клетки, трансформированной вектором в соответствии с изобретением, также входят в данное изобретение. Предпочтительно клетку, трансформированную вектором в соответствии с изобретением, культивируют в условиях, которые позволяют экспрессировать указанный полипептид, и указанный рекомбинантный пептид выделяют.

Как уже было сказано, клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотических или эукариотических систем. В частности, можно определить нуклеотидные последовательности изобретения, содействующие секреции в такой прокариотической или эукариотической системе. Вектор в соответствии с изобретением, несущий такую последовательность, таким образом, может быть выгодно использован для продукции рекомбинантных белков, предназначенных для секреции. Действительно, очистке этих целевых рекомбинантных белков будет способствовать тот факт, что они находятся в супернатанте клеточной культуры, а не внутри клеток-хозяев.

Также можно получить полипептиды изобретения путем химического синтеза. Такой способ получения также является предметом изобретения. Специалисту в данной области известны способы химического синтеза, например, методики с использованием твердых фаз (в частности, см. Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.) или методики с использованием частично твердых фаз, путем конденсации фрагментов или путем классического синтеза в растворе. Полипептиды, полученные путем химического синтеза и способные содержать соответствующие неприродные аминокислоты, также входят в изобретение.

Антитела или их производные соединения или функциональные фрагменты, которые могут быть получены с помощью способа изобретения, также входят в данное изобретение.

В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение относится к антителу, описанному выше, которое характеризуется тем, что оно, кроме того, способно специфически связываться с рецептором семейства человеческих хемокинов и/или способно специфически ингибировать передачу сигнала от такого рецептора.

В соответствии с новым воплощением изобретение относится к антителу или его производным соединениям или функциональным фрагментам, состоящим из антитела, которое является биспецифическим в том смысле, что оно содержит второй мотив, способный взаимодействовать с каким-либо рецептором, вовлеченным в развитие опухолей, таким как, например, VEGFR, VEGF, EGFR, IGF-1R, HER2neu, HGF, cMET, FGF, тетраспанины, интегрины, CXCR4 (кроме антитела данного изобретения, т.е. ориентированное на другой эпитоп), CXCR7 или CXCR2.

Биспецифические или бифункциональные антитела представляют собой второе поколение моноклональных антител, в которых два различных вариабельных участка объединены в одну молекулу (Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419). Как в диагностической, так и в терапевтической областях была продемонстрирована их полезность за счет их способности привлекать новые эффекторные функции или влиять на некоторые молекулы на поверхности опухолевых клеток; такие антитела могут быть получены с помощью химических способов (Glennie MJ et al., 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995, J. Hemat., 377-382) или соматических способов (Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457; Suresh M.R. ef al., 1986, Method Enzymol., 121:210-228), а также, преимущественно, с помощью методик генной инженерии, которые делают возможной гетеродимеризацию и тем самым облегчают очистку искомого антитела (Merchand ef al., 1998, Nature Biotech., 16:677-681).

Эти биспецифические антитела могут быть построены как целый IgG, биспецифический Fab'2, Fab' ПЭГ, димер антитела или биспецифический scFv, a также как четырехвалентное биспецифическое антитело, в котором присутствует два сайта связывания для каждого целевого антигена (Park ef al., 2000, Mol. Immunol., 37(18): 1123-30), или как их фрагменты.

В дополнение к экономическим преимуществам, учитывая, что продукция и введение биспецифического антитела дешевле, чем продукция двух специфических антител, применение таких биспецифических антител обладает преимуществом в плане снижения токсичности лечения. Действительно, применение биспецифического антитела позволяет уменьшить общее количество циркулирующих антител и, следовательно, возможную токсичность.

В предпочтительном воплощении изобретения биспецифическое антитело является двухвалентным или четырехвалентным антителом.

Наконец, данное изобретение относится к описанному выше антителу или его производным соединениям или функциональным фрагментам для применения их в качестве лекарственного средства.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента соединение, включающей антитело изобретения или одно из его производных соединений или функциональных фрагментов. Предпочтительно указанное антитело доставляется эксципиентом и/или фармацевтически приемлемым носителем.

Изобретение также относится к композиции, которая характеризуется тем, что она в качестве комбинированного продукта для одновременного, раздельного или расширенного применения содержит кроме того противоопухолевое антитело, отличное от антитела, направленного против CXCR4.

В соответствии с еще одним воплощением данное изобретение также относится к описанной выше фармацевтической композиции, которая содержит по меньшей мере второе противоопухолевое соединение, выбранное среди соединений, способных специфически ингибировать тирозинкиназную активность рецепторов, таких как IGF-1R, EGFR, HER2/neu, cMET, VEGFR или VEGF, или любых других противоопухолевых соединений, известных специалистам в данной области.

Во втором предпочтительном аспекте изобретения указанное второе соединение может быть выбрано среди антиЕGFR, антиIGF-IR, антиНЕR2/neu, анти cMET, VEGFR, VEGF и т.д., выделенных, или их функциональных фрагментов или производных соединений, способных ингибировать пролиферативную, и/или антиапоптотическую, и/или ангиогенную, и/или индукционную активность метастатической диссеминации, которую поддерживают указанные рецепторы.

Также подходящими для упоминания являются антиСD20-антитела, такие как ритуксимаб, ибритумомаб или тоситумомаб; антиСD33-антитела, такие как гемтузумаб или линтузумаб; антиСD22-антитела, такие как эпратузумаб; антиСD52-антитела, такие как алемтузумаб; антиЕрСАМ-антитела, такие как эдреколомаб, Ch 17-1A или IGN-101; антитела антиСТР21 или 16, такие как Xactin; антиДНК-Ag-антитела, такие как ¹³¹I-Cotara TNT-1; антиМUС1-антитела, такие как пемтумомаб или R1150; антиМUС18-антитела, такие как АВХ-МА1; антиGD3-антитела, такие как митумомаб; антиЕСА-антитела, такие как CeaVac или лабетузумаб; антиСА125-антитела, такие как OvaRex; антиHLА-DR-антитела, такие как аполизумаб; антиСТLА4-антитела, такие как MDX-010; антиРSМА-антитела, такие как MDX-070, ¹¹¹In и ⁹⁰Y-JSQ-I, ¹⁷⁷Lu J591, J591-DM1; анти-Льюис Y-антитела (антитела к антигену Y Льюиса), такие как IGN311; антиангиогенные антитела, такие как AS1405 и 90YmuBC1; антиТrаil-R1-антитела, такие как MKA TRAIL R1 или MKA TRAIL R2.

Другое воплощение, дополняющее изобретение, состоит из композиции, описанной выше, которая в качестве комбинированного или конъюгированного продукта для одновременного, раздельного или расширенного применения содержит, помимо прочего, цитотоксический/цитостатический агент.

Под «одновременным применением» понимается введение обоих соединений композиции в единой фармацевтической форме.

Под «раздельным применением» понимается введение в одно и то же время обоих соединений композиции в различных фармацевтических формах.

Под «расширенным применением» понимается последовательное введение обоих соединений композиции, каждое в отдельной фармацевтической форме.

В целом, композиция в соответствии с изобретением значительно повышает эффективность лечения рака. Иными словами, терапевтический эффект антитела изобретения неожиданным образом усиливается при введении цитотоксического агента. Другое важное последующее преимущество, полученное с помощью композиции изобретения, касается возможности использования более низких эффективных доз активного ингредиента, что позволяет избежать или уменьшить риск проявления побочных эффектов, в частности влияний цитотоксического агента. Кроме того, эта композиция позволяет быстрее достигать ожидаемого терапевтического эффекта.

Под «терапевтическим противораковым агентом» или «цитотоксическим агентом» понимается вещество, которое при введении его пациенту лечит или предотвращает развитие рака у пациента. Неограничивающие примеры таких агентов включают «алкилирующие» агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, митотические ингибиторы, ингибиторы функционирования хроматина, антиангиогенные агенты, антиэстрогены, антиандрогены или иммуномодуляторы.

Такими агентами являются, например, агенты, упомянутые в издании VIDAL на странице, посвященной соединениям, применяемым в онкологии и гематологии, в колонке «Цитотоксические вещества»; цитотоксические соединения, цитируемые применительно к данному документу, приводятся здесь в качестве предпочтительных цитотоксических агентов.

Под «алкилирующим агентом» понимается любое вещество, которое может ковалентно связывать или алкилировать любую молекулу, предпочтительно нуклеиновую кислоту (например ДНК) в клетке. Примеры таких алкилирующих агентов включают азотные аналоги горчичного газа, такие как мехлоретамин, хлорамбуцил, мелфалан, хлоргидрат, пипоброман, преднимустин, гидрофосфат натрия или эстрамустин; оксазафосфорины, такие как циклофосфамид, алтретамин, трофосфамид, сульфофосфамид или ифосфамид; азиридины или этиленимины, такие как тиотепа, триэтиленамин или алтретамин; нитрозомочевины, такие как кармустин, стрептозоцин, фотемустин или ломустин; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, треосульфан или импросульфан; триазены, такие как дакарбазин; или платиновые комплексы, такие как цисплатин, оксалиплатин или карбоплатин.

Под «антиметаболитом» понимается вещество, которое блокирует рост и/или клеточный метаболизм, вмешиваясь в определенные виды активности, как правило, в синтез ДНК. Примеры антиметаболитов включают метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтородезоксиуридин, капецитабин, цитарабин, флударабин, цитозинарабинозид, 6-меркаптопурин (6-МР), 6-тиогуанин (6-TG), хлородезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабин, кладрибин, дезоксикоформицин и пентостатин.

Под «противоопухолевым антибиотиком» понимается соединение, которое может предотвращать или ингибировать синтез ДНК, РНК и/или белков. Примеры таких противоопухолевых антибиотиков включают доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, валрубицин, митоксантрон, дактиномицин, митрамицин, пликамицин, митомицин С, блеомицин и прокарбазин.

«Митотические ингибиторы» предотвращают нормальное развитие клеточного цикла и митоз. Как правило, ингибиторы микротрубочек, или «таксоиды», такие как паклитаксел и доцетаксел, способны ингибировать митоз. Алкалоиды Винка, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин, также способны ингибировать митоз.

К «ингибиторам хроматина» или «ингибиторам топоизомеразы» относятся вещества, которые ингибируют нормальное функционирование белков, моделирующих хроматин, таких как топоизомеразы 1 и II. Примеры таких ингибиторов включают, для топоизомеразы I, камптотецин и его производные, такие как иринотекан или топотекан, и, для топоизомеразы II, этопозид, фосфат этопозида и тенипозид.

Под «антиангиогенным агентом» понимается любой лекарственный препарат, соединение, вещество или агент, который ингибирует рост кровеносных сосудов. Примеры антиангиогенных агентов включают, не ограничиваясь ими, разоксин, маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, иломастат, CGS-27023А, галофугинон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламин, эндостатин, SU5416, SU6668, интерферон-альфа, EMD121974, интерлейкин-12, IM862, ангиостатин и витаксин.

Под «антиэстрогеном» или «антагонистом эстрогена» понимается любое вещество, которое уменьшает, противодействует или ингибирует действие эстрогена. Примерами таких агентов являются тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, анастрозол, летрозол и экземестан.

Под «антиандрогеном» или «антагонистом андрогена» понимается любое вещество, которое уменьшает, противодействует или ингибирует действие андрогена. Примеры антиандрогенов включают флутамид, нилутамид, бикалютамид, спироналоктон, ацетат ципротерона, финастерид и цимитидин.

Иммуномодуляторы представляют собой вещества, которые стимулируют иммунную систему. Примеры иммуномодуляторов включают интерферон, интерлейкины, такие как алдеслейкин, ОСТ-43, денилейкин дифтитокс и интерлейкин-2, факторы некроза опухоли, такие как тазонермин, или другие типы иммуномодуляторов, такие как лентинан, сизофиран, рохинимекс, пидотимод, пегадемаза, тимопентин, поли(I:С) (сополимер полиинозиновой и полицитидиловой кислот) или левамизол в комбинации с 5-фторурацилом.

За более подробной информацией специалист в данной области может обратиться к руководству, выпущенному под редакцией French Association of Therapeutic Chemistry Teachers и озаглавленному «Therapeutic chemistry, vol.6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer, TEC and DOC edition, 2003» (на французском языке).

В частном предпочтительном воплощении указанная композиция изобретения в качестве комбинированного продукта характеризуется тем, что указанный цитотоксический агент химически связан с указанным антителом для одновременного применения.

В частном предпочтительном воплощении указанная композиция характеризуется тем, что указанный цитотоксический/цитостатический агент выбран среди ингибиторов или стабилизаторов веретена деления, предпочтительно винорелбина и/или винфлунина и/или винкристина.

Для облегчения связывания указанного цитотоксического агента и антитела в соответствии с изобретением возможно введение между двумя соединениями, которые должны быть связаны, молекул-разделителей, например поли(алкилен)гликоля полиэтиленгликоля или аминокислот; или, в другом воплощении, использование активных производных указанных цитотоксических агентов, в которые были введены функциональные структуры, способные взаимодействовать с указанным антителом. Эти методики связывания хорошо известны специалистам в данной области и не будут более подробно рассматриваться в данном описании.

Другие ингибиторы EGFR включают, не ограничиваясь ими, моноклональные антитела С225 и антиEGFR 22 (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA) или соединения ZD-1834, ZD-1838 и ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), флуномид (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183, 805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387, 785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GMBH/Roche), Naamidine A (Bristol-board Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co), VRCTC-310 (Ventech Research), гибридный токсин EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Center Cancer), WHI-P97 (Parker Hughes Center Cancer), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) или «вакцину EGFR» (York Medical/Centro of Immunologia Molecular).

Другой аспект изобретения относится к композиции, которая характеризуется тем, что по меньшей мере одно из указанных антител или одно из их производных соединений или функциональных фрагментов комбинирован или конъюгирован с клеточным токсином и/или радиоизотопом.

Предпочтительно указанный токсин или указанный радиоизотоп способен предотвращать рост или пролиферацию опухолевой клетки, в частности, полностью инактивируя указанную опухолевую клетку.

Также предпочтительно указанный токсин представляет собой энтеробактериальный токсин, в частности, экзотоксин А от Pseudomonas.

Радиоизотопы, предпочтительно конъюгированные с терапевтическими антителами, представляют собой радиоизотопы, которые излучают гамма-лучи, и предпочтительно йод¹³¹, иттрий⁹⁰, золото¹⁹⁹, палладий¹⁰⁰, медь⁶⁷, висмут²¹⁷ и сурьму²¹¹. Радиоизотопы, которые излучают альфа- и бета-лучи, также могут быть использованы в терапии.

Под «токсином или радиоизотопом, комбинированным по меньшей мере с одним антителом изобретения или его функциональным фрагментом» понимают любое средство, позволяющее указанному токсину или указанному радиоизотопу связываться по меньшей мере с одним антителом, особенно путем ковалентного связывания двух соединений, с или без введения связывающей молекулы.

Примеры агентов, позволяющих связывать химическим (ковалентным), электростатическим или нековалентным образом все или часть элементов конъюгата, включают, в частности, бензохинон, карбодиимид и более предпочтительно EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]-карбодиимида гидрохлорид), дималеимид, дитиобис-нитробензойную кислоту (DTNB), N-сукцинимидил-3-ацетилтиоацетат (SATA), связывающие агенты, имеющие одну или более чем одну фенилазидную группу, реагирующую с ультрафиолетовыми (УФ) лучами, наиболее предпочтительно N-[-4-(азидосалициламино)бутил]-3'-(2'-пиридилдитио)-пропионамид (APDP), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и 6-гидразиноникотинамид (HYNIC).

Другая форма связывания, в частности, для радиоизотопов, может состоять в использовании бифункциональных ионных хелатирующих агентов.

Примеры таких хелатирующих агентов включают хелатирующие агенты, полученные из EDTA (этилендиаминтетрауксусной кислоты) или DTPA (диэтилентриаминпентауксусной кислоты), которые были разработаны для связывания металлов, в частности радиоактивных металлов, с иммуноглобулинами. Таким образом, DTPA и ее производные могут быть заменены различными группами в углеродной цепи в целях повышения стабильности и жесткости комплекса лиганд-металл (Krejcarek et al. (1977); Brechbielefa/. (1991); Gansow (1991); патент США 4831175).

Например, DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота) и ее производные, которые широко используются в медицине и биологии в течение длительного времени либо в своей свободной форме, либо в комплексе с ионом металла, имеет замечательную особенность формировать стабильные хелаты с ионами металла, которые могут быть связаны с белками, представляющими терапевтический или диагностический интерес, такими как антитела, для получения радиоиммуноконъюгатов для терапии рака (Meases et al., 1984; Gansow et al. 1990).

Также предпочтительно указанное по меньшей мере одно антитело изобретения, формирующее указанный конъюгат, выбирают среди его функциональных фрагментов, особенно фрагментов с удаленным Fc-компонентом, таких как scFv-фрагменты.

Данное изобретение также включает применение композиции для изготовления лекарственного средства, применяемого для профилактики или лечения рака.

Данное изобретение также относится к применению антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, предпочтительно гуманизированного, и/или композиции в соответствии с изобретением для изготовления лекарственного средства, предназначенного для ингибирования роста опухолевых клеток. Главным образом, данное изобретение также относится к применению антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, предпочтительно гуманизированного, и/или композиции для изготовления лекарственного средства для профилактики или лечения рака.

Предпочтительные раки, при которых можно проводить профилактику и/или лечение, включают рак предстательной железы, остеосаркому, рак легкого, рак молочной железы, рак эндометрия, рак толстой кишки, множественную миелому, рак яичников, рак поджелудочной железы или любой другой рак.

Изобретение также относится к применению антитела, его производного соединения или функционального фрагмента и/или композиции, описанной выше, для изготовления лекарственного препарата для модуляции CXCR4-активности в клетке.

Другой аспект данного изобретения относится к применению антитела в соответствии с описанием в способе диагностики, предпочтительно in vitro, заболеваний, связанных с уровнем экспрессии CXCR4. Предпочтительно указанными заболеваниями, связанными с белком CXCR4, в указанном диагностическом способе будут раки.

Таким образом, антитела изобретения или их производные соединения или функциональные фрагменты могут быть использованы в способе выявления и/или количественной оценки белка CXCR4 в биологическом образце in vitro, в частности, для диагностики заболеваний, связанных с ненормальной экспрессией этого белка, таких как рак, где указанный способ включает следующие этапы:

а) помещение биологического образца в контакт с антителом в соответствии с изобретением или его производным соединением или функциональным фрагментом;

б) демонстрация возможно сформированного комплекса антиген-антитело.

Таким образом, данное изобретение также включает наборы или приспособления для реализации описанного способа, включающие следующие элементы:

а) поликлональное или моноклональное антитело изобретения;

б) возможно, реагенты для составления среды, благоприятной для иммунологических реакций;

в) возможно, реагенты, которые выявляют комплексы антиген-антитела, полученные в иммунологической реакции.

В целом, данное изобретение относится к применению антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, содержащих тяжелую цепь со следующими тремя CDR, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№4, 5 и 6, и легкую цепь со следующими тремя CDR, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№7, 8, 9, для диагностики in vitro онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4, или для определения in vitro прогноза развития онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4.

Касаясь этого аспекта, данное изобретение относится, в частности, к применению тяжелой цепи гуманизированного антитела, и/или легкой цепи гуманизированного антитела, и/или гуманизированного антитела, или их производного соединения или функционального фрагмента в соответствии с изобретением для диагностистики in vitro онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4, или для определения in vitro прогноза развития онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4.

В другом аспекте данное изобретение относится к процессу обнаружения in vitro присутствия и/или локализации CXCR4-экспрессирующей опухоли у субъекта, где указанный способ включает этапы: (а) контактирование образца от субъекта с антителом или его производным соединением или функциональным фрагментом, содержащим следующие три CDR тяжелой цепи, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№4, 5 и 6, и следующие три CDR легкой цепи, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№7, 8, 9, и (б) обнаружение связывания указанного антитела с образцом.

В частности, данное изобретение направлено на процесс обнаружения in vitro присутствия и/или локализации СХСК4-экспрессирующей опухоли у субъекта, где указанный способ включает следующие этапы:

(а) контактирование образца от субъекта с тяжелой цепью гуманизированного антитела, и/или легкой цепью гуманизированного антитела, и/или гуманизированным антителом, или их производным соединением, или функциональным фрагментом в соответствии с изобретением, и

(б) обнаружение связывания указанного антитела с образцом.

В качестве неограничивающего примера такое обнаружение может быть сделано путем FACS или любой другой методики, известной специалисту в данной области.

В другом аспекте данное изобретение направлено на процесс определения in vitro уровня экспрессии CXCR4 в CXCR4-экспрессирующей опухоли у субъекта, где указанный способ включает этапы (а') контактирования образца от субъекта с антителом или его производным соединением или функциональным фрагментом, содержащим тяжелую цепь со следующими тремя CDR, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-Н3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№4, 5 и 6, и легкую цепь со следующими тремя CDR, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№7, 8, 9, и (б') обнаружения связывания указанного антитела с образцом.

В частности, данное изобретение направлено на процесс определения in vitro уровня экспрессии CXCR4 в CXCR4-экспрессирующей опухоли у субъекта, где указанный способ включает следующие этапы:

(а') контактирование образца от субъекта с тяжелой цепью гуманизированного антитела, и/или легкой цепью гуманизированного антитела, и/или гуманизированным антителом, или его производным соединением, или функциональным фрагментом в соответствии с изобретением; и

(б') количественная оценка уровня связывания антитела с CXCR4 в указанном образце.

В предпочтительном воплощении уровень экспрессии CXCR4 измеряется с помощью иммуногистохимии (IHC).

