НОВОЕ АНТИТЕЛО К CXCR4 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ РАКА Российский патент 2017 года по МПК C07K16/28 

Настоящее изобретение относится к области прогнозирования и/или диагностики и/или мониторинга терапии пролиферативных заболеваний у пациента. Конкретнее, изобретение относится к антителу, способному к специфическому связыванию с CXCR4, как к аминокислотной последовательности, так и к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данное антитело. Аналогичным образом, изобретение включает в себя применение указанного антитела и соответствующие способы выявления и диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных нарушений, связанных с гиперэкспрессией CXCR4. В определенных вариантах осуществления изобретения, нарушения представляют собой онкогенные нарушения, связанные с повышенной по сравнению с нормой экспрессией CXCR4, или любую другую патологию, связанную с гиперэкспрессией CXCR4. Изобретение, наконец, включает продукты, и/или композиции, или наборы, включающие по меньшей мере такое антитело для прогнозирования, или диагностики, или мониторинга терапии определенных раков.

Хемокины представляют собой небольшие секретируемые пептиды, которые контролируют миграцию лейкоцитов по химическому градиенту лиганда, известному как хемокиновый градиент, особенно в ходе иммунных реакций (Zlotnick А. и соавт., 2000). Они разделяются на два больших подсемейства, СС и СХС, на основании положения их NH₂-концевых цистеиновых остатков, и связываются с рецепторами, сопряженными с G-белком, два больших подсемейства которых называются CCR и CXCR. К настоящему времени открыто более 50 хемокинов человека и 18 хемокиновых рецепторов.

Многие раки имеют сложную хемокиновую сеть, которая влияет как на инфильтрацию опухоли иммунными клетками, так и на рост опухолевых клеток, выживаемость, миграцию и ангиогенез. Иммунные клетки, эндотелиальные клетки и опухолевые клетки сами по себе экспрессируют хемокиновые рецепторы и могут отвечать на градиент хемокинов. Исследования биоптатов человеческого рака и мышиных моделей рака показывают, что экспрессия хемокиновых рецепторов раковыми клетками связана с повышением способности к метастазированию. Злокачественные клетки раков различных типов имеют различные профили экспрессии хемокиновых рецепторов, однако хемокиновый рецептор 4 является наиболее часто обнаруживаемым. Рецептор CXCR4 экспрессируют клетки 23 различных типов раков человека эпителиального, мезентериального и гемопоэтического происхождения (Balkwill Р. и соавт., 2004).

Хемокиновый рецептор 4 (также известный как фузин, CD184, LESTR или HUMSTR) существует в двух изоформах, включающих 352 или 360 аминокислот. Изоформа А имеет аминокислотную последовательность, описанную под номером доступа Genbank NP_001008540, тогда как изоформа В имеет аминокислотную последовательность, описанную под номером доступа Genbank NP_003458. Остаток Asn¹¹ является гликозилированным, остаток Tyr²¹ является модифицированным путем добавления сульфатной группы и Cys¹⁰⁹ и Cys¹⁸⁶ представляют собой связь (дисульфидный мостик) с экстрацеллюлярной частью рецептора (Juarez J. и соавт., 2004). Данный рецептор экспрессируется различными видами нормальных тканей, наивными, не имеющими памяти Т-клетками, регуляторными Т-клетками, В-клетками, нейтрофилами, эндотелиальными клетками, первичными моноцитами, дендроцитами, N-киллерами, CD34⁺-гемопоэтическими стволовыми клетками и, в меньших количествах, - в сердце, толстой кишке, печени, почках и головном мозге. CXCR4 играет ключевую роль в миграции лейкоцитов, В-клеточном лимфопоэзе и миелопоэзе.