В другом аспекте данное изобретение относится к процессу диагностики in vitro CXCR4-экспрессирующей опухоли или к определению in vitro прогноза развития CXCR4-экспрессирующей опухоли, где указанный способ включает этапы: (i) определения уровня экспрессии CXCR4 в соответствии с данным изобретением, в частности, с вовлечением гуманизированных антител данного изобретения, и (ii) сравнения уровня экспрессии этапа (i) с референсным уровнем экспрессии CXCR4 в нормальной ткани.

В другом аспекте данное изобретение относится к процессу определения in vitro СХСК4-статуса опухоли у субъекта, где указанный процесс включает этапы: (1) определения уровня экспрессии CXCR4 в соответствии с данным изобретением, в частности, с вовлечением гуманизированных антител данного изобретения, (2) подсчета уровня экспрессии CXCR4 в указанной опухоли, и (3) сравнения указанного подсчета с результатом, полученным для контрольного образца.

В другом аспекте данное изобретение относится к процессу определения того, поддается ли онкогенное расстройство лечению анти-CXCR4-антителом или его фрагментом или производным, где указанный процесс включает следующие этапы:

(а) определение in vitro CXCR4-статуса опухоли субъекта в соответствии с изобретением;и

(б) если CXCR4-статус положительный, определение того, поддается ли это онкогенное расстройство лечению анти-CXCR4-антителом или его фрагментом или производным.

В другом аспекте данное изобретение относится к процессу скрининга и/или идентификации молекул CXCR4-антагонистических противоопухолевых агентов, который включает следующие этапы:

а) выбор клеток, экспрессирующих CXCR4,

б) инкубация указанных клеток с антителом или его производным соединением или функциональным фрагментом, которые содержат тяжелую цепь со следующими тремя CDR, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№4, 5 и 6, и легкую цепь со следующими тремя CDR, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№7, 8, 9, и

в) оценка анализируемых молекул на предмет потенциального ингибирования ими связывания антитела или одного из его функциональных фрагментов или производных с CXCR4, и

г) выбор молекул, способных к указанному ингибированию.

В этом аспекте данное изобретение относится к процессу скрининга и/или идентификации молекул CXCR4-антагонистических противоопухолевых агентов, который включает следующие этапы:

а) выбор клеток, экспрессирующих CXCR4,

б) инкубация указанных клеток с тяжелой цепью гуманизированного антитела, и/или легкой цепью гуманизированного антитела, и/или гуманизированным антителом, или его производным соединением, или функциональным фрагментом в соответствии с изобретением, и

в) оценка анализируемых молекул на предмет потенциального ингибирования ими связывания антитела или одного из его функциональных фрагментов или производных с CXCR4, и

г) выбор молекул, способных к указанному ингибированию.

В другом аспекте данное изобретение относится к набору, содержащему по меньшей мере антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент, которые содержат тяжелую цепь со следующими тремя CDR, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№4, 5 и 6; и легкую цепь со следующими тремя CDR, CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, соответственно с последовательностями SEQ ID №№7, 8, 9, при этом указанное антитело предпочтительно является меченым.

В этом аспекте данное изобретение относится, в частности, к набору, содержащему по меньшей мере тяжелую цепь гуманизированного антитела, и/или легкую цепь гуманизированного антитела, и/или гуманизированное антитело, или его производное соединение, или функциональный фрагмент в соответствии с изобретением, при этом указанное антитело предпочтительно является меченым.

В другом аспекте данное изобретение относится к набору в соответствии с данным изобретением для определения in vitro CXCR4-статуса опухоли, при этом указанный набор также включает:

i) реагент, используемый для обнаружения степени связывания указанного анти-CXCR4-антитела и CXCR4, и

ii) положительные и отрицательные контрольные образцы, используемые для подсчета уровня экспрессии CXCR4.

Преимущественно антитела или их функциональные фрагменты могут быть иммобилизованы на субстрате, в частности, на белковом чипе. Один из таких белковых чипов является объектом изобретения.

Преимущественно белковые чипы могут быть использованы в наборах или приспособлениях, необходимых для обнаружения и/или количественной оценки белка CXCR4 в биологическом образце.

Нужно отметить, что термин «биологический образец», используемый в данном документе, относится к образцу, взятому у живого организма (в частности, к крови, ткани, органу или другому образцу, взятому у млекопитающего, в частности, человека), или любому образцу, который может содержать один такой белок CXCR4 (такому как образец клеток, трансформированных при необходимости).

Указанное антитело или его функциональный фрагмент может находиться в форме иммуноконъюгата или меченого антитела для получения сигнала, который можно обнаружить и/или количественно оценить.

Меченые антитела изобретения или его функциональные фрагменты включают, например, конъюгаты антител (иммуноконъюгаты), которые могут быть комбинированы, например, с ферментами, такими как пероксидаза, щелочная фосфатаза, α-D-галактозидаза, глюкозооксидаза, глюкозоамилаза, карбоангидраза, ацетилхолинэстераза, лизоцим, малатдегидрогеназа или глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа, или с молекулами, такими как биотин, дигоксигенин или 5-бромдезоксиуридин. Флуоресцентные метки также могут быть комбинированы с антителами изобретения или их функциональными фрагментами, особенно включая флуоресцеин и его производные, флуорохром, родамин и его производные, зеленый флуоресцентный белок (GFP), дансил, умбеллиферон и т.д. В таких конъюгатах антитела изобретения или их функциональные фрагменты могут быть получены с помощью способов, известных специалистам в данной области. Они могут быть связаны с ферментами или флуоресцентными метками непосредственно; посредством разделительной группы или связывающей группы, такой как полиальдегид, глутаральдегид, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) или диэтиленгликольтриаминпентауксусная кислота (DPTA); либо в присутствии связывающих агентов, таких как упомянутые выше для терапевтических конъюгатов. Конъюгаты, несущие флуоресцеиновые метки, могут быть получены путем реакции с изотиоцианатом.

Другие конъюгаты могут также включать хемилюминесцентные метки, такие как люминол и диоксетан, биолюминесцентные метки, такие как люцифераза и люциферин, либо радиоактивные метки, такие как йод¹²³, йод¹²⁵, йод¹²⁶, йод¹³³, бром⁷⁷, технеций^99m, индий¹¹¹, индий^113m, галий⁶⁷, галий⁶⁸, рутений⁹⁵, рутений⁹⁷, рутений¹⁰³, рутений¹⁰⁵, меркурий¹⁰⁷, меркурий²⁰³, рений^99m, рений¹⁰¹, рений¹⁰⁵, скандий⁴⁷, теллурий^121m, теллурий^122m, теллурий^125m, тулий¹⁶⁵, тулий¹⁶⁷, тулий¹⁶⁸, фтор¹⁸, иттрий¹⁹⁹ и йод¹³¹. Способы, известные специалисту в данной области, существующие для связывания радиоизотопов с антителами либо непосредственно, либо через хелатирующий агент, такой как упомянутые выше EDTA или DTPA, могут быть использованы для диагностических радиоизотопов. Также можно упомянуть метку с [I¹²⁵]Na с помощью хлорамина Т [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495], либо также с технецием^99m по описанию Crockford et at. (патент США 4424200), либо через DTPA, как описано у Hnatowich (патент США 4479930).

Также раскрыто применение антитела изобретения в качестве биомаркера поэтому разглашаются, способы могут быть использованы для обнаружения и диагностики различных гиперпролиферативных онкогенных нарушений, связанных с экспрессией CXCR4, примерами которых, без ограничения, являются рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак пищевода, рак легкого, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, колоректальный рак, остеосаркомы, нейробластома, острый лимфобластный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, хронический лимфолейкоз, множественная миелома, лимфомы, рак почки, глиобластома, рак щитовидной железы, рабдомиосаркома или любой другой рак, связанный с экспрессией CXCR4. Как должно быть известно специалисту в данной области, уровень экспрессии антитела, связанный с определенным расстройством, будет варьировать в зависимости от характера и/или тяжести уже существующего состояния.

Введение антител данного изобретение относится любым из обычных путей, известных специалистам в данной области (например, местно, парентерально, внутримышечно и т.д.) будет чрезвычайно полезным способом выявления диспластических клеток в образце, а также позволит врачу контролировать терапевтический режим пациента, проходящего лечение от гиперпролиферативного расстройства, связанного с или опосредованного экспрессией CXCR4.

В другом воплощении изобретение относится к фармацевтической композиции для визуализации in vivo онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4, содержащей указанное выше моноклональное антитело или его фрагмент, который помечен и который связывает CXCR4 in vivo, и фармацевтически приемлемый носитель.

Антитело изобретения или его функциональный фрагмент или производное найдут применение в различных медицинских или научных целях, включая выявление, диагностику и определение стадии различных патологий, связанных с экспрессией CXCR4.

Определение стадии имеет потенциальное прогностическое значение и обеспечивает критерии для разработки оптимальной терапии [Simpson et al. J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)]. Как правило, определение патологической стадии, например, рака молочной железы, является более предпочтительным, чем определение клинической стадии, потому что дает более точный прогноз. Тем не менее, определение клинической стадии было бы предпочтительнее, если бы оно было таким же точным, как определение патологической стадии, поскольку оно не зависит от инвазивной процедуры получения тканей для патологических оценки.

При использовании подходящих меток или других соответствующих обнаруживаемых биомолекул или химических веществ, антитело изобретения особенно полезно для диагностических и прогностических применений in vitro и in vivo.

Метки для применения в иммунологических анализах, известные специалистам данной области, включают ферменты, радиоизотопы, а также флуоресцентные, люминесцентные и хромогенные вещества, в том числе окрашенные частицы, такие как коллоидное золото, или латексные шарики. Подходящие иммунологические анализы включают иммуноферментный анализ (ELISA). Специалистам в данной области хорошо известны различные типы меток и способы конъюгации меток с антителами изобретения, такие как изложенные ниже.

Используемый в данном документе термин «онкогенное расстройство, связанное с экспрессией CXCR4» включает заболевания и другие расстройства, при которых было показано присутствие высоких уровней и аномально низких уровней CXCR4 (отклонения) у субъекта, страдающего от расстройства, которое, как было показано или по-видимому, ответственно за патофизиологию расстройства или является фактором, который способствует ухудшению заболевания. Альтернативно, такие расстройства могут быть подтверждены, например, повышением уровней CXCR4 на поверхности клеток в пораженных клетках или тканях пациента, страдающего от расстройства. Повышение уровней CXCR4 может быть обнаружено, например, с помощью антитела 515Н7 или hz515H7 изобретения. Более того, оно относится к клеткам, которые демонстрируют относительно автономный рост, так что они проявляют фенотип аберрантного роста, который характеризуется значительной потерей контроля клеточной пролиферации. Альтернативно, клетки могут экспрессировать нормальные уровни CXCR4, но отмечены аномальной пролиферацией.

В некоторых воплощениях термин «повышенная экспрессия», который употребляется по отношению к CXCR4, относится к уровням белка или экспрессии гена, которые демонстрируют статистически значимое увеличение экспрессии (по данным экспрессии РНК или экспрессии белка) по сравнению с контролем.

В частности, подразумевается применение антитела или его функционального фрагмента или производного в соответствии с изобретением, как описано, для диагностики in vitro онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4, или для определения in vitro прогноза развития онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4, например, рака, связанного с экспрессией CXCR4.

Другой широкий аспект в соответствии с изобретением касается способа диагностики патологического гиперпролиферативного онкогенного заболевания или предрасположенности субъекта к патологическому состоянию, связанному с экспрессией CXCR4, который включает определение наличия или отсутствия CXCR4-несущих клеток в образце и диагностику патологического состояния или предрасположенности к патологическому состоянию на основе наличия или отсутствия указанных CXCR4-несущих клеток. Диагностические применения антитела изобретения включают первичные опухоли, раковые метастазы, раковые стволовые клетки. Антитело может присутствовать в виде иммуноконъюгата или меченого антитела, чтобы получить сигнал, который можно обнаружить и/или количественно оценить.

В частности, предпочтительным объектом в соответствии с изобретением является процесс обнаружения in vitro присутствия и/или расположения CXCR4-экспрессирующей опухоли у субъекта, где указанный способ включает этапы: (а) контактирования образца от субъекта с антителом или его функциональным фрагментом или производным в соответствии с изобретением, и (б) обнаружения связывания указанного антитела с образцом. Другим аспектом объекта является контроль экспрессии CXCR4 как на CXCR4-направленную терапии во время клинических испытаний, и, в частности, когда подавление и/или деградация CXCR4-рецептора является одним из компонентов механизма действия анализируемого соединения.

Специалисту в данной области будет очевидно, что выявление связывания антитела изобретения можно провести путем различных анализов. Хотя любые средства для проведения анализа являются совместимыми с изобретением, в качестве примеров могут быть упомянуты FACS, ELISA или IHC.

Используемый в данном документе термин «образец» обозначает любую биологическую жидкость, клетку, ткань, орган или его часть, которая содержит или потенциально содержит опухолевые клетки, такие как клетки толстой кишки, прямой кишки, желудка, молочной железы, яичников, предстательной железы, почек, легкого, крови, мозга, кожи, щитовидной железы, лимфатического узла, костного мозга или других органов или тканей, которые содержат или предположительно содержат опухолевые клетки. Этот термин включает образцы, присутствующие у индивидуума, а также образцы, полученные или произведенные человеком. Например, образец может быть гистологическим срезом материала, полученного при биопсии, или клетками, помещенными или адаптированными к культуре ткани. Также образец может быть субклеточной фракцией или экстрактом, либо необработанной или по существу чистой нуклеиновокислотной молекулой или белковым препаратом.

Понятие «клинический образец» охватывает различные типы образцов, полученные от субъекта и используемые в процедуре изобретение, такие как, например, диагностический или мониторинговый анализ определенных или обнаруженных уровней экспрессии CXCR4. Определение охватывает твердые образцы тканей, полученные при хирургическом удалении, патологические образцы, сохраненные образцы или образцы биопсии, культуры тканей или клеток, полученных из них и их потомство, а также срезы или мазки, изготовленные из любого из этих источников Неограничивающими примерами являются образцы, полученные из желудка, толстой кишки, прямой кишки, молочной железы, яичников, предстательной железы, почки, легкого, крови, мозга, кожи, щитовидной железы, лимфатического узла, костного мозга и т.д. Также определение охватывает жидкие образцы биологического происхождения и может относиться как к суспендированным клеткам или клеточным фрагментам, так и к жидкой среде и растворенным в ней веществам.

Другой аспект, в соответствии с изобретением относится к процессу определения in vitro уровня экспрессии CXCR4 в CXCR4-экспрессирующей опухоли от субъекта, где указанный процесс включает этапы: (а') контактирования образца от субъекта с антителом, или его функциональным фрагментом или его производным в соответствии с изобретением, и (б') количественной оценки уровня связывания антитела с CXCR4 в указанном образце.

Специалисту в данной области будет очевидно, что уровень связывания антитела с CXCR4 можно количественно оценить несколькими способами, такими как различные анализы. Хотя любые средства для проведения анализов совместимы с изобретением, предпочтительный способ включает иммуноферментные процессы в соответствии с методикой ELISA, с применением методик иммунофлуоресценции, иммуногистохимии или радиоиммуноферментного анализа (RIA) или эквивалентных им.

Предпочтительно, биологический образец сформирован биологической жидкостью, такой как сыворотка, цельной кровью, клетками, образцом ткани или биопсии человеческого происхождения. Образец, например, может включать биоптат ткани, которая может быть легко анализирована на наличие патологического гиперпролиферативного онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4.

После определения количества CXCR4, присутствующего в образце, результаты могут быть сопоставлены с результатами от контрольных образцов, которые получают сходным с анализируемыми образцами образом, но от людей, у которых нет гиперпролиферативных онкогенных расстройств, связанных с экспрессией CXCR4. Если в анализируемом образце уровень CXCR4 значительно повышен, можно сделать вывод, что существует повышенная вероятность, что у субъекта, от которого он был получен, есть или будет развиваться указанное расстройство.

Данное изобретение относится, в частности, к процессу диагностики in vitro CXCR4-экспрессирующей опухоли или определению in vitro прогноза развития CXCR4-экспрессирующей опухоли у субъекта, где указанный процесс включает этапы: (i) определения уровня экспрессии CXCR4, как описано выше, и (ii) сравнения уровня экспрессии из этапа (i) с контрольным уровнем экспрессии CXCR4 в нормальной ткани или ткани, не экспрессирующей CXCR4.

Понятие «диагностики» заболевания, используемое в данной заявке, включает, например, диагностику или обнаружение наличия патологического гиперпролиферативного онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4 или опосредованного ею, мониторинг прогрессирования заболевания, а также выявление или обнаружение клеток или образцов, которые указывают на расстройство, связанное с экспрессией CXCR4.

Понятие «прогноз», используемое в данной заявке, означает вероятность выздоровления от заболевания или предсказание вероятного развития или исхода заболевания. Например, если образец от субъекта является положительным на окрашивание с антителом изобретения, то «прогноз» для этого субъекта будет лучше, чем если образец был бы отрицательным на CXCR4-окрашивание. Образцы могут быть оценены по уровню экспрессии CXCR4 в соответствующем масштабе, как это будет более подробно описано далее.

Тем не менее, другой аспект изобретения также касается мониторинга экспрессии CXCR4 при применении терапевтических соединений, которые вызывают деградацию CXCR4 в качестве одного из механизмов действия. В этом случае последующая экспрессия CXCR4 на клеточной мембране может быть важным инструментом для оценки эффективности лечения во время клинических испытаний и «персонализированной» терапии.

Уровень экспрессии CXCR4 предпочтительно сравнивают или измеряют по отношению к уровням в контрольной клетке или образце, которые также обозначают как «референсный уровень» или «референсный уровень экспрессии». Понятия «референсный уровень», «референсный уровень экспрессии», «контрольный уровень» и «контроль» используются как синонимы в данном описании. Говоря в целом, «контрольный уровень» означает отдельный базальный уровень, измеренный в сравниваемой контрольной клетке, которая свободна от заболевания или рака. Она может быть от того же лица или от другого лица, который является нормальным или у которого нет такого же заболевания, как у больного или в испытуемом образце. В контексте данного изобретения термин «референсный уровень» относится к «контрольному уровню» экспрессии CXCR4, используемому для оценки анализируемого уровня экспрессии CXCR4 в образце от пациента, содержащем раковую клетку. Например, когда уровень CXCR4 в биологическом образце от пациента выше, чем референсный уровень CXCR4, будет считаться, что клетки имеют высокий уровень экспрессии, или сверхэкспрессию, CXCR4. Референсный уровень может быть определен множеством способов. Таким образом, уровни экспрессии могут определить CXCR4-несущие клетки или альтернативно уровень экспрессии CXCR4 независимо от числа клеток, экспрессирующих CXCR4. Таким образом, референсный уровень для каждого пациента может быть описан референсным соотношением CXCR4, где референсное соотношение может быть определено с помощью любого из способов для определения референсных уровней, описанных в данном документе.

Например, контроль может быть заданным значением, которое может принимать различные формы. Это может быть одно пороговое значение, такое как медиана или среднее значение. «Референсный уровень» может быть одним числом, в равной степени применимым к каждому пациенту индивидуально, или референсный уровень может варьировать в зависимости от конкретной субпопуляции пациентов. Так, например, пожилые люди могут иметь референсный уровень, отличный от молодых людей с таким же раком, и женщины могут иметь референсный уровень, отличный от мужчин с таким же раком. Альтернативно, «референсный уровень» может быть определен путем измерения уровня экспрессии CXCR4 в неонкогенных раковых клетках из такой же ткани, что и ткань анализируемых опухолевых клеток. Кроме того, «референсный уровень» может быть определен как соотношение CXCR4 в опухолевых клетках пациента к уровню CXCR4 в неопухолевых клетках у того же пациента. «Референсный уровень» может также быть уровнем CXCR4 в культивируемых in vitro клетках, которыми можно манипулировать, чтобы имитировать опухолевые клетки, или можно манипулировать каким-либо другим образом, который дает уровни экспрессии, которые точно определяют референсный уровень. С другой стороны, «референсный уровень» может быть установлен на основании сравнительных групп, таких как группы без повышенных уровней CXCR4 и группы с повышенными уровнями CXCR4. Другим примером сравнительных групп могут быть группы с определенным заболеванием, состоянием или симптомами и группы без заболевания. Заданное значение может быть организовано, например, где анализируемая популяция делится поровну (или неравномерно) на группы, такие как группа низкого риска, группа среднего риска и группа высокого риска, или на квадранты или квинтили, нижний квадрант или квинтиль, в который входят люди с самым низким риском или с самым большим количеством CXCR4, и высший квадрант или квинтиль, в который входят люди с самым высоким риском или самым меньшим количеством CXCR4.

Также референсный уровень может быть определен путем сравнения уровня CXCR4 в популяциях пациентов, имеющих один и тот же рак. Этого можно достичь, например, путем анализа гистограммы, в которой вся когорта пациентов представлена в графическом виде, где первая ось представляет уровень CXCR4, а вторая ось представляет число пациентов в когорте, у которых опухолевые клетки экспрессируют CXCR4 на данном уровне. Две или более двух отдельных групп пациентов можно определить путем идентификации подмножеств когорты, которые имеют одинаковые или аналогичные уровни CXCR4. Определение референсного уровня можно осуществить на основании уровня, который наилучшим образом отличает эти отдельные группы. Референсный уровень также может представлять уровни двух или более чем двух маркеров, одним из которых является CXCR4. Два или более двух маркеров могут быть представлены, например, соотношением значений для уровней каждого маркера.

Аналогичным образом, практически здоровая популяция будет иметь другой «нормальный» диапазон, отличный от диапазона в популяции, которая, как известно, имеет состояние, связанное с экспрессией CXCR4. Соответственно, выбранное заданное значение может учитывать категорию, в которую попадает индивидуум. Соответствующие диапазоны и категории могут быть выбраны с помощью не более чем рутинных экспериментов, известных специалистам в данной области. Под «повышенным», «увеличенным» понимается высокий по сравнению с выбранным контролем. Как правило, контроль будет основываться на нормальных здоровых индивидуумах в соответствующей возрастной группе.

Также нужно понимать, что контроли в соответствии с изобретением могут быть, помимо выбранных значений, образцами материалов, тестируемых параллельно с экспериментальными материалами. Примеры включают ткани или клетки, полученные в одно и то же время от одного и того же субъекта, например, части одного биоптата или части одного образца клетки от субъекта.

В клинической диагностике или мониторинге пациентов с CXCR4-опосредованными заболеваниями обнаружение CXCR4-экспрессирующих клеток или повышение уровней CXCR4 по сравнению с уровнями в соответствующем биологическом образце от нормального субъекта или нераковой ткани обычно свидетельствует о пациенте с имеющимся или подозреваемым CXCR4-опосредованным расстройством.

В соответствии с вышеизложенным, изобретение предусматривает способ прогнозирования восприимчивости к раку, включающий определение уровня экспрессии CXCR4 в образце ткани, его присутствия, обозначающего восприимчивость к раку, где степень экспрессии CXCR4 коррелирует со степенью восприимчивости. Таким образом, в конкретных воплощениях экспрессия CXCR4, например, в ткани молочной железы, ткани яичника, ткани предстательной железы, ткани поджелудочной железы, ткани кожи, ткани пищевода, ткани легкого, ткани головы и шеи, ткани мочевого пузыря, ткани толстой кишки, ткани остеосаркомы, ткани нейробластомы, клетках острого лимфобластного лейкоза, клетках острого миелоидного лейкоза, клетках хронического миелоидного лейкоза, клетках хронического лимфоцитарного лейкоза, клетках множественной миеломы, клетках лимфомы, почечной ткани, ткани глиобластомы, ткани щитовидной железы, ткани рабдомиосаркомы или любой другой ткани, в которой подозревается наличие клеток, экспрессирующих CXCR4, с наличием CXCR4 в образце, обеспечивающем указание на восприимчивость к раку или возникновение или существование тканеспецифической опухоли.

Также предусматривается способ оценки агрессивности опухоли. В одном воплощении способ наблюдения за прогрессированием злокачественности у индивидуума в течение времени включает определение уровня CXCR4-экспрессирующих клеток в образце опухоли, сравнение уровня, определенного таким образом, с уровнем экспрессии CXCR4 в эквивалентном образце ткани, взятом у того же индивидуума в другое время, где степень экспрессии CXCR4 в образце опухоли с течением времени предоставляет информацию о прогрессировании рака.

В еще одном воплощении заявка предусматривает способы определения соответствующего терапевтического протокола для субъекта.

Наличие или отсутствие или изменение уровня CXCR4 в соответствии с изобретением может свидетельствовать о том, что субъект может иметь рецидив или прогрессию, либо персистирующий рак, связанный с CXCR4. Таким образом, измеряя увеличение числа клеток, экспрессирующих CXCR4, или изменение в концентрации CXCR4, присутствующего в различных тканях и клетках, можно определить, является ли эффективным конкретный терапевтический режим, направленный на ослабление злокачественности, связанной с CXCR4.

Другим объектом изобретения является способ визуализации in vivo онкогенного расстройства, связанного с экспрессией CXCR4. Например, такой способ может быть использован для пациента с симптомами онкогенного расстройства. Если пациент, например, имеет повышенный уровень экспрессии CXCR4, то он, скорее всего, страдает от ракового расстройства. Кроме того, способ может быть использован для мониторинга прогрессирования и/или ответа на лечение у пациентов, у которые ранее был диагностирован CXCR4-опосредованный рак. В соответствии с вышеуказанной целью, изобретение предоставляет реагент для визуализации in vivo, содержащий антитело в соответствии с изобретением или его функциональный фрагмент или его производное, предпочтительно меченое, особенно меченое радиоизотопной меткой, и его применение в медицинской визуализации. Таким образом, общий способ в соответствии с изобретением работает путем введения пациенту эффективного для визуализации количества реагента для визуализации, такого как описанное выше моноклональное антитело, которое является меченым, и фармацевтически эффективного носителя, а затем обнаружения агента после того, как он связывается с CXCR4, присутствующим в образце. В некоторых воплощениях способ работает путем введения пациенту эффективного для визуализации количества реагента для визуализации, содержащего целевую группировку и активную группировку. Визуализирующий агент вводят в количестве, эффективном для диагностики у млекопитающего, такого как человек, и затем определяют локализацию и накопление визуализирующего агента. Локализация и накопление визуализирующего агента могут быть обнаружены путем радионуклидной визуализации, радиосцинтиграфической визуализации, ядерной магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии, позитронно-эмиссионной томографии, компьютерной томографии, рентгена или способа магнитной резонансной томографии, флуоресцентной детекции и хемилюминесцентного обнаружения.

Что касается разработки целевой противоопухолевой терапии, диагностика с помощью иммуногистологических методик дает in situ информацию об уровне экспрессии рецептора и позволяет, таким образом, выбрать пациентов, чувствительных к лечению, в соответствии с уровнем экспрессии рецепторов, необходимых для такого лечения.

При иммунотерапии с использованием моноклональных антител, таких как трастузумаб, реакция на лечение зависит от уровня экспрессии целевого рецептора, поэтому в настоящее время, с появлением гуманизированного анти-Her2 моноклонального антитела трастузумаба, определение сверхэкспрессии Her2 в карциноме молочной железы имеет большую клиническую значимость. Демонстрация сверхэкспрессии Her2 является необходимым условием для лечения трастузумабом, так как он действует путем специфического влияния на клетки карциномы со сверхэкспрессией Her2. Точное тестирование на Her2 нужно для того, чтобы дорогостоящее и потенциально токсичное лечение трастузумабом не было назначено пациентам с опухолями без сверхэксперссиии, и чтобы каждый пациент, которому может быть полезно лечение трастузумабом, получил соответствующее лечение.

Работы с трастузумабом, касающиеся выбора пациентов со сверхэкспрессией Her2, показали пользу определения уровня экспрессии рецептора при применении терапии моноклональным антителом и, в то же время, разработки моноклонального антитела, которое может быть использовано для отбора пациентов.

Как следствие, это изобретение относится к процессу определения in vitro CXCR4-статуса опухоли субъекта, где указанный процесс включает этапы: (1) определения уровня экспрессии CXCR4, как описано выше, (2) подсчет уровня экспрессии CXCR4 в указанной опухоли, и (3) сравнение указанного уровня с уровнем, полученным для контрольного образца.

Термин «CXCR4-статус» в контексте данного изобретением относится к классификации опухолей на CXCR4-положительный [CXCR4 (+)] и CXCR4-отрицательный [CXCR4 (-)] классы на основании определения уровня экспрессии гена CXCR4, измеренного любыми способами, такими как иммуногистохимия (IHC), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), хромогенная гибридизация in situ (CISH), генный чип, или другими способами, известными специалистам в данной области.

В предпочтительном воплощении антитело для диагностики должно быть способно к связыванию с целевым рецептором, когда образцы ткани фиксированы формалином, фиксированы Glyco-Fixx, залиты в парафин и/или заморожены.

В частности, уровень экспрессии CXCR4 измеряется путем иммуногистохимии (IHC).

В качестве примера, в образцах можно оценить уровни экспрессии CXCR4 по шкале от 0 до 3⁺ для уровней окрашивания антитела, где 0 является отрицательным, а 1⁺-3⁺ представляют положительное окрашивание по четырем полуколичественным стадиям увеличивающейся интенсивности. Оценки 1⁺-3⁺ можно рассматривать как положительные, потому что каждая положительная оценка может быть связана со значительно сниженным риском развития рецидива и смертельного заболевания по сравнению с оценкой 0 (отрицательный), но увеличение интенсивности в положительных оценках может привести к дополнительному снижению риска. Для оценки прогностического значения CXCR4 может быть использован любой традиционный способ анализа риска. Репрезентативные способы анализа включают анализ регрессии Кокса, который является полупараметрическим способом моделирования выживания или времени до момента наступления определенного события в цензурированных случаях (Hosmer and Lemeshow, 1999; Сох, 1972). В отличие от других анализов выживания, например, Life Tables или Каплана-Мейера, анализ Кокса позволяет включать в модели независимые переменные (ковариаты). Используя способ анализа конвенции, например анализ Кокса, можно проверить гипотезы о корреляции статуса экспрессии CXCR4 в первичной опухоли с временем до начала рецидива заболевания (безрецидивная выживаемость, или время до метастазирования) или с временем до смерти по причине этого заболевания (общая выживаемость). Регрессионный анализ Кокса также известен как анализ пропорциональных рисков Кокса. Этот способ является стандартным для проверки прогностического значения опухолевого маркера в продолжительности жизни пациента. При использовании в многомерном режиме влияние нескольких ковариат оценивают в параллелях, так что можно идентифицировать отдельные ковариаты, которые имеют независимое прогностическое значение, т.е. самые полезные маркеры. Термин «положительный или отрицательный «CXCR4-статус» [также называемый CXCR4(+) или CXCR4(-)] опухолей относится к оценке 0 или оценке 1⁺-3⁺, соответственно.

Образец может быть «подсчитан» во время диагностики или мониторинга рака молочной железы. В своей простейшей форме подсчет может быть категорически отрицательным или положительным, если судить путем визуальной проверки образцов при иммуногистохимии. Более количественный подсчет подразумевает оценку по двум параметрам, интенсивности окрашивания и доле окрашенных («положительных») клеток в образце. На основании этих двух параметрах могут быть заданы значения, которые отражают повышенные уровни положительного окрашивания. Allred et al. (Allred, Harvey et al. 1998) описали один способ достижения этого, который включает подсчет обоих параметром по шкале от 0 (отрицательный) до 3⁺, и суммирование подсчета отдельных параметров в общий результат. Эти результаты находятся на шкале с возможными значениями 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. (Заметим, что значение 1 невозможно по шкале Оллреда). Несколько более простой способ подсчета объединяет интенсивность ядерного окрашивания и долю клеток, которые демонстрируют окрашенные ядра в комбинированной шкале от 0 до 3⁺. Любой способ подсчета может быть применен к подсчету интенсивности и доли окрашивания активированных Stat5 в клеточных ядрах. Термины «положительный или отрицательный «CXCR4-статус» опухолей, используемые в данном описании, относятся к уровням экспрессии CXCR4, которые соответствуют значениям 0 или 1⁺-3⁺ по упрощенной шкале, соответственно.

Как правило, результаты теста или анализа в соответствии с изобретением могут быть представлены в любом из множества форматов. Результаты могут быть представлены в качественном режиме. Например, протокол испытания может указывать только, был ли обнаружен конкретный полипептид, возможно, также с указанием пределов обнаружения. Результаты могут быть представлены в полуколичественном режиме. Например, могут быть определены различные диапазоны, и диапазоны могут быть обозначены значениями (например, от 1⁺ до 3⁺), что обеспечивает определенную степень количественной информации. Такое значение может отражать различные факторы, например, число клеток, в которых обнаружен CXCR4, интенсивность сигнала (которая может указывать на уровень экспрессии CXCR4 или CXCR4-несущих клеток) и т.д. Полученные результаты могут быть представлены в количественном виде, например, как процент клеток, в которых определяется полипептид (CXCR4), как концентрация белка и т.д. Специалист в данной области примет во внимание, что тип вывода, произведенного с помощью теста, будет меняться в зависимости от технических ограничений теста и биологического значения, связанного с обнаружением полипептида. Например, в случае некоторых полипептидов чисто качественный вывод (например, обнаружен ли полипептид на определенном уровне обнаружения) предоставляет важную информацию. В других случаях необходимым является более количественный вывод (например, соотношение уровня экспрессии полипептида в тестируемом образце и нормального уровня).

В более предпочтительном воплощении подсчет уровня экспрессии CXCR4 оценивается от 0 до 3+ на основании оценки интенсивности продукта реакции и процента положительных клеток. Для большей ясности, далее в таблице 5 приведены эти параметры. Следует рассматривать только полную тангенциальную мембранную реактивность инвазивной опухоли, которая часто напоминает вид «проволочной сетки». В соответствии с действующими руководящими принципами образцы, оцененные как пограничные (оценка 2⁺ и более) при CXCR4 IHC, должны рассматриваться как CXCR4 (+) и должны пройти дополнительную оценку. Анализ IHC следует отвергнуть и либо повторить, либо подтвердить с помощью FISH или любого другого способа, если, в качестве не ограничивающего примера, контроли не такие, как ожидалось, артефакты включены в большую часть образца, и образец имеет сильную мембранную положительность нормальных протоков молочной железы (внутренний контроль), предполагая чрезмерный поиска антигена.

Таблица 5 Статус CXCR4 Описание в IHC 0 Отсутствие реактивности или мембранная реактивность у менее 10% опухолевых клеток 1⁺ Слабая/едва заметная мембранная реактивность обнаружена в более чем 10% опухолевых клеток. Клетки иммунореактивные только в части мембраны. 2⁺ Полная мембранная реактивность от слабой до умеренной проявляется в более чем 10% опухолевых клеток. 3⁺ Сильная полная реактивность проявляется в более чем 10% опухолевых клеток.

В более предпочтительном воплощении процесса в соответствии с изобретением указанный подсчет включает применение соответствующей шкалы на основании двух параметров, которыми являются интенсивность окрашивания и процент положительных клеток.

В предпочтительном воплощении процесс в соответствии с изобретением относится к соответствующей шкале от 0 до 3⁺, где отсутствие мембранной реактивности опухолевых клеток оценивается как 0, а сильная полная реактивность в более чем 10% опухолевых клеток оценивается как 3⁺.

Более подробно, как описано выше, указанная соответствующая шкала представляет собой шкалу от 0 до 3, где отсутствие мембранной реактивности опухолевых клеток оценивается как 0; слабо заметная мембранная реактивность в более чем 10% опухолевых клеток оценивается как 1⁺; полная мембранная реактивность от слабой до умеренной в более чем 10% опухолевых клеток оценивается как 2⁺; и сильная полная реактивность в более чем 10% опухолевых клеток оценивается как 3⁺.

В конкретном аспекте изобретения опухоль является CXCR4(+) с оценкой 2⁺.

В конкретном аспекте изобретения опухоль является CXCR4(+) с оценкой 3⁺.

В другом конкретном аспекте изобретения опухоль является CXCR4(+) с оценкой 2⁺ или 3⁺.

В соответствии с изобретением также описан процесс определения того, поддается ли онкогенное расстройство лечению с помощью анти-CXCR4-антитела или его фрагмента или его производного, где указанный процесс включает следующие этапы: (а) определение in vitro СХСК4-статуса опухоли субъекта, как описано выше, и (б) если статус CXCR4(+), определение того, поддается ли онкогенное расстройство лечению с помощью анти-CXCR4-антитела или его фрагмента или его производного.

В другом аспекте изобретения предложен набор, используемый для такого процесса диагностики или прогнозирования, который включает антитело изобретения.

Для удобства в рамки данного изобретения также входит упакованная комбинация реагентов в заданных количествах с инструкциями для проведения диагностического анализа, т.е. набор (кит, комплект). Набор содержит антитела для обнаружения и количественной оценки CXCR4 in vitro, например, в ИФА или вестерн-блоттинге. Антитело данного изобретения может быть представлено в наборе для обнаружения и количественной оценки CXCR4 in vitro, например, в ИФА или вестерн-блоттинге. Если антитело мечено ферментом, в набор будут включены субстраты и кофакторы, необходимые ферменту (например, субстрат-предшественник, который обеспечивает обнаружение хромофора или флуорофора). Кроме того, могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизисный буфер) и т.п. Такой набор может включать коробку, которая разделена на отсеки и содержит один или более чем один контейнер, такой как флакон, пробирка и т.п., и в таких контейнерах содержатся отдельные элементы изобретения. Например, один контейнер может содержать первое антитело, связанное с нерастворимым или частично растворимым носителем. Второй контейнер может содержать растворимое, меченное для обнаружения второе антитело в лиофилизированной форме или в растворе. Коробка может включать третий контейнер, содержащий меченное для обнаружения третье антитело в лиофилизированной форме или в растворе. Набор такого рода может быть использован в сэндвич-анализе изобретения. Этикетка или вкладыш могут давать описание композиции, а также инструкции по применению in vitro или для диагностики.

Относительные количества различных реагентов могут широко меняться для создания в растворе концентраций реагентов, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В частности, реагенты могут быть предоставлены как сухие порошки, как правило, лиофилизированные, включая эксципиенты, которые при растворении дадут раствор реагента с соответствующей концентрацией.

Еще в одном аспекте изобретения моноклональные антитела или их связывающие фрагменты, подробно описанные в данном документе, помечены обнаруживаемой группировкой, так что они могут быть упакованы и использованы, например, в наборах для диагностики или выявления клеток, имеющих вышеупомянутый антиген. Неограничивающие примеры таких меток включают флуорофоры, такие как изотиоцианат флуоресцеина, хромофоры, радионуклиды или ферменты. Такие меченые антитела или связывающие фрагменты могут быть использованы для гистологической локализации антигена, ИФА, сортировки клеток, а также для других иммунологических методик обнаружения или количественной оценки CXCR4 и клеток, несущих этот антиген, например.

Также предложены наборы, которые используются в качестве положительного контроля для анализа апоптоза, для очистки или иммунопреципитации CXCR4 из клеток. Для выделения и очистки CXCR4 набор может содержать антитела, описанные в данном документе, или их антиген-связывающие фрагменты, связанные с бусинами (например, сефарозными бусинами). Могут быть предложены наборы, содержащие антитела для обнаружения и количественной оценки CXCR4 in vitro, например, в ИФА или вестерн-блоттинге. В соответствии с инструкциями изготовителя набор включает контейнер и этикетку или вкладыш, вложенный или связанный с контейнером. Контейнер содержит композицию, включающую по меньшей мере одно анти-CXCR4-антитело изобретения или его связывающий фрагмент. Могут быть включены дополнительные контейнеры, которые содержат, например, растворители и буферы, контрольные антитела. Этикетка или вкладыш могут давать описание композиции, а также инструкции по применению in vitro или для диагностики.

В частности, изобретение относится к набору для определения CXCR4-статуса опухоли любым способом, известным специалисту в данной области. В предпочтительном воплощении, как будет описано в примере, изобретение относится к набору для определения CXCR4-статуса опухоли способами IHC.

В конкретном воплощении изобретение состоит из набора, включающего по меньшей мере анти-CXCR4-антитело или его функциональный фрагмент или производное, как выше описано, при этом указанное антитело предпочтительно мечено.

Следует понимать, что специалист в данной области может использовать любой способ мечения, такой как, например, применение меток, описанных выше.

В предпочтительном воплощении набор в соответствии с изобретением, используемый для выявления in vitro наличия и/или локализации CXCR4-экспрессирующей опухоли у субъекта, также содержит реагент, используемый для определения степени связывания указанного анти-CXCR4 антитела и CXCR4.

В другом предпочтительном воплощении набор изобретения, используемый для выявления in vitro уровня экспрессии CXCR4 в CXCR4-экспрессирующей опухоли, также содержит реагент, используемый для количественной оценки степени связывания указанного меченого антитела и CXCR4.

В еще одном воплощении набор в соответствии с изобретением, используемый для определения in vitro CXCR4-статуса опухоли, также содержит:

i) реагент, используемый для определения степени связывания указанного меченого антитела и CXCR4; и

ii) положительные и отрицательные контрольные образцы, используемые для подсчета уровня экспрессии CXCR4.

Указанный набор для определения in vitro CXCR4-статуса опухоли может также содержать поликлональное антитело, специфичное для мышиных антител, при этом предпочтительно указанное поликлональное антитело, специфичное к мышиным антителам, является меченым.

Изобретение также относится к применению антитела в соответствии с изобретением для получения лекарственного препарата для специфического воздействия соединения, которое является биологически активным по отношению к клеткам с экспрессией или сверхэкспрессией CXCR4.

В контексте данного описания «биологически активным соединением» является любое соединение, способное модулировать, в частности, ингибировать, клеточную активность, в частности рост, пролиферацию, транскрипцию и трансляцию гена.

Изобретение также относится к реагентам для диагностики in vivo, состоящим из антитела в соответствии с изобретением или его функционального фрагмента, предпочтительно меченого, в частности меченного радиоактивной меткой, и к их применению в медицинской визуализации, в частности для обнаружения рака, связанного с клеточной экспрессией или сверхэкспрессией CXCR4.

Изобретение относится также к композиции в виде комбинированного продукта или к конъюгату анти-CXCR4/токсин или радиоизотопу в соответствии с изобретением, используемым в качестве лекарственного препарата.

Предпочтительно указанная композиция в качестве комбинированного продукта или указанный конъюгат в соответствии с изобретением будут смешаны с эксципиентом и/или фармацевтическим носителем.

В данном описании под «фармацевтическим носителем» понимается соединение или комбинация соединений, входящих в фармацевтическую композицию, не провоцирующих вторичные реакции и позволяющих, например, облегчить введение активных соединений, увеличить время его жизни и/или его эффективность в организме, повысить его растворимость в растворе или улучшить его сохранность. Такие фармацевтические носители хорошо известны и будут адаптированы специалистом в данной области в зависимости от природы и способа введения выбранных активных соединений.

Предпочтительно такие соединения будут вводиться системным путем, в частности внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно, подкожно, или пероральным путем. Более предпочтительно композиция, содержащая антитело в соответствии с изобретением, будет вводиться в нескольких дозах через равные промежутки времени.

Способы введения, графики дозировок и оптимальные галеновые формы можно определить в соответствии с критериями, обычно принимаемыми при установлении лечения, адаптированного для пациента, такими как, например, возраст или вес тела пациента, тяжесть его общего состояния, его толерантность к лечению и отмеченные побочные эффекты.

Таким образом, изобретение относится к применению антитела или одного из его функциональных фрагментов для изготовления лекарственного препарата для специфического воздействия соединения, которое является биологически активным по отношению к клеткам с экспрессией или сверхэкспрессией CXCR4.

Таким образом, изобретение относится к применению антитела или одного из его функциональных фрагментов для изготовления лекарственного препарата для специфического нацеливания соединения, которое является биологически активным по отношению к клеткам, экспрессирующим или сверхэкспрессирующим CXCR4.

Как уже говорилось выше, MKA CXCR4 в соответствии с изобретением обладают сильной активностью в области лечения рака, так что такие антитела могут быть использованы в скрининговых анализах для идентификации CXCR4-антагонистических противоопухолевых агентов для лечения рака. На первом этапе этих анализов клетки, экспрессирующие CXCR4, инкубируют с антителами данного изобретения, а затем молекулы можно оценить на предмет их способности ингибировать связывание антител. Клетки, используемые в этом типе анализов, могут быть трансфицированными клеточными линиями, такими как CHO-CXCR4, NIH3T3-CXCR4, или CXCR4-трансфицированными человеческими клеточными линиями, такими как U373-MAGI-CXCR4, человеческими клеточными линиями, экспрессирующими CXCR4, такими как NALM6, или первичными клетками, такими как РВМС. Способами, используемыми для скрининга антагонистов CXCR4-ингибирующих антител, связывающихся на CXCR4-экспрессирующих клетках, могут быть иммуноферментный анализ на основе клеток (ELISA), описанный Zhao Q. et al. (AIDS Research And Human Retroviruses, 2003, 19, pp947-955) или протокол с использованием флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS), такие как описаны Juarez J. et al. (Leukemia 2003, 17, pp 1294-1300).

Таким образом, в частном аспекте изобретения предполагается процесс отбора и/или идентификации молекул, таких как CXCR4-антагонистические противоопухолевые агенты, включающий этапы:

а) отбора клеток, экспрессирующих CXCR4,

б) инкубации указанных клеток с антителом или одним из его функциональных фрагментов или производных изобретения,

в) оценки анализируемых молекул на предмет потенциального ингибирования ими связывания антитела или одного из его функциональных фрагментов или производных с CXCR4, и

г) отбора молекул, способных к указанному ингибированию.

Другие характеристики и преимущества изобретения появятся в последующем описании с примерами и фигурами, легенда к которым представлена ниже.

Легенда к графическим материалам

Фиг.1А и 1В показывают экспрессию соответственно CXCR4 и CXCR2 в раковых клетках с помощью анализа количественной ПЦР.

Фиг.2 показывает белковую экспрессию CXCR4 и CXCR2 в раковых клетках с помощью анализа FACS.

Фиг.3А и 3В показывают конкуренцию специфического [¹²⁵I]SDF1-связывания немеченым SDF-1 (фиг.3А) и моноклональным антителом 515Н7 (фиг.3В) на клеточных мембранах клеток СНО-K1, стабильно экспрессирующих человеческий CXCR4 дикого типа (Т: общее связывание; NS: неспецифическое связывание).

Фиг.4 показывает модуляцию активации белка G моноклональным антителом 515Н7 путем мониторинга реакций [³⁵S]СТРγ3-связывания рецептора CXCR4 дикого типа, стабильно экспрессирующегося в клетках NIH-3T3.

Фиг.5 показывает модуляцию активации белка G моноклональным антителом 515Н7 путем мониторинга реакций [³⁵S]GTPγS-связывания на человеческих опухолевых клетках HeLa, стимулированных SDF-1 (10 и 100 нМ).

Фиг.6А-6С показывают модуляцию ассоциации рецептора CXCR4 с различными взаимодействующими участниками моноклональным антителом 515Н7 и SDF-1 с помощью подхода резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) в клетках HEK293. (Фиг.6А: CXCR4:CXCR4-гомодимеризация; фиг.6В: CXCR2:CXCR4-гетеродимеризация; и фиг.6С: CXCR4-опосредованное привлечение β-аррестина).

Фиг.7А и 7 В показывают ингибирование форсколин-стимулированной продукции цАМФ моноклональным антителом 515Н7 и SDF-1 в клетках NIH3T3, стабильно экспрессирующих рецептор CXCR4.

Фиг.8 показывает модуляцию активации белка G анти-CXCR4-моноклональным антителом 515Н7 путем мониторинга реакций [³⁵S]GTPγS-связывания конститутивно активного мутантного рецептора Asn¹¹⁹Ser CXCR4, стабильно экспрессирующегося в клетках СНО-K1.

Фиг.9 показывает ингибирование SDF-1-индуцированной миграции клеток U937 CXCR4-моноклональным антителом 515Н7 in vitro.

Фиг.10 показывает ингибирование роста ксенотрансплантатной опухоли MDA-MB-231 анти-CXCR4-моноклональным антителом 515Н7 у мышей Nod/SCID.

Фиг.11А-11С показывают ингибирование SDF-1-индуцированного высвобождения кальция анти-CXCR4-моноклональным антителом 515Н7 в клетках CHO-CXCR4 (фиг.11А), MDA-MB-231 (фиг.11В), раковых клетках U937 (фиг.11С).

Фиг.12 показывает активность мышиного анти-CXCR4-MKA m515H7 на мышиных моделях выживания U937 Nod/Scid.

Фиг.13 показывает ингибирование роста Т-клеточной ксенотрансплантатной опухоли KARPAS 299 у мышей Nod/ Scid моноклональным мышиным анти-CXCR4-MKA m515H7.

Фиг.14 показывает конкуренцию специфического [¹²⁵I]SDF1-связывания мышиным MKA m515H7 и химерным MKA с515Н7 на клеточных мембранах клеток СНО-K1, стабильно экспрессирующих человеческий CXCR4 дикого типа (Т: общее связывание; NS: неспецифическое связывание).

Фиг.15 показывает модуляцию активации белка G мышиным MKA m515H7 и химерным MKA с515Н7 путем мониторинга реакций [³⁵S]GTPγS-связывания рецептора CXCR4 дикого типа, стабильно экспрессирующегося в клетках NIH-3T3, стимулированных SDF-1 (10 нМ).

Фиг.16 показывает модуляцию активации белка G мышиным анти-CXCR4-MKA m515H7 и химерным MKA с515Н7 путем мониторинга реакций [³⁵S]GTPγS-связывания на человеческих опухолевых клетках HeLa, стимулированных SDF-1 (10 нМ).

Фиг.17А-17С показывают модуляцию ассоциации рецептора CXCR4 с различными взаимодействующими участниками моноклональными антителами m515H7 и с515Н7 и SDF-1 с помощью подхода резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) в клетках HEK293. (Фиг.17А: CXCR4:CXCR4-гомодимеризация; фиг.17В: CXCR2:CXCR4-гетеродимеризация; и фиг.17С: CXCR4-опосредованное привлечение β-аррестина).

Фиг.18А и 18В показывают ингибирование SDF-1-индуцированного высвобождения кальция в клетках CHO-CXCR4 (фиг.18А) и клетках U937 (фиг.18В).

Фиг.19 показывает ингибирование SDF-1-индуцированной миграции клеток U937 CXCR4-моноклональными антителами m515H7 и с515Н7 in vitro.

Фиг.20 показывает активность химерного анти-CXCR4-MKA с515Н7 на мышиных моделях выживания U937Nod/Scid.

На фиг.21 показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельного домена тяжелой цепи 515Н7 и человеческой зародышевой линии IGHV3-49*04 и IGHJ4*01. Аминокислотная последовательность 515Н7 VH выровнена с выбранными человеческими акцепторными каркасными последовательностями. Последовательности VH1 и VH2 (VH3 не представлена) соответствуют осуществленным гуманизированным вариантам домена 515Н7 VH с обратно мутированными остатками, выделенными жирным шрифтом. Вариант 1 VH1 не несет никаких обратно мутированных остатков и представляет собой полностью человеческий вариант.Вариант VH2 имеет 8 обратных мутаций и является наиболее мышиным вариантом. Вариант VH3 несет 5 обратных мутаций (не представлен).

На фиг.22 показано выравнивание аминокислотных последовательностей легкой цепи 515Н7 и человеческой зародышевой линии IGKV4-1*01 и IGKJ1*01. Аминокислотная последовательность 515Н7 VL выровнена с выбранными человеческими акцепторными каркасными последовательностями. Последовательности с VL1 по VL3 соответствуют осуществленным гуманизированным вариантам домена 515Н7 VL с обратно мутированными остатками, выделенными жирным шрифтом. Вариант 1 VL1 не несет никаких обратно мутированных остатков и представляет собой полностью человеческий вариант. Вариант VL2 имеет 13 обратных мутаций и является наиболее мышиным вариантом. Вариант VL3 несет 5 обратных мутаций.

На фиг.23A-23F показано перекрестное блокирование биотинилированного мышиного антитела 515Н7 химерным 515Н7 и различными вариантами гуманизированного 515Н7. Активность гуманизированных вариантов 515Н7 (hz515H7) в перекрестной блокировке родительского мышиного антитела 515Н7 оценивали путем проточной цитометрии с использованием CXCR4-трансфицированных клеток NIH3T3. Активность гуманизированных вариантов сравнивали с химерным 515Н7. Активность в перекрестной блокировке трех различных вариантов VH (VH1-VH3) в сочетании с химерным VL (cVL) была очень близка (фиг.23А-фиг.23С). Отсутствие уменьшения активности варианта VH 1 (VH1, вариант без обратных мутаций) было обнаружено при сочетании с вариантом VL1 и 2. Значительное снижение активности было обнаружено для конструкции hz515H7 VH1 VL3.

На фиг.24 показан BRET-анализ для оценки активности гуманизированного антитела 515Н7 варианта VH1 VL1. Активность гуманизированного варианта 515Н7 VH вариант 1 VL вариант 1 (hz515H7 VH1 VL1) оценивали по его способности ингибировать SDF-1-опосредованную передачу сигнала. Этот вариант показал лишь незначительное ингибирование SDF-1-опосредованной передачи сигнала, определенной с помощью BRET. SDF-1 использовали в концентрации 100 нМ.

На фиг.25A-25D показано сравнение различных мутантов VH1 с одиночной или двойной обратной мутацией и комбинациями различных вариантов VL с hz515H7 VH1 D76N. Одиночную или двойную обратные мутации производили в VH1 и комбинировали с VL1. Эти конструкции оценивали в BRET-анализе (фиг.25А-25С). Из этих одиночных мутантов только конструкция с обратной мутацией D76N показала повышение ингибирования SDF-1-опосредованной передачи сигнала. Ни один из мутантов с двойной обратной мутацией в VH не проявлял сильную ингибирующую активность (фиг.25С). Отдельный мутант с обратной мутацией D76N в VH1 сочетали с различными вариантами VL. Концентрация SDF-1 составляла 100 нМ.

На фиг.26 показано ранжирование различных мутантов VH1 и VL1 с одиночной или двойной обратной мутацией по сравнению с конструкцией VH1 D76N VL2. Одиночную или двойную обратные мутации производили в VH1 и комбинировали с VL1. Все конструкции оценивали в BRET-анализе и рассчитывали их процент ингибирования. Концентрация SDF-1 составляла 100 нМ.

Цифры 27А-27В показывают ингибирование SDF-1-связывания различными конструкциями гуманизированного 515Н7 и корреляцию между результатами, полученным в FACS и BRET. Различные варианты гуманизированного антитела 515Н7 с сильной активностью в отношении блокирования привлечения β-аррестина анализировали по их способности ингибировать связывание биотинилированного SDF-1 при проточной цитометрии (FACS) (А). Их сравнивали с VH1 и VL1. Результаты анализа на основе FACS коррелировали с результатами, полученными в BRET (В).

На фиг.28 показано выравнивание аминокислотных последовательностей hz515H7 VL2 и далее гуманизированных версий 515Н7 VL2.1, 515Н7 VL2.2 и 515Н7 VL2.3. Аминокислотная последовательность 515Н7 VL выровнена с выбранными человеческими акцепторными каркасными последовательностями. Последовательности VL2.1, VL2.2 VL2.3 соответствуют осуществленным гуманизированным вариантам гуманизированного 515Н7 VL2 с обратно мутированными остатками, выделенными жирным шрифтом. VL2.1 и VL2.2 несут еще 4 гуманизированных остатка, в то время как VL2.3 содержит еще 5 человеческих остатков.

На фиг.29А-29С показано специфическое связывание гуманизированных моноклональных антител 515Н7 (hz515H7 VH1 D76N VL2, hz515H7 VH1 D76N VL2.1, hz515H7 VH1 D76N VL2.2 и hz515H7 VH1 D76N VL2.3) с CXCR4 на клетках NIH3T3-CXCR4 (фиг.29А), U937 (фиг.29 В) и клетках Ramos (фиг.29С).

На фиг.30A-30D и 31 показана модуляция активации G-белка гуманизированными MKA 515Н7 (hz515H7 VH1 D76N VL2 [фиг.30А], hz515H7 VH1 D76N VL2.1 [фиг.30В], hz515H7 VH1 D76N VL2.2 [фиг.30С] и hz515H7 VH1 D76N VL2.3 [фиг.30D]) путем мониторинга реакций [³⁵S]GTPγS-связывания с рецептором CXCR4 дикого типа, стабильно экспрессированным в клетках NIH-3T3, стимулированных SDF-1 (10 нМ или 100 нМ).

На фиг.32А-32С показана модуляция ассоциации рецептора CXCR4 с различными партнерами по взаимодействию посредством SDF-1 и гуманизированного моноклонального антитела 515Н7 (hz515H7 VH1 D76N VL2, hz515H7 VH1 D76N VL2.1, hz515H7 VH1 D76N VL2.2 и hz515H7 VH1 D76N VL2.3) с помощью подхода резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) в клетках НЕК293 (фиг.32А: СХСР4:CXCR4-гомодимеризация, фиг.32В: CXCR2:CXCR4-гетеродимеризация, и фиг.32С: CXCR4-опосредованное привлечение β-аррестина).

На фиг.33A-33D показаны ксенотрансплантатные опухоли Ramos и KARPAS299, фиксированные Glyofixx, с а) и в) IHC-окрашиванием с использованием 515Н7/б) и г) IHC-окрашиванием с использованием mIgG1.

На фиг.34A-34D показаны ксенотрансплантатные опухоли Ramos и KARPAS299, фиксированные формалином, с а) и в) IHC-окрашиванием с использованием 515Н7/б) и г) IHC-окрашиванием с использованием mIgG1.

На фиг.35A-35D показана конкуренция специфического [¹²⁵I]SDF1-связывания гуманизированными MKA hz515H7 (hz515H7 VH1 D76N VL2 [фиг.35А & В], hz515H7 VH1 D76N VL2.1 [фиг.35А & 35С], hz515H7 VH1 D76N VL2.2 [фиг.35А & 35D], hz 515Н7 VH1 D76N VL2.3 [фиг.35А]) на клеточных мембранах клеток CHO-K1, стабильно экспрессирующих человеческий CXCR4 дикого типа (Т: общее связывание, NS: неспецифическое связывание).

На фиг.36 показано ингибирование SDF-1-индуцированного высвобождения кальция в клетках U937 моноклональным антителом hz515H7 VH1 D76N VL2.

На фиг.37А-37В показано ингибирование SDF-1-индуцированной миграции клеток U937 моноклональным антителом hz515H7 VH1 D76N VL2 in vitro.

На фиг.38 показаны ксенотрансплантатные опухоли Ramos и KARPAS299, фиксированные Glyofixx, с а) и в) IHC-окрашиванием с использованием биотинилированного hz515H7 VH1 D76N VL2 и б) и г) IHC-окрашиванием с использованием биотинилированного hIgG1.

На фиг.39 показаны ксенотрансплантатные опухоли Ramos и KARPAS299, фиксированные формалином, с а) и в) IHC-окрашиванием с использованием биотинилированного hz515H7 VH1 D76N VL2 и б) и г) IHC-окрашиванием с использованием биотинилированного hIgG1.

На фиг.40 показано влияние химерного MKA 515Н7 (с515Н7) на рост ксенотрансплантатной опухоли В-клеток Ramos у мышей Scid.

На фиг.41 показано влияние версии MKA hz515H7 VH1 D76N VL2 на рост ксенотрансплантатной опухоли В-клеток Ramos у мышей Scid.

На фиг.42 показано влияние версии MKA hz515H7 VH1 D76N VL2.1 на рост ксенотрансплантатной опухоли В-клеток Ramos у мышей Scid.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Экспрессия CXCR4 и CXCR2 в раковых клетках

- количественный ПЦР-анализ (qPCR):

Для того, чтобы количественно оценить относительную экспрессию CXCR4 и CXCR2 в различных раковых клеточных линиях, используется ОТ-ПЦР в режиме реального времени (real time RT-PCR).

Образцы РНК выделяли из различных клеточных линий с помощью протоколов RNeasy Mini или Midi (Qiagen Corporation, Франция). Затем РНК-образцы проверяли с помощью автоматизированной системы электрофореза Experion (BIO-RAD Corporation, Франция), было показано хорошее качество/целостность. Один мкг каждого образца РНК переводили в кДНК-матрицу с помощью набора для синтеза кДНК iScript cDNA Syntesis (BIO-RAD Corporation, Франция). Уровни кДНК количественно оценивали с помощью количественной ПЦР либо с зондом TaqMan для CXCR2, либо с SYBERGreen для CXCR4. Сравниваемые образцы требовали нормализации, поэтому был введен внутренний референс RPLO. Зонды TaqMan (используемые для CXCR2) несли 5'-FAM-репортерную метку и 3'-ТАМРА-группу-гаситель. Фермент ПЦР активировали нагреванием в течение 2 мин при 50°С и 10 мин при 95°С. Использовали двухэтапную процедуру, 15 сек при 95°С и 1 мин при 62°С в течение 40 или 45 циклов с ПЦР-смесью, содержащей 5 мкл кДНК-матрицы (разведение 1/20), 1×qPCR Mastermix (TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems corporation, Бранчбург, Нью-Джерси, США), 50-900 нМ каждого праймера и 50-100 нМ зонда в общем объеме 50 мкл. Все реакции проводили с помощью инструмента iCycler (BIO-RAD Corporation). Количественная ПЦР позволяла определить пороговый цикл (Ct, cycle threshold). Чем более низким является значение Ct, тем более экспрессирован тестируемый ген. Праймеры и зонды для большого человеческого рибосомального белка, РО, были следующими:

прямой праймер, 5'-GAAACTCTGCATTCTCGCTTCCTG-3' (SEQ ID №63);

обратный праймер, 5'-AGGACTCGTTTGTACCCGTTGA-3' (SEQ ID №64);

зонд, 5'-(FAM)-TGCAGATTGGCTACCCAACTGTTGCA-(TAMRA)-3' (SEQ ID №65).

Праймеры для человеческого CXCR4 (хемокинового рецептора-4) были следующими:

прямой праймер, 5'-CTCCTTCATCCTCCTGGAAATC-3' (SEQ ID №66);

обратный праймер, 5'-CCAAGGAAAGCATAGAGGATGG-3' (SEQ ID №67).

Праймеры и зонд для человеческого CXCR2 (хемокинового рецептора-2) были следующими:

прямой праймер, 5'-GTGGTCATTATCTATGCCCTGG-3' (SEQ ID №68);

обратный праймер, 5'-CGACCCTGCTGTATAAGATGAC-3' (SEQ ID №69);

зонд, 5'-(FAM)-TATTCCTGCTGAGCCTGCTGGGAAA-(TAMRA)-3' (SEQ ID №70).

В нашем сравнительном исследовании экспрессию двух генов [анализируемого гена (CXCR4 или CXCR2) и RPLO] количественно оценивали в двух различных образцах: тестируемой клеточной линии и референсной клеточной линии. Референсная клеточная линия соответствовала клеточной линии, содержащей самую низкую экспрессию оцениваемого гена. Сравнительный расчет экспрессии генов был сделан с использованием следующей формулы:

Относительная экспрессия гена = (1+Е_гена)^-Δct(1)/(1+E_RPL0)^-ΔCt(2)

Е_гена = эффективность ПЦР при использовании праймеров/зонда для оцениваемого гена

E_RPL0=эффективность ПЦР при использовании праймеров/зонда для RPLO

Ct = пороговый цикл

ΔCt(1) = Ct_генa (тестируемая клеточная линия) - Ct_гена (референсная клеточная линия)

ΔCt(2) = Ct_RPL0 (тестируемая клеточная линия) - Ct_RPLO (референсная клеточная линия).

Для каждой серии ПЦР рассчитывали относительное количественное значение гена, и раковые клеточные линии классифицировали по группам с учетом уровня их экспрессии от максимальной до отрицательной. Все данные представлены на фиг.1А и 1В. Все тестируемые раковые клеточные линии экспрессировали CXCR4 (фиг.1А) и CXCR2, за исключением DU145 и U-87MG в отношении CXCR2 (фиг.1В).

- FACS анализ:

Раковые клеточные линии MDA-MB-231, РСЗ и U937 повергали пермеабилизации, а затем инкубировали либо с 10 мкг/мл анти-CXCR4-моноклональных антител [44717 (R&D Systems) в сравнении с изотипическим контролем IgG2b (SIGMA), либо с 10 мкг/мл анти-CXCR2-моноклональных антител (анти-n-CXCR2, клон 48311, R&D Systems, MKA 331) в сравнении с изотипическим контролем IgG2a. Затем клетки промывали 1% BSA/PBS/0,01% NaN3. Далее к клеткам добавляли Alexa-меченые вторичные антитела и инкубировали при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки снова промывали два раза. После второго промывания проводили FACS-анализ. Результаты этих исследований связывания представлены на фиг.2. Таким образом, опухолевые клетки, такие как MDA-MB-231, РСЗ и U937, экспрессируют как CXCR4-, так и CXCR2-белки.

Пример 2: Создание моноклональных антител (MKA) против человеческого CXCR4

Для создания моноклональных антител к CXCR4 мышей BALB/c иммунизировали рекомбинантными клетками NIH3T3-CXCR4 и/или пептидами, соответствующими внеклеточному М-концу и петлям CXCR4. Мышей 6-16-недельного возраста при первой иммунизации иммунизировали один раз антигеном в полном адъюванте Фрейнда подкожно (s.c.), а затем от 2 до 6 раз антигеном в неполном адъюванте Фрейнда подкожно. Иммунный ответ контролировали в крови из ретроорбитального синуса. Скрининг сывороток проводили с помощью ИФА (как описано ниже), и мышей с более высоким титром анти-CXCR4-антител использовали для слияния. Мышей бустировали внутривенно антигеном за два дня до умерщвления и забора селезенки.

- ИФА

Чтобы выбрать мышей, продуцирующих анти-CXCR4-антитела, сыворотки от иммунизированных мышей проверяли с помощью ИФА. Вкратце, микротитровальные планшеты покрывали очищенным [1-41] N-концевым пептидом, конъюгированным с BSA (бычьим сывороточным альбумином) в количестве 5 мкг эквивалентного пептида/мл, 100 мкл/лунка, инкубировали при 4°С в течение ночи, а затем блокировали 250 мкл/лунка 0,5% желатином в PBS (фосфатно-солевом буфере). В каждую лунку вносили разведения плазмы от CXCR4-иммунизированных мышей и инкубировали 2 часа при 37°С. Планшеты промывали PBS, а затем инкубировали с козлиным противомышиным IgG-антителом, конъюгированным с HRP (Jackson Laboratories), в течение 1 часа при 37°С. После промывания в планшеты вносили субстрат ТМВ (тетраметилбензоидин), реакцию останавливали через 5 минут путем добавления 100 мкл/лунка 1М H₂SO₄. Мышей, у которых развивались высокие титры анти-CXCR4-антител, использовали для создания антител.

- Создание гибридом, продуцирующих MKA к CXCR4

Мышиные спленоциты, выделенные из мышей BALB/c, у которых развивались самые высокие титры анти-CXCR4-антител, сливали с помощью ПЭГ с мышиной миеломной клеточной линией Sp2/O. Клетки высевали в количестве примерно 1×10⁵/лунка в микротитровальные планшеты, затем инкубировали две недели в селективной среде, содержащей культуральную среду Ultra Culture+2 мМ L-глутамин+1 мМ пируват натрия+1х HAT. Скрининг лунок проводили с помощью ИФА с анти-CXCR4-моноклональными антителами IgG. Затем гибридомы, секретирующие антитела, субклонировали по меньшей мере дважды путем предельного разведения, культивировали in vitro для создания антитела для дальнейшего анализа.

Пример 3: Характеризация с помощью FACS-анализа специфичности связывания анти-CXCR4-MKA 5151-17 и распознавания раковых клеточных линий

В этом эксперименте специфическое связывание анти-CXCR4-MKA 515Н7 с человеческим CXCR4 определяли с помощью FACS-анализа.

Трансфицированные клетки NIH3T3, NIH3T3-hCXCR4, раковые клеточные линии MDA-MB-231, Hela и U937 инкубировали с 10 мкг/мл моноклонального антитела 515Н7. Затем клетки промывали 1% BSA/PBS/0,01% NaN3. Затем к клеткам добавляли Alexa-меченые вторичные антитела и инкубировали при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки снова промывали два раза. После второго промывания проводили FACS-анализ. Результаты этих исследований связывания представлены в таб.6, которая показывает [Средняя интенсивность флуоресценции (MFI), полученная при FACS], что анти-CXCR4-MKA 515Н7 связывалось специфично с человеческой трансфицированной клеточной линией CXCR4-NIH3T3, в то время на родительских клетках NIH3T3 распознавания не было. Это MKA также было способно распознавать человеческие раковые клеточные линии, например клетки рака молочной железы MDA-MB-231, промиелоцитарные раковые клетки U937 и клетки рака шейки матки Hela.

Анти-CXCR4-MKA 515Н7 распознавало трансфектант NIH3T3-hCXCR4, в то время как родительские клетки дикого типа NIH3T3 не распознавались. MKA 515Н7 также было способно распознавать раковые клеточные линии.

Таблица 6 Клон (10 мкг/мл) MFI на клеточных линиях NIH3T3 NIH3T3-CXCR4 MDA-MB-231 Hela U937 515Н7 16 2752 239 1851 645

Пример 4: Конкурентное связывание анти-СХСР4 MKA 515Н7 с [¹²⁵I]SDF-1 на мембранах СНО-K1, стабильно экспрессирующих человеческий рецептор CXCR4

Этот анализ позволяет оценить способность MKA 515Н7 конкурировать за связывание меченого радиоактивной меткой [¹²⁵I]SDF-I с человеческим рецептором CXCR4 либо на ортостерических, либо на аллостерических сайтах связывания.

Клетки CHO-K1, стабильно и конститутивно экспрессирующие человеческий рецептор CXCR4, были получены при трансфекции наивных клеток CHO-K1 (АТСС CCL-61) вектором для экспрессии в клетках млекопитающих, несущим всю кодирующую последовательность человеческого рецептора CXCR4 (RefSeq NM_003467). Клетки размножались в полной культуральной среде [DMEM-Хэма F12 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 500 мкг/мл генетицина]. Эксперименты со связыванием радиолиганда проводили на клеточных мембранах, полученных при механическом разрушении клеток CHO/CXCR4 в литическом буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, NaCI 150 мМ] и последующем центрифугировании (10000 g, 15 мин). [¹²⁵I]SDF-1-связывание (специфическая активность: 1500 Ки/ммоль) проводили с использованием методики SPA (сцинтилляционный анализ сближения - GE Healthcare). Вкратце, клеточные мембраны (30 мкг/лунка) инкубировали в связывающем буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, CaCl₂ 1 мМ, MgCl₂ 5 мМ, NaCl 150 мМ, BSA 1%] вместе с оцениваемым соединением (SDF-1 или MKA), радиолигандом (1 нМ) и, наконец, бусинами SPA-WGA-PVT (7,3 мг/лунка). Равновесие связывания достигалось через 1 ч при 25°С. После центрифугирования [1000 g в течение 10 мин] измеряли уровень радиоактивности в сцинтилляционном счетчике (TopCount, Perkin Elmer). Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 10 мкМ немеченного SDF-1.

Немеченый SDF-1 дозозависимо ингибировал [¹²⁵I]SDF-1-связывание со значением PKi (IC₅₀ = концентрация лиганда, дающая 50% ингибирование специфического [¹²⁵I]SDF-I-связывания) 7,75±0,27 нМ (n=4) (фиг.3А). В тех же экспериментальных условиях 515Н7 (100 нМ) эффективно конкурировало за [¹²⁵I]SDF-I -связывание со следующим порядком ранжирования эффективности конкуренции (% ингибирования [¹²⁵I]SDF-1): 64±3% (фиг.3В).

Пример 5: Модуляция [³⁵S]GTPγS-связывания на клеточных мембранах, экспрессирующих рецептор CXCR4 дикого типа, анти-CXCR4 моноклональным антителом 515Н7

Этот функциональный анализ позволяет контролировать активацию G-белка через человеческий рецептор CXCR4 дикого типа и его модуляцию CXCR4-лигандами и MKA 515Н7.

Клетки NIH-3T3, стабильно и конститутивно экспрессирующие рецептор CXCR4 дикого типа, были получены, как описано в примере выше для клеток CHO-K1. Клетки HeLa (человеческая карцинома шейки матки) размножались в полной культуральной среде [ЕМЕМ с добавлением 10% FCS, 1% L-глутамина, 2µ бикарбоната натрия]. [³⁵S]GTPγS-связывание выполняли на клеточных мембранах, полученных при механическом разрушении в литическом буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, NaCl 150 мМ] и последующем центрифугировании (10000 д, 15 мин). Встраивание и выявление [³⁵S]GTPγS (специфическая активность: 1000 Ки/ммоль) проводили с использованием методики ЗРА (сцинтилляционный анализ сближения - GE Healthcare). Вкратце, клеточные мембраны (10 мкг/лунка) инкубировали в связывающем буфере [Hepes 20 мМ, GDP 3 мкМ, MgCl₂ 10 мМ, NaCl 100 мМ, EDTA 1 мМ, рН=7,4] вместе с оцениваемым соединением (3DF-1 или MKA, представляющее интерес), [³⁵S]GTPγS (0,2-0,4 нМ) и, наконец, бусинами 3PA-WGA-PVT (7,3 мг/лунка). Равновесие связывания достигалось через 1 ч при 25°С. После центрифугирования [1000 g в течение 10 мин] измеряли уровень радиоактивности в сцинтилляционном счетчике (TopCount, Perkin Elmer). Силу антагониста рассчитывали с применением уравнения Cheng-Prussof:

К_В=[конц. антагониста]/{(ЕС_50'/ЕС₅₀)-1}, где EC₅₀ и EC_50' соответственно являются силой 3DF-1 в отсутствие и в присутствии MKA.

SDF-1 индуцировал дозозависимое увеличение [³⁵S]GTPγS-связывания в результате активации белка G рецептором CXCR4. Максимальная стимуляция [³⁵S]GTPγS-связывания представляет соответственно 167% и 320% по сравнению с базальным [³⁵S]GTPγS-связыванием для мембран клеток HeLa и NIH3T3/CXCR4. Сила SDF-1 была одинакова для обеих клеточных линий и соответствовала 41,3±9,7 нМ (фиг.4). В этих экспериментальных условиях сила антагониста MKA 515Н7, определенная в клетках NIH3T3/CXCR4, составляла 15 нМ. Аналогичная эффективность антагониста наблюдалась для клеток HeLa (фиг.5).

Пример 6: Ассоциация CXCR4 с различными участниками взаимодействия: гомо- и гетеродимеризация, привлечение β-аррестина с помощью подхода резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) и влияние MKA 515Н7 на эти димеры

Этот функциональный анализ позволяет оценить конформационные изменения, вызванные связыванием SDF-1 и/или MKA 515Н7 с рецептором CXCR4 на уровне формирования гомодимера CXCR4 и гетеродимера CXCR2/CXCR4, а также привлечение сигнального белка р-аррестина-2.

Экспрессионные векторы для каждого из исследуемых участников взаимодействия были построены как гибридные белки с соответствующей меткой (люцифераза Renilla reniformis, Rluc, и желтый флуоресцентный белок, YFP) с помощью обычных методик молекулярной биологии. За два дня до проведения BRET-экспериментов клетки НЕК293 временно трансфицировали экспрессионными векторами, кодирующими соответствующие участники BRET: [CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP] для изучения гомодимеризации CXCR4, [CXCR4/Rluc+CXCR2:YFP] для изучения гетеродимеризации CXCR4 и CXCR2 и [CXCR4/Rluc+β-arr2:YFP] для изучения CXCR4-опосредованного привлечения β-аррестина-2. На следующий день клетки распределяли в предварительно покрытых полилизином белых 96-луночных микротитровальных планшетах в полной культуральной среде [DMEM с добавлением 10% FBS]. Клетки вначале культивировали при 37°С с 5% CO₂, с тем чтобы клетки прикрепились к планшету. Затем клетки оставляли в 200 мкл DMEM/лунка на ночь. Непосредственно перед BRET-экспериментом DMEM удаляли и клетки быстро промывали PBS. Затем клетки инкубировали в PBS в присутствии или в отсутствие антитела, 10 мин при 37°С, а затем добавляли 5 мкМ коэлентеразина Н с или без 300 нМ SDF-1 в конечном объеме 50 мкл. После инкубации в течение еще 10 минут при 37°С начинали захват излучаемого света с помощью многофункционального анализатора Mithras LB940 при 485 нм и 530 нм (Berthold) (1 с/длина волны/лунка повторяется 15 раз при комнатной температуре).

Расчет отношения BRET проводили, как описано выше (Angers et al., 2000): [(эмиссия_{530 нм})-(эмиссия_{485 нм})×Cf]/(эмиссия_{485 нм}), где Cf=(эмиссия_{530 нм})/(эмиссия_{485 нм}) для клеток, экспрессирующих только гибридный белок Rluc в тех же экспериментальных условиях. Упрощение этого уравнения показывает, что соотношение BRET соответствует отношению 530/485 нм, полученному, когда присутствуют два участника, скорректированному отношением 530/485 нм, полученным в тех же экспериментальных условиях, когда в анализе присутствует только участник, слитый с Rluc. Для удобочитаемости результаты выражаются в единицах миллиВРЕТ (мBU); мBU соответствует отношению BRET, умноженному на 1000.

SDF1 (300 нМ) увеличивал примерно на 20% сигнал BRET, полученный из-за пространственной близости адаптерных и акцепторных белков, слитых с рецептором CXCR4, что, вероятно, указывает на формирование гомодимеров CXCR4/CXCR4 или конформационных изменений уже существующих димеров (фиг.6А). Интересно, что SDF1 (300 нМ) уменьшал примерно на 24% сигнал BRET, полученный из-за пространственной близости адаптерных и акцепторных белков, слитых с CXCR2 и CXCR4, что, вероятно, указывает на формирование гетеродимеров CXCR2/CXCR4 или конформационных изменений уже существующих димеров (фиг.6В). В этом последнем случае SDF-1-активированная конформация CXCR4/CXCR2 представляется менее благоприятной для переноса энергии BRET. В обоих случаях MKA 515Н7 было способно модулировать SDF-1 - индуцированные конформационные изменения гомодимеров CXCR4 (69% ингибирование SDF-1-индуцированного увеличения BRET, фиг.6А), а также формирование гетеродимеров CXCR2/CXCR4 (90% ингибирование SDF-1-индуцированного увеличения BRET для 515Н7, фиг.6 В). MKA 515Н7 само по себе также способно модулировать пространственную близость CXCR4/CXCR4 и CXCR2/CXCR4 соответственно, что указывает на влияние MKA 515Н7 на конформацию и гомодимера CXCR4/CXCR4, и гетеродимера CXCR2/CXCR4 (фиг.6А и 6В).

Активация CXCR4 с помощью SDF-1 (300 нМ) привела к мощному привлечению внутриклеточных сигнальных молекул р-аррестина, о чем говорит повышение BRET-сигнала на 233% (фиг.6С). Это привлечение частично ингибировалось MKA 515Н7 (примерно 95%, фиг.6С), показывая влияние MKA 515Н7 на передачу сигнала.

Пример 7: CXCR4-опосредованное ингибирование продукции цАМФ

Этот функциональный анализ предназначен для мониторинга передачи сигнала от рецептора CXCR4 на уровне аденилатциклаз через ингибиторные белки Gi/o.

Процедуру сАМР LANCE (Perkin Elmer) применяли в соответствии с описанием производителя. Вкратце, клетки NIH3T3, стабильно и конститутивно экспрессирующие рецептор CXCR4 дикого типа, получали и размножали, как описано выше. Клетки собирали с помощью свободного от трипсина агента Versene и ресуспендировали в концентрации 10⁶ клеток/мл в растворе, содержащем AlexaFIuor-связанное анти-цАМФ MKA (разведение 1/100) и соединение (форсколин, SDF-1 и/или MKA 515Н7). После инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин добавляли смесь для обнаружения, содержащую комплексы европий-стрептавидин (разведение 1/125) и биотин-цАМФ (разведение 1/125). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа полученный FRET-сигнал измеряли с помощью многофункционального анализатора Mithras LB940 (Berthold). Данные выражали либо в виде условных люминесцентных значений, либо в виде относительной стимуляции в сравнении с SDF-1-ответом после вычитании влияния FK.

Форсколин (FK) дозозависимо стимулировал продукцию цАМФ с силой примерно 0,3 мкМ в клетках NIH3T3/CXCR4 (фиг.7А). В присутствии SDF-1 внутриклеточный уровень цАМФ снижался в результате активации ингибиторного белка Gi/o рецептором CXCR4. Сила SDF-1 составляла 5,0±3,1 нМ (фиг.7А). MKA 515Н7 эффективно ингибировало форсколин-стимулированное влияние SDF-1 (100 нМ) более чем на 80% (фиг.7В).

Пример 8: Модуляция моноклональным антителом 515Н7 [³⁵S]GTPγS-связывания на клеточных мембранах, конститутивно экспрессирующих мутантный Asn¹¹⁹Ser CXCR4-рецептор

Этот функциональный анализ позволяет контролировать активацию G-белка через конститутивно активный мутантный (САМ) Asn¹¹⁹Ser CXCR4-рецептор (см. Zhang et al., 2002). Этот чувствительный анализ позволяет различать лиганды CXCR4 на основании их внутренней активности (частичный агонист, молчащий антагонист или обратный агонист). Как описано ранее Zhang и коллегами, CXCR4-лиганды, такие как AMD3100 или Т140, вели себя соответственно как частичный агонист и обратный агонист САМ-рецептора CXCR4. Идентификация молчащего антагониста может быть затруднена, так как этот класс молекул должен демонстрировать похожую аффинность и к активному, и к неактивному состоянию CXCR4 (Wurch et al., 1999).

Введение мутации Asn¹¹⁹Ser в кодирующую последовательность рецептора CXCR4 выполняли с помощью обычных методик молекулярной биологии (набор для сайт-направленного мутагенеза QuickChange, Stratagene, США). Клетки CHO-K1, стабильно и конститутивно экспрессирующие САМ-рецептор CXCR4, получали, как описано в примере выше. [³⁵S]GTP_γS-связывание выполняли на клеточных мембранах, полученных при механическом разрушении в литическом буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, 150 мМ NaCl] и дальнейшем центрифугировании (10000 g, 15 мин). Встраивание [³⁵S]GTPyS (специфическая активность: 1000 Ки/ммоль) проводили с использованием методики SPA (сцинтилляционный анализ сближения - GE Healthcare). Вкратце, клеточные мембраны (10 мкг/лунка) инкубировали в связывающем буфере [Hepes 20 мМ, GDP 3 мкМ, MgCl₂ 10 мМ, NaC1100 мМ, EDTA 1 мМ, рН=7,4] вместе с оцениваемым соединением (SDF-1 или MKA), [³⁵S]GTPγS (0,2-0,4 нМ) и, наконец, бусинами SPA-WGA-PVT (7,3 мг/лунка). Реакцию связывания проводили в течение 1 ч при 25°С. После центрифугирования [1000 g в течение 10 мин] измеряли уровень радиоактивности в сцинтилляционном счетчике (TopCount, Perkin Elmer).

SDF-1 (100 нМ) стимулировал [³⁵S]GTPγS-связывание на 130%. Обратный агонист Т140 ингибировал как базальное (-17%), так и SDF-1-стимулированное (-159%) [³⁵S]GTPγS-связывание. Напротив, MKA 515Н7 проявляло себя как молчащий антагонист САМ CXCR4, не изменяя базальное [³⁵S]GTPγS-связывание (фиг.8), но ингибируя SDF-1-индуцированное [³⁵S]GTPγS-связывание (фиг.8).

Пример 9: Влияние анти-CXCR4-MKA 515Н7 на SDF-1-индуцированную миграцию клеток U937

Для оценки ингибирующего влияния анти-CXCR4-моноклонального антитела 515Н7 на процесс миграции, 100000 клеток U-937 в среде RPMI 1640 с добавлением 2% FCS высевали в верхнюю камеру миграционных камер (24-луночные планшеты с размером пор 8 мкм) в присутствии или в отсутствие SDF-1 в нижней части лунок с или без MKA 515Н7 в верхней камере. В этом тесте мышиный IgG2b вводили в качестве изотипических контролей. Через два часа после посева подсчитывали мигрировавшие клетки. Результаты, представленные на фиг.9, показали, что, как и ожидалось, SDF-1 мог вызывать значительное увеличение миграции клеток U-937. Влияния не наблюдалось, когда клетки инкубировали с изотипическим контролем IgG2b. Напротив, для клеток, инкубированных с MKA 515Н7, наблюдалось значительное и воспроизводимое уменьшение SDF-1-индуцированной миграции клеток U937: более 80%.

Пример 10: Ингибирование роста ксенотрансплантатной опухоли MDA-МВ-231 у мышей Nod/Scid моноклональным анти-CXCR4-антителом 515Н7

Цель этих экспериментов заключалась в оценке способности анти-CXCR4-MKA 515Н7 ингибировать рост ксенотрансплантата MDB-MB-231 у мышей Nod/Scid.

Клетки MDA-MB-231 из ЕСАСС стандартно культивировали в среде DMEM (Invitrogen Corporation, Шотландия, Великобритания), 10% FCS (Sigma, Сент-Луис, Мэриленд, США). Клетки разделяли за 48 часов до введения трансплантата, так что они были в экспоненциальной фазе роста. Десять миллионов клеток MDA-MB-231 в PBS прививали 7-недельным мышам Nod/Scid (Charles River, Франция). Через пять дней после имплантации опухоли измеряли (34 мм³<V³<40 мм³) и животных разделяли на группы по 6 мышей с сопоставимым размером опухоли. Мышам вводили внутрибрюшинно (i.p.) нагрузочную дозу 2 мг/мышь MKA 515Н7.

Затем мышам инъекционно вводили 0,5 мг/доза/мышь MKA 515Н7 три раза в неделю. Группа PBS в этом эксперименте была введена в качестве контрольной группы. Объем опухоли измеряли два раза в неделю и рассчитывали по формуле: π/6×длина×ширина×высота. Статистический анализ проводили для каждого измерения с помощью критерия Манна-Уитни.

В этих экспериментах во время лечения смертности не наблюдалось. По сравнению с группой PBS наблюдалось значительное ингибирование роста опухоли между 7 и 39 днями (p≤0,002) для MKA 515Н7 0,5 мг/доза, а средний объем опухоли через 5 недель лечения уменьшился на 50% по сравнению с PBS для MKA 515Н7 (фиг.10).

Пример 11: CXCR4-рецептор-опосредованная мобилизация внутриклеточных депо кальция

Этот функциональный анализ был предназначен для наблюдения за CXCR4-рецепторной передачей сигнала через стимуляцию пути фосфолипазы С, вызывающей высвобождение кальция из внутриклеточных депо в эндоплазматическом ретикулуме.

Клетки CHO-K1, стабильно и конститутивно экспрессирующие CXCR4-рецептор дикого типа, были получены, как описано в примере выше. Клетки MDA-MB-231 (человеческая аденокарцинома молочной железы) и U937 (человеческая лимфома) размножались в полной культуральной среде, соответственно [DMEM с добавлением 10% FCS] и [RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, 20 мМ HEPES, 1% заменимых аминокислот, 1% пирувата натрия, 1% L-глутамина, 4,5 г/л глюкозы]. Все типы клеток высевали в черные 96-луночные микротитровальные планшеты с плотностью 100000 клеток/лунка в соответствующей культуральной среде. Клетки оставляли на ночь перед проведением экспериментов. Клетки нагружали флуоресцентной кальциевой меткой (Fluo-4 No Wash, Invitrogen, США) в загрузочном буфере [HBSS 1×, HEPES 20 мМ, кислота пробенецид 25 мМ] в течение 30 мин при 37°С, затем 30 мин при 25°С. Стимуляцию SDF-1 выполняли путем прямого введения в каждую лунку. Для антагонистических экспериментов 10 мкл раствора MKA добавляли непосредственно в загрузочный буфер по меньшей мере за 10 мин до SDF-1. Кинетические измерения флуоресценции выполняли на многорежимном планшетном флуоресцентном анализаторе Mithras LB940 (Berthold), используя следующие параметры: возбуждение при 485 нм, излучение при 535 нм, энергия возбуждения 10000 условных единиц. Флуоресценцию в каждой лунке регистрировали в течение 0,1 секунды каждую секунду и в течение 20 сек до введения SDF-1 (базальный сигнал). Затем вводили 20 мкл SDF-1 и записывали данные в течение 2 мин. Каждое экспериментальное условие повторяли дважды. Значения в каждой лунке вначале корректировали путем вычитания базальной флуоресценции и флуоресценции, испускаемой контрольными лунками без клеток. Относительные данные выражали в процентах от максимальной стимуляции, полученной SDF-1 (100 нМ).

SDF1 (100 нМ) индуцировал быстрый и сильный выход внутриклеточного кальция в рекомбинантных CHO/CXCR4, в то время как в наивных клетках CHO-K1 сигнала флуоресценции обнаружено не было. Максимальная интенсивность достигала >160% по сравнению с базальной флуоресценцией и наблюдалась примерно 30 сек при стимуляции SDF-1; подобные кинетические кривые наблюдались и для MDA-MB-231, и для U-937 (фиг.11А, 11В, 11С), хотя максимальная интенсивность флуоресценции SDF-1 (100 нМ) была ниже (130-140% по сравнению с базальной). Антитело 515Н7 (133 нМ) давало сильное и почти полное ингибирование SDF-1 (100 нМ)-индуцированного кальциевого сигнала во всех трех исследуемых клеточных линиях.

Пример 12: Активность анти-CXCR4-MKA 515Н7 на мышиной модели выживаемости U937

Клетки U937 из АТСС культивировали в среде RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-глутамин. Клетки разделяли за два дня до введения трансплантата, так что они находились в экспоненциальной фазе роста. Десять миллионов клеток U937 вводили внутрибрюшинно самкам мышей NOD/Scid. Через два дня после имплантации мышам подкожно вводили нагрузочную дозу 2 мг/мышь MKA 515Н7, а затем два раза в неделю по 1 мг антитела/мышь. Контрольные мыши получали инъекции PBS, и, как было указано в предыдущих исследованиях, не наблюдалось никакой разницы в выживаемости между мышами, которым вводили PBS, и мышами, которым вводили изотипический контроль мышиный IgG. Мышиную выживаемость контролировали каждый день.

Результаты, описанные на фиг.12, показывают, что у мышей, которым вводили MKA 515Н7, наблюдалось резкое и значительное увеличение продолжительности жизни с Т/С% примерно 280 для MKA 515Н7 (фиг.12).

Пример 13: Ингибирование роста Т-клеточной ксенотрансплантатной опухоли KARPAS 299 у мышей Nod/Scid моноклональным анти-CXCR4-антителом 515Н7

Цель этого эксперимента заключалась в оценке способности анти-CXCR4-MKA 515Н7 ингибировать рост ксенотрансплантата KARPAS 299 у мышей Nod/Scid.

Клетки KARPAS 299 из ЕСАСС стандартно культивировали в среде RPMI, 1% L-Glu и 10% FCS (Sigma, Сент-Луис, Мэриленд, США). Клетки разделяли за 48 часов до введения трансплантата, так что они находились в экспоненциальной фазе роста. Пять миллионов клеток KARPAS 299 в PBS прививали 7-недельным мышам Nod/Scid (Charles River, Франция). Через пять дней после имплантации опухоли измеряли (32 мм³<V³<49 мм³) и животных разделяли на группы по 6 мышей с сопоставимыми размерами опухолей. Мышам вводили внутрибрюшинно нагрузочную дозу 2 мг/мышь MKA 515Н7.

Затем мышам инъекционно вводили 1 мг/доза/мышь MKA 515Н7 два раза в неделю. Группа PBS была введена в этот эксперимент в качестве контрольной группы. Объем опухоли измеряли два раза в неделю и рассчитывали по формуле: π/6×длина×ширина×высота. Статистический анализ проводили для каждого измерения с помощью критерия Манна-Уитни.

В этом эксперименте во время лечения смертности не наблюдалось. По сравнению с группой PBS наблюдалось значительное ингибирование роста опухоли между 7 и 33 днями (р≤0,002) для MKA 515Н7 1 мг/доза, а средний объем опухоли через 5 недель лечения уменьшился на 63% для MKA 515Н7 по сравнению с PBS (фиг.13).

Пример 14: Продукция химерного анти-CXCR4-MKA с515Н7

Были разработаны химерные формы мышиного MKA 515Н7: они соответствуют вариабельным доменам легкой и тяжелой цепей мышиного антитела, представляющего интерес, генетически слитым с человеческим константаными доменами Скаппа и IgG1. Рекомбинантное MKA было получено путем временной трансфекции с помощью системы HEK293/EBNA с экспрессионным вектором рСЕР4 (Invitrogen, США).

Целые нуклеотидные последовательности, соответствующие вариабельным доменам легкой и тяжелой цепей MKA 515Н7, синтезировали путем общего синтеза генов (Genecust, Люксембург). Их субклонировали в вектор рСЕР4 (Invitrogen, США), несущий целую кодирующую последовательность константного домена либо легкой [Скаппа], либо тяжелой [СШ-шарнир-СН2-СН3] цепи человеческого иммуноглобулина IgG1. Все этапы клонирования выполняли в соответствии с обычными методиками молекулярной биологии, описанными в Laboratory manual (Sambrook and Russel, 2001), или в соответствии с инструкциями производителя. Каждую генетическую конструкцию полностью подтверждали путем секвенирования с использованием набора для секвенирования Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, США) и анализировали с помощью анализатора 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США).

Адаптированные к суспензии клетки НЕК293 EBNA (Invitrogen, США) выращивали стандартным способом в 250 мл колбах в 50 мл бессывороточной среды Excel 293 (SAFC Biosciences) с добавлением 6 мМ глутамина на орбитальном шейкере (скорость вращения 110 об/мин). Временную трансфекцию проводили на 2×10⁶ клеток/мл с помощью линейного 25 кДа полиэтиленимина (PEI) (Polysciences), приготовленного в воде в конечной концентрации 1 мг/мл, и плазмидной ДНК (конечная концентрация 1,25 мкг/мл с отношением плазмид с тяжелой и легкой цепями 1:1). Через 4 часа после трансфекции культуры разводили одним объемом свежей питательной среды для достижения конечной плотности клеток 10⁶/мл. Процесс культивирования контролировали на основании жизнеспособности клеток и продукции MKA. Как правило, культуры поддерживали в течение 4-5 дней. MKA очищали с помощью обычной хроматографии на смоле Protein A resin (GE Healthcare, США). MKA было получено на уровне, подходящем для функциональной оценки. Уровни производительности, как правило, находились в диапазоне между 6 и 15 мг/л очищенного MKA.

Пример 15: Характеризация с помощью FACS-анализа специфичности связывания анти-CXCR4 химерного MKA с515Н7 и распознавания раковой клеточной линии

В этом эксперименте с помощью FACS-анализа проверяли специфическое связывание анти-СХСР4 химерного MKA с515Н7.

Трансфицированные клетки NIH3T3, NIH3T3-hCXCR4 и раковую клеточную линию MDA-MB-231 линии инкубировали с 10 мкг/мл моноклонального антитела с515Н7. Затем клетки промывали 1% BSA/PBS/0,01% NaN3. Далее к клеткам добавляли Alexa-меченые вторичные антитела и инкубировали при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки снова промывали два раза. После второго промывания проводили FACS-анализ. Результаты этих исследований связывания представлены в следующей таблице 7, которая показывает [средняя интенсивность флуоресценции (MFI), полученная в FACS], что химерное анти-CXCR4-MKA с515Н7 специфически связывается с человеческой трансфицированной клеточной линией CXCR4-NIH3T3, а также распознает человеческие раковые клеточные линии, например клетки рака молочной железы MDA-MB-231.

Таблица 7 MKA (10 мкг/мл) MFI на клеточных линиях NIH3T3-CXCR4 MDA-MB-231 с515Н7 2294 118

Пример 16: Конкурентное связывание мышиного анти-CXCR4-MKA m515H7 и химерного анти-CXCR4-MKA с515Н7 с [¹²⁵I]SDF-1 на мембранах CHO-K1, стабильно экспрессирующих человеческий рецептор CXCR4

Этот анализ позволяет оценить способность MKA m515H7 и химерного MKA с515Н7 конкурировать за связывание меченного радиоактивной меткой [¹²⁵I]SDF-I с человеческим рецептором CXCR4 либо на ортостерических, либо на аллостерических сайтах связывания.

Клетки CHO-K1, стабильно и конститутивно экспрессирующие человеческий рецептор CXCR4, получали путем трансфекции наивных клеток CHO-K1 (АТСС CCL-61) вектором для экспрессии в клетках млекопитающих, несущим всю кодирующую последовательность человеческого рецептора CXCR4 (RefSeq NM_003467). Клетки размножались в полной культуральной среде [DMEM-Хэма F12 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 500 мкг/мл генетицина]. Эксперименты со связыванием радиолиганда проводили на клеточных мембранах, полученных при механическом разрушении клеток CHO/CXCR4 в литическом буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, NaCl 150 мМ] и последующем центрифугировании (10000 g, 15 мин). [¹²⁵I]SDF-I - связывание (специфическая активность: 1500 Ки/ммоль) проводили с использованием методики SPA (сцинтилляционный анализ сближения - GE Healthcare). Вкратце, клеточные мембраны (30 мкг/лунка) инкубировали в связывающем буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, CaCl₂ 1 мМ, MgCl₂ 5 мМ, NaCl 150 мМ, BSA 1%] вместе с оцениваемым соединением (SDF-1 или MKA), радиолигандом (1 нМ) и, наконец, бусинами SPA-WGA-PVT (7,3 мг/лунка). Равновесие связывания достигалось через 1 ч при 25°С. После центрифугирования [1000 g в течение 10 мин] измеряли уровень радиоактивности на сцинтилляционном счетчике (TopCount, Perkin Elmer). Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 10 мкМ немеченного SDF-1.

Анти-CXCR4-MKA (100 нМ) эффективно конкурировали за [¹²⁵I]SDF-I-связывание со следующим порядком ранжирования эффективности конкуренции (% ингибирования [¹²⁵I]SDF-I): m515H7 (62±10%) и с515Н7 (55±4%) (фиг.14).

Пример 17: Модуляция [³⁵S]GTPγS-связывания на клеточных мембранах, экспрессирующих рецептор CXCR4 дикого типа, мышиным анти-CXCR4-MKA m515H7 и химерным анти-CXCR4-MKA с515Н7.

Этот функциональный анализ позволяет контролировать активацию G-белка через человеческий рецептор CXCR4 дикого типа и его модуляцию мышиным анти-CXCR4-MKA m515H7 и химерным анти-CXCR4-MKA с515Н7.

Клетки NIH-3T3, стабильно и конститутивно экспрессирующие рецептор CXCR4 дикого типа, получали, как описано в примере выше для клеток CHO-K1. Клетки HeLa (человеческая карцинома шейки матки) размножались в полной культуральной среде [ЕМЕМ с добавлением 10% FCS, 1% L-глутамина, 2 мкМ бикарбоната натрия]. [³⁵S]GTPγS-связывание выполняли на клеточных мембранах, полученных при механическом разрушении в литическом буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, NaCl 150 мМ] и последующем центрифугировании (10000 g, 15 мин). Встраивание и выявление [³⁵S]GTPγS (специфическая активность: 1000 Ки/ммоль) проводили с использованием методики SPA (сцинтилляционный анализ сближения - GE Healthcare). Вкратце, клеточные мембраны (10 мкг/лунка) инкубировали в связывающем буфере [Hepes 20 мМ, GDP 3 мкМ, MgCl₂ 10 мМ, NaCl 100 мМ, EDTA 1 мМ, рН=7,4] вместе с оцениваемым соединением (SDF-1 и MKA, представляющим интерес), [³⁵S]GTPγS (0,2-0,4 нМ) и, наконец, бусинами SPA-WGA-PVT (7,3 мг/лунка). Равновесие связывания достигалось через 1 ч при 25°С. После центрифугирования [1000 g в течение 10 мин] измеряли уровень радиоактивности на сцинтилляционном счетчике (TopCount, Perkin Elmer). 1650 рассчитывали для каждого MKA.

В этих экспериментальных условиях IC₅₀ MKA m515H7 и с515Н7, определенная в клетках NIH3T3/CXCR4, составляла 1,9 нМ и 1,5 нМ, соответственно (фиг.15). IC₅₀ MKA m515H7 и с515Н7, определяемая с помощью клеток HeLa в тех же экспериментальных условиях, составляла 0,2 нМ и 0,6 нМ, соответственно (фиг.16).

Пример 18: Ассоциация CXCR4 с различными участниками взаимодействия: гомо- и гетеродимеризация, привлечение β-аррестина с помощью подхода резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) и влияние мышиного MKA m515H7 и химерного MKA с515Н7 на эти димеры

Этот функциональный анализ позволяет оценить конформационные изменения, вызванные связыванием SDF-1 и/или мышиного MKA m515H7 и химерного MKA с515Н7 с рецептором CXCR4, на уровне формирования гомодимера CXCR4 и гетеродимера CXCR2/CXCR4, а также привлечения сигнального белка β-аррестина-2.

Экспрессионные векторы для каждого из исследуемых участников взаимодействия были построены как гибридные белки с соответствующей меткой (люцифераза Renilla reniformis, Rluc, и желтый флуоресцентный белок, YFP) с помощью обычных методик молекулярной биологии. За два дня до проведения экспериментов BRET клетки НЕК293 временно трансфицировали экспрессионными векторами, кодирующими соответствующих участников BRET: [CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP] для изучения гомодимеризации CXCR4, [CXCR4-Rluc+CXCR2-YFP] для изучения гетеродимеризации CXCR4 и CXCR2 и [CXCR4-Rluc+β-arr2-YFP] для изучения CXCR4-опосредованного привлечения р-аррестина-2. На следующий день клетки распределяли в предварительно покрытые полилизином белые 96-луночные микротитровальные планшеты в полной культуральной среде [DMEM с добавлением 10% FBS]. Клетки вначале культивировали при 37°С с 5% CO₂, с тем чтобы клетки прикрепились к планшету. Затем клетки оставляли в 200 мкл DMEM/лунка на ночь. Непосредственно перед BRET-экспериментом DMEM удаляли и клетки быстро промывали PBS. Затем клетки инкубировали в PBS в присутствии или в отсутствие антитела 15 мин при 37°С, а затем добавляли 5 мкМ коэлентеразина Н с или без 100 нМ SDF-1 в конечном объеме 50 мкл. После инкубации в течение 5 минут при 37°С, а также инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре только для гомо- и гетеродимеров, начинали захват излучаемого света с помощью многофункционального анализатора Mithras LB940 (Berthold) при 485 нм и 530 нм (1 с/длина волны/лунка повторяется 15 раз при комнатной температуре).

Расчет отношения BRET проводили, как описано выше (Angers et al., 2000): [(эмиссия_{530 нм})-(эмиссия_{485 нм})×Cf]/(эмиссия_{485 нм}), где Cf=(эмиссия_{530 нм})/(эмиссия_{485 нм}) для клеток, экспрессирующих только гибридный белок Rluc в тех же экспериментальных условиях. Упрощение этого уравнения показывает, что соотношение BRET соответствует отношению 530/485 нм, полученному, когда присутствуют два участника BRET, скорректированному отношением 530/485 нм, полученным в тех же экспериментальных условиях, когда в анализе присутствует только участник, слитый с Rluc. Для удобочитаемости результаты выражаются в единицах миллиВРЕТ (mbu); mbu соответствует отношению BRET, умноженному на 1000.

SDF1 (100 нМ) увеличивал примерно на 10% сигнал BRET, полученный из-за пространственной близости донорных и акцепторных белков, слитых с рецептором CXCR4, что, вероятно, указывает на формирование гомодимеров CXCR4/CXCR4 или конформационные изменения уже существующих димеров (фиг.17А). Интересно, что SDF1 (100 нМ) уменьшал примерно на 17% сигнал BRET, полученный из-за пространственной близости донорных и акцепторных белков, слитых с CXCR4 и CXCR2, что, вероятно, указывает на формирование гетеродимеров CXCR2/CXCR4 или конформационные изменения уже существующих димеров (фиг.17В). В этом последнем случае SDF-1-активированная конформация CXCR4/CXCR2 представляется менее благоприятной для переноса энергии BRET. В обоих случаях MKA m515H7 и с515Н7 были способны модулировать SDF-1-индуцированные конформационные изменения гомодимеров CXCR4 (96% ингибирование SDF-1-индуцированного увеличения BRET для с515Н7, фиг.17А), а также формирование гетеродимеров CXCR2/CXCR4 (98% ингибирование SDF-1-индуцированного уменьшения BRET для с515Н7, фиг.17 В). MKA m515H7 и с515Н7 сами по себе также были способны модулировать пространственную близость CXCR4/CXCR4 и CXCR2/CXCR4 соответственно, что указывает на влияние этих MKA на конформацию и гомодимера CXCR4/CXCR4, и гетеродимера CXCR2/CXCR4 (фиг.17А и 17В).

Активация CXCR4 с помощью SDF-1 (100 нМ) привела к мощному привлечению внутриклеточных сигнальных молекул β-аррестина, о чем говорит повышение BRET-сигнала на 400% (фиг.17С). Это привлечение частично ингибируется MKA с515Н7 (примерно 93%, фиг.17С), показывая влияние этих MKA на передачу сигнала.

Пример 19. CXCR4-рецептор-опосредованная мобилизация внутриклеточных депо кальция

Этот функциональный анализ был предназначен для наблюдения за CXCR4-рецепторной передачей сигнала через стимуляцию пути фосфолипазы С, вызывающей высвобождение кальция из внутриклеточных депо в эндоплазматическом ретикулуме.

Клетки CHO-K1, стабильно и конститутивно экспрессирующие рецептор CXCR4 дикого типа, были получены, как описано в примере выше. Клетки U-937 (человеческая лейкемия) размножались в полной культуральной среде, соответственно [DMEM с добавлением 10% FCS] и [RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, 20 мМ HEPES, 1% заменимых аминокислот, 1% пирувата натрия, 1% L-глутамина, 4,5 г/л глюкозы]. Все типы клеток высевали в черные 96-луночные микротитровальные планшеты с плотностью 100000 клеток/лунка в соответствующей культуральной среде. Клетки оставляли на ночь перед проведением экспериментов. Клетки нагружали флуоресцентной кальциевой меткой (Fluo-4 No Wash, Invitrogen, США) в загрузочном буфере [HBSS 1×, HEPES 20 мМ, кислота пробенецид 25 мМ] в течение 30 мин при 37°С, затем 30 мин при 25°С. Стимуляцию SDF-1 выполняли путем прямого введения в каждую лунку. Для антагонистических экспериментов 10 мкл раствора MKA добавляли непосредственно в загрузочный буфер по меньшей мере за 10 мин до SDF-1. Кинетические измерения флуоресценции выполняли на многорежимном планшетном анализаторе Mithras LB940 (Berthoid), используя следующие параметры: возбуждение при 485 нм, излучение при 535 нм, энергия возбуждения 10000 условных единиц. Флуоресценцию в каждой лунке регистрировали в течение 0,1 секунды каждую секунду и в течение 20 сек до введения SDF-1 (базальный сигнал). Затем вводили 20 мкл SDF-1 и записывали данные в течение 2 мин. Каждое экспериментальное условие повторяли дважды. Значения в каждой лунке вначале корректировали путем вычитания базальной флуоресценции и флуоресценции, испускаемой контрольной лункой без клеток. Относительные данные выражали в процентах от максимальной стимуляции, полученной с SDF-1 (100 нМ).

SDF1 (100 нМ) индуцировал быстрый и сильный выход внутриклеточного кальция в рекомбинантных CHO/CXCR4, в то время как в наивных клетках CHO-K1 сигнала флуоресценции обнаружено не было. Максимальная интенсивность достигала более 140% по сравнению с базальной флуоресценцией и наблюдалась примерно 40 сек при стимуляции SDF-1; подобные кинетические кривые наблюдались для клеток U-937 (фиг.18А, 18В). Химерное антитело с515Н7 (133 нМ) давало сильное и почти полное ингибирование SDF-1 (100 нМ)-индуцированного кальциевого сигнала во обеих исследуемых клеточных линиях.

Пример 20. Влияние мышиного анти-CXCR4-MKA m515H7 и химерного анти-CXCR4-MKA с515Н7 на SDF-1-индуцированную миграцию клеток U937

Для оценки ингибирующего влияния анти-CXCR4-MKA m515H7 и с515Н7 на процесс миграции, 100000 клеток U-937 в среде RPMI 1640 с добавлением 2% FCS высевали в верхнюю камеру миграционных камер (24-луночные планшеты с размером пор 8 мкм) в присутствии или в отсутствие SDF-1 в нижней части лунок и с или без MKA с515Н7 и m515H7 в верхней камере. В этом анализе мышиный IgG2b вводили в качестве изотипического контроля. Через два часа после посева подсчитывали мигрировавшие клетки. Результаты, представленные на фиг.19, показали, что, как и ожидалось, SDF-1 мог вызывать значительное увеличение миграции клеток U-937. Влияния не наблюдалось, когда клетки инкубировали с изотипическим контролем IgG2. Напротив, для клеток, инкубированных с MKA с515Н7 и m515H7, наблюдалось значительное и воспроизводимое уменьшение SDF-1-индуцированной миграции клеток U937: примерно более 80% с MKA с515Н7 и m515H7.

Пример 21: Активность химерного анти-CXCR4-MKA с515Н7 на мышиной модели выживаемости U937

Клетки U937 из АТСС культивировали в среде RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-глутамин. Клетки разделяли за два дня до введения трансплантата, так что они находились в экспоненциальной фазе роста. Десять миллионов клеток U937 вводили внутрибрюшинно самкам мышей NOD/Scid. Через два дня после имплантации мышам подкожно вводили нагрузочную дозу MKA с515Н7 2 мг/мышь, а затем два раза в неделю 1 мг антитела/мышь. Контрольные мыши получали инъекции PBS, и, как было указано в предыдущих исследованиях, не наблюдалось никакой разницы в выживаемости между мышами, которым вводили PBS, и мышами, которым вводили изотипический контроль мышиный IgG. Мышиную выживаемость контролировали каждый день.

Результаты, описанные на фиг.20, показывают, что у мышей, которым вводили MKA с515Н7, наблюдалось резкое и значительное увеличение продолжительности жизни с Т/С% примерно 180.

Пример 22: Гуманизация мышиного анти-CXCR4-антитела 515Н7

Общая процедура

Гуманизацию анти-CXCR4-антитела 515Н7 производили путем применения общих правил CDR-прививки. Иммуногенетический анализ и определение CDR и каркасных областей (FR) проводили с применением уникальной схемы нумерации IMGT, а также библиотек и инструментов IMGT (Lefranc, 1997 - www.imgt.org).

Эффективность процесса гуманизации оценивали путем анализа функциональной активности спроектированных в плане их способности ингибировать SDF-1-опосредованное привлечение β-аррестина с помощью анализа резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET). В этом анализе CXCR4 метили люциферазой, а β-аррестин метили YFP. SDF-1 -опосредованное привлечение β-аррестина на CXCR4 является важным шагом в передаче сигнала от CXCR4. Связывание гуманизированных вариантов 515Н7 также определяли на клеточной линии NIH3T3, стабильно трансфицирующей человеческий CXCR4. Связывающую активность оценивали в конкурентном анализе с биотинилированным мышиным антителом. При второй попытке гуманизированные антитела оценивали в плане их способность ингибировать связывание биотинилированного SDF-1 с RAMOS-клетками. RAMOS-клетки были выбраны из-за их высокой экспрессии CXCR4 и низкой экспрессии CXCR7 и SDF-1.

Эти анализы использовали для характеризации рекомбинантных гуманизированных версий анти-CXCR4-антител. Вариабельные домены форматировали с константными доменами человеческого IgG1/κ и клонировали в вектор для экспрессии в клетках млекопитающих рСЕР. Рекомбинантные IgG1/κ-производные антитела временно экспрессировали в клетках HEK293. Супернатанты экспрессирующих культур фильтровали и антитела очищали с использованием с белок-А-сефарозы. Очищенные антитела повторно буферизовали в PBS и определяли концентрацию антител с помощью ИФА.

Гуманизация вариабельных доменов 515Н7

Для того чтобы выбрать подходящую человеческую зародышевую линию для CDR-прививки, выявляли человеческий зародышевый ген с наиболее высокой гомологией с мышиной последовательностью 515Н7 VH. С помощью базы данных и инструментов IMGT человеческий зародышевый ген IGHV3-49*04 и человеческий зародышевый ген IGHJ4*01 J были выбраны в качестве человеческих акцепторных последовательностей для мышиных CDR 515H7 VH. Человеческий V-ген IGHV3-49*04 имеет гомологию 80,27% с V-геном вариабельного домена тяжелой цепи мышиного 515H7. Гомология с человеческим J-геном IGHJ4*01 J составляет 87,50%. Девятнадцать остатков различаются между выбранными человеческими зародышевыми генами и VH-доменом мышиного антитела 515H7. Выравнивание последовательностей VH-домена родительского антитела и зародышевой линии изображено на фиг.21.

Что касается вариабельного домена легкой цепи, были выбраны человеческие зародышевые гены 1GKV4-1*01 и IGKJ1*01 (фиг.22). Гомология с человеческим V-геном IGKV4-1*01 составляет 79,12%. J-ген легкой цепи 515H7 имеет гомологию 84,85% с человеческим J-геном IGKJ1*01.

Аминокислотную последовательность транслированных человеческих зародышевых генов IGHV3-49*04 и IGKV4-1*01 использовали для идентификации гомологичных антител, которые были кристаллизованы. Для тяжелой цепи в качестве модели было выбрано антитело с регистрационным номером 1МАМ в белковой базе данных RCSB, а для легкой цепи было выбрано антитело 1SBS. Два домена были собраны с использованием компьютерной программы DS visual и использовались в качестве модели для гуманизированного антитела 515H7.

На основании позиции каждого остатка, который отличается у родительского антитела и соответствующей человеческой зародышевой последовательности, каждому остатку, различающемуся в человеческой и мышиной последовательностях, был дан ранг приоритета (фиг.21 и 22). Эти приоритеты использовали для создания трех различных вариантов каждого гуманизированного вариабельного домена, названных соответственно VH1, VH2 и VH3.

В первой серии экспериментов конструировали и анализировали анти-CXCR4-связывающие активности трех первых гуманизированных вариантов. Вариант VH1 (VH1) был объединен с мышиным VL, и эти конструкции оценивали по их способности ингибировать связывание биотинилированного мышиного родительского антитела 515H7. Все конструкции продемонстрировали аналогичные способности конкурировать с мышиным антителом (фиг.23А-С). Это означает, что наиболее человеческий вариант VH имеет такие же связывающие свойства, что и менее человеческие варианты. Таким образом, VH1 был объединен с тремя различными вариантами VL (фиг.23D-F). Только сочетание VH1 и VL3 показало снижение способности конкурировать с биотинилированным мышиным антителом, в то время как наиболее человеческий вариант VH1 VL1, который не нес никаких обратных мутаций в каркасных участках, показал такую же перекрестную блокирующую активность, что и химерное антитело.

Этот вариант VH1 VL1 также был проанализирован на его способность ингибировать SDF-1-опосредованное привлечение β-аррестина в анализах BRET (фиг.24). Несмотря на желательную связывающую активность с рецептором, определенную перекрестным блокированием родительского антитела, конструкция VH1 VL1 показала лишь слабое ингибирование привлечения β-аррестина. Это отсутствие сильной ингибирующей активности делает необходимыми замены человеческих каркасных остатков мышиными остатками. Для VH 1 были сконструированы одиночные обратные мутации. Были заменены следующие остатки: V48L, E61D, D76N и A81L (нумерация в соответствии с первичной аминокислотной последовательностью). Эти одиночные обратные мутанты варианта VH1 объединяли с вариантом VL1. Из них только обратная мутация D76N привела к повышенному ингибированию передачи сигнала, оцениваемому в анализе BRET (фиг.25В).

Для повышения активности этой конструкции и дальнейшей оценки важности других остатков для VH 1 были построены различные двойные обратные мутанты. Ингибирующая активность этих конструкций была немного улучшенной (среднее ингибирование примерно 45-50%), но не удовлетворительной (фиг.25С). Затем одиночный обратный мутант D76N комбинировали с тремя различными вариантами VL (фиг.25D). Конструкция hz515H7 VH D76N VL2 показала в среднем активность 88,2%, которая находится в том же диапазоне, что и у химерного антитела.

Одиночные и двойные обратные мутанты конструировали в варианте домена VL1 и сравнивали с активностью конструкции hz515H7 VH1 D76N VL2 (фиг.26). Ни одна из проверенных комбинаций не имела подобной или лучшей активности, чем эта конструкция.

Для hz515H7 VH1 D76N VL2 был рассчитан процент человеческих остатков в каркасной области: она содержит 14 нечеловеческих остатков из 180 остатков, что соответствует «зародышевому индексу» («germinality index») 92,2%. Для сравнения, гуманизированные и продаваемые антитела бевацизумаб и трастузумаб содержат соответственно 30 и 14 нечеловеческих остатков в их вариабельных доменах.

Четыре лучшие гуманизированные формы, показывающие самую высокую эффективность в ингибировании SDF-1-опосредованного привлечения β-аррестина, были также проверены на их способность ингибировать связывание биотинилированного SDF-1 (фиг.27А). Была выявлена тесная корреляция ингибирования связывания SDF-1 и привлечения β-аррестина. Эта корреляция показывает, что ингибирование связывания SDF-1, скорее всего, является основным механизмом ингибирования передачи сигнала.

В целях дальнейшей гуманизации варианта hz515H7 VH1 D76N VL2 были созданы три дополнительных варианта с использованием информации, полученной для двойных и тройных мутантов, оцениваемых на фиг.26. Четыре и пять дополнительных остатков были гуманизированы, соответственно, в вариантах VL2.1, VL2.2 и VL2.3 (также называемых VL2-1, VL2-2 и VL2-3). Они соответствуют остаткам D9, Р49, D66, S69, S83, L84, V89. Выравнивание этих трех вариантов в сравнении с VL2 показано на фиг.28.

Оценивали мощность этих VL-2-вариантов в ингибировании SDF-1-опосредованного привлечения β-аррестина. Гуманизированные варианты hz515H7 VH1 D78N VL2, VL2.1, VL2.2 и VL2.3 показали активность, схожую с химерным антителом с515Н7 (фиг.26).

Гуманизация вариабельных доменов 515Н7-2

Для того чтобы создать другую гуманизированную форму, была выбрана другая подходящая человеческая зародышевая линии для CDR-прививки, для вариабельного домена и легкой, и тяжелой цепей. Для обоих зародышевую линию выбирали не только по проценту гомологии с мышиной последовательностью, но также и по одинаковой длине CDR VL и VH, соответственно, мышиного 515Н7.

С помощью базы данных и инструментов IMGT человеческий зародышевый ген IGHV3-73*01 и человеческий зародышевый ген IGHJ4*01 J были выбраны в качестве человеческих акцепторных последовательностей для мышиных CDR 515Н7 VH. Человеческий V-ген IGHV3-73*01 имеет гомологию более 79% с V-геном вариабельного домена тяжелой цепи мышиного 515Н7. Гомология с человеческим J-геном IGHJ4*01 J составляет 87,50%.

Что касается вариабельного домена легкой цепи, были выбраны человеческие зародышевые гены IGKV2D-40*01 и IGKJ1*01. Гомология с человеческим V-геном IGKV2D-40*01 составляет более 70%. J-ген легкой цепи 515Н7 имеет гомологию 84,85% с человеческим J-геном IGKJ1*01.

На основании позиции каждого остатка, который отличается у родительского антитела и соответствующей человеческой зародышевой последовательности, а также на основании знаний, имеющихся у специалистов в данной области, несколько критических остатков были идентифицированы как остатки, которые могут быть подвергнуты обратной мутации.

Что касается тяжелой цепи, этими остатками являются H35S, V48L, R50F, A61D, D76N и/или A81L (см. SEQ ID №№86 и 90 в таблице 2с).

Что касается легкой цепи, этими остатками являются L9S, 121 М, D40A, L43Q, Y59A, A61D, D66A, S69T, G74E, D76Y и/или V89L (см. SEQ ID №№85 и 89 в таблице 2с).

Пример 23: Характеризация с помощью FACS-анализа специфичности связывания гуманизированного анти-CXCR4-MKA 515Н7 и распознавания раковых клеточных линий

В этом эксперименте специфическое связывание гуманизированных анти-CXCR4-MKA 515Н7 с человеческим CXCR4 определяли с помощью FACS-анализа.

Трансфицированные клетки NIH3T3, NIH3T3-hCXCR4 и раковые клеточные линии Ramos, U937 инкубировали с 0-10 мкг/мл гуманизированных антител 515Н7 (hz515H7 VH1 D76N VL2 [=hz515H7VL2], hz515H7 VH1 D76N VL2.1 [=hz515H7VL2.1], hz515H7 VH1 D76N VL2.2 [=hz515H7VL2.2] и hz515H7 VH1 D76N VL2.3 [=hz515H7VL2.3]) в течение 20 мин при 4°С в темноте в 100 мкл FACS-буфера. После 3-кратного промывания FACS-буфером клетки инкубировали со вторичным антителом, козлиным противочеловеческим Alexa 488 (разведение 1:500) в течение 20 мин при 4°С в темноте. После 3-кратного промывания в каждую лунку вносили пропидий йодид и анализировали только видимые клетки посредством FACS. Для каждого условия оценивали по меньшей мере 5000 жизнеспособных клеток для получения среднего значения интенсивности флуоресценции.

Результаты этих исследований связывания представлены на фиг.29А-29С, которые показывают [Средняя интенсивность флуоресценции (MFI), полученная при FACS], что гуманизированные анти-CXCR4-MKA hz515H7 специфически связывались с человеческой трансфицированной клеточной линией CXCR4-NIH3T3 (фиг.29А) (MFI=2,2 с родительскими клетками NIH3T3), а также распознавали человеческие раковые клеточные линии, например U937 (фиг.29 В) и Ramos (фиг.29С).

Пример 24: Модуляция гуманизированными анти-СХСР4 моноклональными антителами 515Н7 [³⁵S]GTPYS-связывания на клеточных мембранах, экспрессирующих рецептор CXCR4 дикого типа

Этот функциональный анализ позволяет контролировать активацию G-белка через человеческий рецептор CXCR4 дикого типа и его модуляцию CXCR4-лигандами и гуманизированными MKA 515Н7.

Клетки NIH-3T3, стабильно и конститутивно экспрессирующие рецептор CXCR4 дикого типа, были получены, как описано в примере выше для клеток CHO-K1. [³⁵S]GTRγS-связывание выполняли на клеточных мембранах, полученных при механическом разрушении в литическом буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, NaCl 150 мМ] и последующем центрифугировании (10000 g, 15 мин). Встраивание и выявление [³⁵S]GTPγS (специфическая активность: 1000 Ки/ммоль) проводили с использованием методики SPA (сцинтилляционный анализ сближения - GE Healthcare). Вкратце, клеточные мембраны (10 мкг/лунка) инкубировали в связывающем буфере [Hepes 20 мМ, GDP 3 мкМ, MgCl₂ 10 мМ, NaCl 100 мМ, EDTA 1 мМ, рН=7,4] вместе с оцениваемым соединением (SDF-1 или MKA, представляющее интерес), [³⁵S]GTPγS (0,2-0,4 нМ) и, наконец, бусинами SPA-WGA-PVT (7,3 мг/лунка). Равновесие связывания достигалось через 1 ч при 25°С. После центрифугирования [1000 g в течение 10 мин] измеряли уровень радиоактивности в сцинтилляционном счетчике (TopCount, Perkin Elmer). Рассчитывали IC₅₀ для каждого MKA.

В этих трех экспериментальных условиях ICso гуманизированных (hz) MKA 515Н7, определяемая в клетках NIH3T3/CXCR4, составляла 3,86 нМ для MKA П2515Н7 VH1 D76N VL2 (фиг.30А), 4,05 нМ для MKA hz515H7 VH1 D76N VL2-1 (фиг.30В), 5,19 нМ для MKA hz515H7 VH1 D76N VL2-2 (фиг.30С) и 8,5 нМ для MKA hz515H7 VH1 D76N VL2-3 (фиг.30D).

MKA hz515H7 также были способны к ингибированию [³⁵S]GTPγS-связывания, стимулированного SDF-1 (100 нМ) с % ингибирования 86% для MKA hz515H7 VH1 D76N VL2, 69% для MKA hz515H7 VH1 D76N VL2-1, 66% для MKA hz515H7 VH1 D76N VL2-2 и 58% для MKA hz515H7 VH1 D76N VL2-3 (фиг.31).

Пример 25: Ассоциация CXCR4 с различными участниками взаимодействия: гомо- и гетеродимеризация, привлечение β-аррестина с помощью подхода резонансного переноса энергии биолюминесценции (BRET) и влияние гуманизированных MKA 515Н7 на эти димеры

Этот функциональный анализ позволяет оценить конформационные изменения, вызванные связыванием SDF-1 и/или гуманизированных MKA 515Н7 с рецептором CXCR4 на уровне формирования гомодимера CXCR4 и гетеродимера CXCR2/CXCR4, а также привлечения сигнального белка β-аррестина-2.

Экспрессионные векторы для каждого из исследуемых участников взаимодействия были построены как гибридные белки с соответствующей меткой (люцифераза Renilla reniformis, Rluc, и желтый флуоресцентный белок, YFP) с помощью обычных методик молекулярной биологии. За два дня до проведения BRET-экспериментов клетки НЕК293 временно трансфицировали экспрессионными векторами, кодирующими соответствующих участников BRET: [CXCR4/Rluc+CXCR4/YFP] для изучения гомодимеризации CXCR4, [CXCR4/Rluc+CXCR2:YFP] для изучения гетеродимеризации CXCR4 и CXCR2 и [CXCR4/Rluc+β-arr2:YFP] для изучения CXCR4-опосредованного привлечения β-аррестина-2. На следующий день клетки распределяли в предварительно покрытые полилизином белые 96-луночные микротитровальные планшеты в полной культуральной среде [DMEM с добавлением 10% FBS]. Клетки вначале культивировали при 37°С с 5% CO₂, с тем чтобы клетки прикрепились к планшету. Затем клетки оставляли в 200 мкп DMEM/лунка в течение ночи. Непосредственно перед BRET-экспериментом DMEM удаляли и клетки быстро промывали PBS. Затем клетки инкубировали в PBS в присутствии или в отсутствие антитела, 15 мин при 37°С, а затем добавляли 5 мкМ коэлентеразина Н с или без 100 нМ SDF-1 в конечном объеме 50 мкл. После инкубации в течение еще 5 минут при 37°С, и дополнительной инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре только для гомо- и гетеродимоеров, начинали захват излучаемого света с помощью многофункционального анализатора Mithras LB940 при 485 нм и 530 нм (Berthold) (1 с/длина волны/лунка повторяется 15 раз при комнатной температуре).

Расчет отношения BRET проводили, как описано выше (Angers et al., 2000): [(эмиссия_{530 нм})-(эмиссия_{485 нм})×Cf]/(эмиссия_{485 нм}), где Cf=(эмиссия_{530 нм})/(эмиссия_{485 нм}) для клеток, экспрессирующих только гибридный белок Rluc в тех же экспериментальных условиях. Упрощение этого уравнения показывает, что соотношение BRET соответствует отношению 530/485 нм, полученному, когда присутствуют два участника, скорректированному отношением 530/485 нм, полученным в тех же экспериментальных условиях, когда в анализе присутствует только участник, слитый с Rluc. Для удобочитаемости результаты выражаются в единицах миллиBRET (mbu); mbu соответствует отношению BRET, умноженному на 1000.

SDF1 (100 нМ) увеличивал примерно на 12% сигнал BRET, полученный из-за пространственной близости донорного и акцепторного белков, слитых с рецептором CXCR4, что, вероятно, указывает на формирование гомодимеров CXCR4/CXCR4 или конформационных изменений уже существующих димеров (фиг.32А). Интересно, что SDF1 (100 нМ) уменьшал примерно на 16% сигнал BRET, полученный из-за пространственной близости донорных и акцепторных белков, слитых с CXCR2 и CXCR4, что, вероятно, указывает на формирование гетеродимеров CXCR2/CXCR4 или конформационных изменений уже существующих димеров (фиг.32В). В этом последнем случае SDF-1-активированная конформация CXCR4/CXCR2 представляется менее благоприятной для переноса энергии BRET. В обоих случаях гуманизированные MKA 515Н7 были способны модулировать SDF-1-индуцированные конформационные изменения гомодимеров CXCR4 с процентом ингибирования SDF-1-индуцированного увеличения BRET примерно 88% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2, 65% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2.1, 33% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2.2 и 21% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2.3 (фиг.32А), а также формирование гетеродимеров CXCR2/CXCR4 с процентом ингибирования SDF-1-индуцированного уменьшения BRET примерно 100% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2 и 50% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2.1, hz515H7 VH1D76N-VL2.2 и hz515H7 VH1D76N-VL2.3 (фиг.32В). Гуманизированные MKA 515Н7 сами по себе также способны модулировать пространственную близость CXCR4/CXCR4 и CXCR2/CXCR4 соответственно, что указывает на влияние этих MKA на конформацию и гомодимера CXCR4/CXCR4, и гетеродимера CXCR2/CXCR4 (фиг.32А и 32В).

Активация CXCR4 с помощью SDF-1 (100 нМ) привела к мощному привлечению внутриклеточных сигнальных молекул р-аррестина, о чем говорит повышение BRET-сигнала на 390% (фиг.32С). Это привлечение частично ингибировалось гуманизированными MKA 515Н7 с процентом ингибирования примерно 94% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2, 81% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2.1, 82% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2.2 и 71% для MKA hz515H7 VH1D76N-VL2.3 (фиг.32С), показывая влияние этих MKA на передачу сигнала.

Пример 26: Иммуногистохимические исследования (IHC)

Срезы депарафинизировали, регидратировали и помещали на 7 минут в предварительно нагретую до 98°С EDTA с рН 8 для индуцированного теплом восстановления эпитопа. После трех промываний в Трио-буферном растворе с 0,05% Tween-20 (TBS-T) (Dako S3006) эндогенную пероксидазную активность блокировали с помощью реагента Peroxidase Blocking Reagent (Dako K4007) в течение 5 минут. Срезы промывали TBS-T и инкубировали в блокирующем реагенте (UltraV block-TA-125UB- LabVision) в течение 5 минут до инкубации с мышиным моноклональным анти-СХСР-4-антителом (50 мкг/мл, клон 515Н7, Pierre Fabre) или мышиным IgG1/каппа (50 мкг/мл, Х0931, Dako) в качестве контроля в течение ночи при 4°С. Срезы промывали TBS-T и инкубировали с Envision Dual Link в течение 1 часа при комнатной температуре. Диаминобензидин использовали для развития коричневой окраски реакции (Dako K3468). Срезы погружали в гематоксилин на 4 минуты для контрастирующего окрашивания (Dako S3309) и промывали в PBS перед помещением в гистологическую среду Paramount и покрыванием покровным стеклом. В этой иммуногистохимической процедуре коричневый продукт реакции коррелирует с положительным окрашиванием клеточной мембраны, а отсутствие коричневого продукта реакции коррелирует с отрицательной окраской и отсутствием визуализации клеточной мембраны.

Мышиное моноклональное анти-CXCR4 антитело, клон 515Н7, дифференциально окрашивает клеточную мембрану различных типов опухолей. Фиг.33 и 34 иллюстрируют окрашивание, полученное на двух ксенотрансплантатных моделях, на которых была описана противоопухолевая активность для 515Н7: RAMOS и KARPAS299. Как показано на фиг.33 и 34, полученное окрашивание зависело от фиксатора. Действительно, мембранное окрашивания было слабее, когда ткани фиксировали формалином (фиг.34А и 34С), в то время как при использовании Glyo-Fixx (замена формалину) мембранное окрашивание значительно усиливалось (фиг.33А и 33С).

Пример 27: Конкурентное связывание гуманизированных анти-CXCR4-MKA 515Н7 с [¹²⁵I]SDF-I на мембранах CHO-K1, стабильно экспрессирующих человеческий рецептор CXCR4

Этот анализ позволяет оценить способность гуманизированных MKA 515Н7 конкурировать за связывание меченого радиоактивной меткой [¹²⁵I]SDF-1 с человеческим рецептором CXCR4 либо на ортостерических, либо на аллостерических сайтах связывания.

Клетки CHO-K1, стабильно и конститутивно экспрессирующие человеческий рецептор CXCR4, были получены при трансфекции наивных клеток CHO-K1 (АТСС CCL-61) вектором для экспрессии в клетках млекопитающих, несущим всю кодирующую последовательность человеческого рецептора CXCR4 (RefSeq NM_003467). Клетки размножались в полной культуральной среде [DMEM-Хэма Р12 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) и 500 мкг/мл генетицина]. Эксперименты со связыванием радиолиганда проводили на клеточных мембранах, полученных при механическом разрушении клеток CHO/CXCR4 в литическом буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, NaCl 150 мМ] и последующем центрифугировании (10000 g, 15 мин). [¹²⁵I]SDF-1-связывание (специфическая активность: 1500 Ки/ммоль) проводили с использованием методики SPA (сцинтилляционный анализ сближения - GE Healthcare). Вкратце, клеточные мембраны (30 мкг/лунка) инкубировали в связывающем буфере [Hepes 20 мМ, рН 7,4, CaCl₂ 1 мМ, MgCl₂ 5 мМ, NaCl 150 мМ, BSA 1%] вместе с оцениваемым соединением (SDF-1 или MKA), радиолигандом (1 нМ) и, наконец, бусинами SPA-WGA-PVT (7,3 мг/лунка). Равновесие связывания достигалось через 1 ч при 25°С. После центрифугирования [1000 g в течение 10 мин] измеряли уровень радиоактивности в сцинтилляционном счетчике (TopCount, Perkin Elmer). Неспецифическое связывание оценивали в присутствии 10 мкМ немеченного SDF-1.

Анти-CXCR4-MKA эффективно конкурировали за [¹²⁵I]SDF-1-связывание со следующим порядком ранжирования эффективности конкуренции (% ингибирования [¹²⁵I]SDF-1): hz515H7 VH1D76N VL2 (77%), hz515H7 VH1D76N VL2.1 (68%), hz515H7 VH1D76N VL2.2 (61%) и hz515H7 VH1D76N VL2.3 (49%) (фиг.35А).

MKA Hz515H7 не зависимо от дозы ингибировали [¹²⁵I]SDF-1-связывание со значением IC₅₀ 1,44 нМ для MKA hz515H7 VH1D76N VL2 (фиг.35 В), 6,69 нМ для MKA hz515H7 VH1D76N VL2.1 (фиг.35С), 5,91 нМ для MKA hz515H7 VH1D76N VL2.2 (фиг.35D).

Пример 28: CXCR4-рецептор-опосредованная мобилизация внутриклеточных депо кальция

Этот функциональный анализ был предназначен для наблюдения за CXCR4-рецепторной передачей сигнала через стимуляцию пути фосфолипазы С, вызывающей высвобождение кальция из внутриклеточных депо в эндоплазматическом ретикулуме.

Клетки U937 (человеческая лимфома) размножались в полной культуральной среде [RPMI 1640 с добавлением 10% FCS, 20 мМ HEPES, 1% заменимых аминокислот, 1% пирувата натрия, 1% L-глутамина, 4,5 г/л глюкозы]. Клетки высевали в черные 96-луночные микротитровальные планшеты с плотностью 100000 клеток/лунка в соответствующей культуральной среде и оставляли на ночь перед проведением экспериментов. Клетки нагружали флуоресцентной кальциевой меткой (Fluo-4 No Wash, Invitrogen, США) в загрузочном буфере [HBSS 1×, HEPES 20 мМ, кислота пробенецид 25 мМ] в течение 30 мин при 37°С, затем 30 мин при 25°С. Стимуляцию SDF-1 выполняли путем прямого введения в каждую лунку. Для антагонистических экспериментов 10 мкл раствора MKA добавляли непосредственно в загрузочный буфер по меньшей мере за 10 мин до SDF-1. Кинетические измерения флуоресценции выполняли на многорежимном планшетном флуоресцентном анализаторе Mithras LB940 (Berthold), используя следующие параметры: возбуждение при 485 нм, излучение при 535 нм, энергия возбуждения 10000 условных единиц. Флуоресценцию в каждой лунке регистрировали в течение 0,1 секунды каждую секунду и в течение 20 сек до введения SDF-1 (базальный сигнал). Затем вводили 20 мкл SDF-1 и записывали данные в течение 2 мин. Каждое экспериментальное условие повторяли дважды. Значения в каждой лунке вначале корректировали путем вычитания базальной флуоресценции и флуоресценции, испускаемой контрольной лункой без клеток. Относительные данные выражали в процентах от максимальной стимуляции, полученной SDF-1 (100 нМ).

SDF1 (100 нМ) индуцировал быстрый и сильный выход внутриклеточного кальция в U-937. Максимальная интенсивность достигала >340% по сравнению с базальной флуоресценцией и наблюдалась примерно 40 сек при стимуляции SDF-1. MKA hz515H7 VH1D76N VL2 (133 нМ) давало частичное ингибирование SDF-1 (100 нМ)-индуцированного кальциевого сигнала в клеточной линии U-937 (фиг.36, где указанное MKA обозначено просто как hz515H7VL2 в легенде).

Пример 29: Влияние гуманизированного анти-CXCR4-MKA hz515H7 на SDF-1-индуцированную миграцию клеток U937

Для оценки ингибирующего влияния гуманизированного анти-CXCR4-MKA hz515H7 VH1D76N VL2 (обозначаемого как hz515H7) на процесс миграции, клетки U-937 с 10 мкг/мл антител в течение 40 мин в среде RPMI 1640 с добавлением 2% FCS при 37°С с 5% CO₂. Общее число 5×10⁴ клеток помещали в верхнюю часть миграционной камеры (Corning Lowell, Corning Lowell, Массачусетс, США). В нижнюю камеру помещали SDF-1 (100 нг/мл) в среде с добавлением 2% FCS. Миграцию клеток U-937 оценивали путем подсчета числа клеток, мигрировавших из миграционных камер через два часа после посева клеток в вверхнюю камеру. Мигрировавшие клетки подсчитывали с помощью анализа CeIITiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, измеряя число жизнеспособных клеток в культуре на основании количественной оценки АТФ.

Результаты, представленные на фиг.37А, показали, что, как и ожидалось, SDF-1 мог вызывать значительное увеличение миграции клеток U-937. Влияния не наблюдалось, когда клетки инкубировали с изотипическим контролем IgG1. Напротив, фиг.37А показывает ингибирование SDF-1-индуцированной миграции клеток U937 10 мкг/мл моноклонального антитела hz515H7 VH1 D76N VL2. Результаты представляют собой средние значения +/- SD (среднеквадратичное отклонение) из трех независимых экспериментов, проведенных в трех экземплярах.

Фиг.37 В представляет влияние диапазона доз MKA hz515H7 VH1 D76N VL2 на SDF-1-индуцированную миграцию клеток. Результаты представляют собой средние значения +/- SEM (стандартная ошибка среднего) из четырех независимых экспериментов (IC₅₀=4,53 10^-3 мкг/мл +/- 2,2 10^-3).

Пример 30: Иммуногистохимические исследования (IHC) с hz515H7 VH1 D76N VL2

Срезы депарафинизировали, регидратировали и помещали на 7 минут в предварительно нагретую до 98°С EDTA с рН 8 для индуцированного теплом восстановления эпитопов. После трех промываний в Трис-буферном растворе с 0,05% Tween-20 (TBS-T) (Dako S3006) эндогенную пероксидазную активность блокировали с помощью реагента Peroxidase Blocking Reagent (Dako K4007) в течение 5 минут. Срезы промывали TBS-T и инкубировали в блокирующем реагенте (UltraV block-TA-125UB- LabVision) в течение 5 минут до инкубации с биотинилированным гуманизированным моноклональным анти-CXCR-4-антителом (50 мкг/мл, hz515H7 VH1 D76N VL2, Pierre Fabre) или биотинилированным человеческим IgG1 (50 мкг/мл, ВР078, The Binding Site) в качестве изотипического контроля в течение ночи при 4°С. Срезы промывали TBS-T и инкубировали с конъюгатом стрептовидин - пероксидаза хрена в течение 1 часа при комнатной температуре. Диаминобензидин использовали для развития коричневой окраски реакции (Dako K3468). Срезы погружали в гематоксилин на 4 минуты для контрастирующего окрашивания (Dako S3309) и промывали в PBS перед помещением в гистологическую среду Paramount и покрыванием покровным стеклом. В этой иммуногистохимической процедуре коричневый продукт реакции коррелирует с положительным окрашиванием клеточной мембраны, а отсутствие коричневого продукта реакции коррелирует с отрицательной окраской и отсутствием визуализации клеточной мембраны.

Биотинилированное гуманизированное анти-CXCR4-антитело 515Н7 VH1 D76N VL2 дифференциально окрашивает клеточную мембрану различных типов опухолей. Фиг.38 и 39 иллюстрируют окрашивание, полученное на двух ксенотрансплантатных моделях, на которых была описана противоопухолевая активность для 515Н7: RAMOS и KARPAS299. Как показано на фиг.38 и 39, полученное окрашивание зависело от фиксатора. Действительно, мембранное окрашивания было слабее, когда ткани фиксировали формалином (фиг.39А и 39С), в то время как при использовании Glyo-Fixx (замена формалину) мембранное окрашивание значительно усиливалось (фиг.38А и 38С).

Пример 31: Влияние химерных 515Н7 (с515Н7), гуманизированных форм MKA hz515H7 VH1 D76N VL2 и hz515H7 VH1 D76N VL2.1 на рост В-клеточной ксенотрансплантатной опухоли Ramos у мышей Scid

Клетки RAMOS из АТСС стандартным образом культивировали в среде RPMI 1640, 10% FCS и 2 мМ L-Glu (Sigma, Сент-Луис, Мэриленд, США). Клетки разделяли за 48 часов до введения трансплантата, так что они находились в экспоненциальной фазе роста. Десять миллионов клеток RAMOS в PBS прививали подкожно 7-недельным самкам мышей Scid (Charles River, Франция). Через пять дней после имплантации опухоли измеряли (в среднем 100 мм³) и животных разделяли на группы по 6 мышей с сопоставимым размером опухоли. Мышам вводили внутрибрюшинно (i.p.) нагрузочную дозу 2 мг/мышь MKA с515Н7, hz515H7 VH1 D76N VL2 или hz515H7 VH1 D76N VL2.1. Затем мышам инъекционно вводили 1 мг/доза/мышь MKA с515Н7, hz515H7 VH1D76N VL2 или hz515H7 VH1 D76N VL2.1 два раза в неделю. Группа PBS в этом эксперименте была введена в качестве контрольной группы. Объем опухоли измеряли два раза в неделю и рассчитывали по формуле: π/6×длина×ширина×высота. Статистический анализ проводили для каждого измерения с помощью критерия Манна-Уитни.

В этих экспериментах во время лечения смертности не наблюдалось. По сравнению с группой PBS наблюдалось значительное ингибирование роста опухоли между 11 и 54 днями для 1 мг/доза MKA с515Н7 (фиг.40), MKA hz515H7 VH1 D76N VL2 (фиг.41), и hz515H7 VH1 D76N VL2.1 (фиг.42), а средний объем опухоли через 4 недели лечения уменьшился на 92% для мышей, получавших MKA с515Н7 и hz515H7, по сравнению с группой, получавшей PBS.

Изобретения относятся к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая гуманизированное антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент, способные специфически связываться с CXCR4, способ получения вышеуказанного антитела или его производного соединения или его функционального фрагмента, выделенная нуклеиновая кислота, вектор и клетка-хозяин млекопитающего, для получения вышеуказанного антитела или его производного соединения или его функционального фрагмента, фармацевтическая композиция, проявляющая активность специфического связывания с CXCR4, способ обнаружения in vitro присутствия CXCR4-экспрессирующей опухоли и набор для in vitro детекции CXCR4. В одном варианте антитело содержит CDR-H1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID №4, CDR-H2 с SEQ ID №5, CDR-H3 с SEQ ID №6, CDR-L1 с SEQ ID №7, CDR-L2 с SEQ ID №8, CDR-L3 с SEQ ID №9. Изобретение расширяет арсенал антител, связывающихся с CXCR4. 8 н. и 12 з.п ф-лы, 76 ил, 10 табл, 31 пр.

1. Гуманизированное антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент, способные специфически связываться с CXCR4, которые характеризуются тем, что указанное гуманизированное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент содержат тяжелую и легкую цепи, при этом указанная тяжелая цепь имеет CDR, состоящие из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, а указанная легкая цепь имеет CDR, состоящие из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где указанные CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 содержат соответственно последовательности SEQ ID №№4, 5 и 6, а указанные CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат соответственно последовательности SEQ ID №№7, 8 и 9.

2. Гуманизированное антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент по п.1, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№10, 11, 12, 13, 85 или 87, и вариабельную область легкой цепи с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 86 или 88.

3. Гуманизированное антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент по п.1, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№21, 22, 23, 24, 89 или 91, и легкую цепь с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №№25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 90 или 92.

4. Гуманизированное антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент по п.1, выбранные из группы, состоящей из:
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что включают вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №16;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №27;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №17;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №28;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №18;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №29;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №19;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №30;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №12 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №14;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №23 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №25;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №12 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №15;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №23 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №26;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №10 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №14;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №21 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №25;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №10 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №21 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №11 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №22 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №12 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №23 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №13 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №88;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №24 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №92;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с.последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №14;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №25;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №15;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №26;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №16;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №27;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №17;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №28;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №18;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №29;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №19;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №30;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №87 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID №20;
- гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, которые характеризуются тем, что содержат тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID №91 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID №31.

5. Гуманизированное антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент по любому из пп.1-4 для применения в качестве лекарственного средства.

6. Гуманизированное антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент по любому из пп.1-4 для профилактики или лечения рака.

7. Гуманизированное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент по п.6, которые характеризуются тем, что указанный рак выбран среди рака предстательной железы, остеосаркомы, рака легкого, рака молочной железы, рака эндометрия, множественной миеломы, рака яичников, рака поджелудочной железы и рака толстой кишки.

8. Выделенная нуклеиновая кислота для получения антитела к CXCR-4 или его производного или функционального фрагмента, которая характеризуется тем, что она выбрана среди следующих нуклеиновых кислот:
а) нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, кодирующей гуманизированное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент по любому из пп.1-4;
б) нуклеиновой кислоты длиной не менее 18 нуклеотидов, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости по меньшей мере с одним из трех CDR тяжелой цепи, содержащей нуклеиновокислотные последовательности SEQ ID №№38-41, 49-52, 93 или 95; и
в) нуклеиновой кислоты длиной не менее 18 нуклеотидов, способной к гибридизации в условиях высокой жесткости по меньшей мере с одним из трех CDR легкой цепи, содержащей нуклеиновокислотные последовательности SEQ ID №№42-48, 53-59, 94 или 96.

9.Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, содержащая нуклеиновокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
- нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит CDR-H1 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №32, CDR-H2 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №33 и CDR-H3 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №34;
- нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит CDR-L1 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №35 или 60, CDR-L2 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №36 или 61 и CDR-L3 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №37 или 62; и
- нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, при этом
i) указанная нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи содержит CDR-H1 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №32, CDR-H2 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №33 и CDR-H3 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №34; а также
ii) указанная нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи содержит CDR-L1 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №35 или 60, CDR-L2 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №36 или 61 и CDR-L3 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID №37 или 62.

10. Вектор для получения антитела к CXCR-4 или его производного или функционального фрагмента, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.8 и 9.

11. Клетка-хозяин млекопитающего для получения антитела к CXCR-4 или его производного или функционального фрагмента, содержащая вектор по п.10.

12. Способ получения гуманизированного антитела или его производного соединения или функционального фрагмента, характеризующийся тем, что включает следующие этапы:
- культивирование в среде и подходящих культуральных условиях клетки-хозяина по п.11; и
- выделение указанного антитела или одного из его функциональных фрагментов, и его получение, таким образом, из культуральной среды или из указанных культуральных клеток.

13. Фармацевтическая композиция, проявляющая активность специфицеского связывания с CXCR4, содержащая эффективное количество гуманизированного антитела, его производного соединения или функционального фрагмента по любому из пп.1-4.

14. Фармацевтическая композиция по п.13, которая характеризуется тем, что она в качестве комбинированного продукта для одновременного, раздельного или расширенного применения содержит кроме того противоопухолевое антитело, отличное от антитела, направленного против CXCR4.

15. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13 или 14, которая характеризуется тем, что она в качестве комбинированного или конъюгированного продукта для одновременного, раздельного или расширенного применения содержит кроме того цитотоксический/цитостатический агент, клеточный токсин и/или радиоизотоп.

16.Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-15 для применения в качестве лекарственного средства.

17. Фармацевтическая композиция по любому из пп.13-16 для профилактики или лечения рака.

18. Фармацевтическая композиция по п.17, которая характеризуется тем, что указанный рак выбран среди рака предстательной железы, остеосаркомы, рака легкого, рака молочной железы, рака эндометрия, множественной миеломы, рака яичников, рака поджелудочной железы и рака толстой кишки.

19.Способ обнаружения in vitro присутствия CXCR4-экспрессирующей опухоли у субъекта, где указанный процесс включает следующие этапы:
(а) контактирование образца от субъекта с гуманизированным антителом или его производным соединением или функциональным фрагментом по любому из пп.1-4; и
(б) выявление связывания указанного антитела с образцом.

20. Набор для in vitro детекции CXCR4, включающий по меньшей мере гуманизированное антитело или его производное соединение или функциональный фрагмент по любому из пп.1-4 и контейнер, при этом указанное антитело предпочтительно является меченым.