Рецептор CXCR4 гиперэкспрессируется в большом числе раков, включая (без ограничения) лимфому, лейкемию, множественную миелому, рак толстой кишки (Ottaiano А. и соавт., 2004), рак груди (Kato М. и соавт., 2003), рак предстательной железы (Sun Y.X. и соавт., 2003), рак легких [мелкоклеточная и немелкоклеточная карцинома (Phillips R.J. и соавт., 2003)], рак яичника (Scotton C.J. и соавт., 2002), рак поджелудочной железы (Koshiba Т. и соавт., 2000), рак почек, рак головного мозга (Barbero S. и соавт., 2002), глиобластомы и лимфомы. Уникальный лиганд рецептора CXCR4, описанный к настоящему времени, представляет собой фактор стромальных клеток-1 (SDF-1) или CXCL12. SDF-1 секретируется в больших количествах в лимфоузлах, костном мозге, печени, легких и, в меньших количествах, в почках, головном мозге и в коже. CXCR4 также распознается антагонистическим хемокином, вирусным макрофагальным воспалительным белком II (vMIP-II), кодируемым человеческим вирусом герпеса III типа.

Ось CXCR4/SDF-1 играет ключевую роль в раке и непосредственно влечет за собой миграцию и инвазию, приводящие к метастазам. Действительно, раковые клетки, экспрессирующие рецептор CXCR4, мигрируют и поступают в системный кровоток. Затем раковые клетки задерживаются в сосудистом ложе органов, продуцирующих высокие уровни SDF-1, где они пролиферируют, индуцируют ангиогенез и образуют метастатические опухоли (Murphy PM., 2001). Эта ось также участвует в клеточной пролиферации через активацию киназы, регулируемой внеклеточными сигналами (Barbero S. и соавт., 2003), и в ангиогенезе (Romagnani P., 2004). Действительно, рецептор CXCR4 и его лиганд SDF-1 отчетливо стимулируют экспрессию VEGF-A, который, в свою очередь, усиливает экспрессию CXCR4/SDF-1 (Bachelder R.E. и соавт., 2002). Также известно, что опухоль-связанные макрофаги (ТАМ) аккумулируются в гипоксических областях опухоли и стимулируются к взаимодействию с опухолевыми клетками, что стимулирует ангиогенез. Обнаружили, что гипоксия активировала селективную экспрессию CXCR4 в различных типах клеток, включая опухоль-связанные макрофаги (Mantovani А. и соавт., 2004). Недавно продемонстрировали, что ось CXCR4/SDF-1 регулирует миграцию и хоуминг CXCR4⁺-гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSC) и может играть роль в неоваскуляризации. Фактические данные показывают, что, помимо гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, функциональный CXCR4 также экспрессируется в стволовых клетках из других тканей (тканевые стволовые клетки, TCSC), таким образом, SDF-1 может играть решающую роль в хемоаттракции CXCR4-позитивных тканевых стволовых клеток, необходимых для регенерации органов/тканей, однако эти тканевые стволовые клетки также могут быть исходной точкой развития рака (теория раковых стволовых клеток). Происхождение рака из стволовых клеток продемонстрировали для человеческой лейкемии и недавно для некоторых солидных опухолей, таких как опухоли головного мозга и груди. Есть несколько примеров позитивных по CXCR4 опухолей, которые могут происходить из нормальных CXCR4-позитивных ткане- или органоспецифичных стволовых клеток, такие как лейкемии, опухоли головного мозга, мелкоклеточный рак легких, рак груди, гепатобластома, рак яичника и рак шейки матки (Kucia М. и соавт., 2005).

Направленное действие на раковые метастазы путем блокирования рецепторов CXCR4 было продемонстрировано in vivo с применением моноклональных антител, направленных против рецептора CXCR4 (Muller А. и соавт., 2001). Коротко говоря, показали, что моноклональное антитело, направленное против рецептора CXCR4 (Mab 173 R&D Systems), существенно уменьшало число метастазов в лимфатические узлы в ортотопической модели рака груди (MDA-MB231) у мышей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью. Другое исследование (Phillips R.J и соавт., 2003) также показало критическую роль оси SDF-1/CXCR4 в метастазах на ортотопической модели карциномы легких (А549) с применением поликлональных антител против SDF-1, однако в этом исследовании не проявлялся ни эффект опухолевого роста, ни ангиогенез. Некоторые другие исследования также описывают ингибирование как метастазирования in vivo с применением миРНК-дуплексов CXCR4 (Liang Z. и соавт., 2005), биостабильных пептидных антагонистов CXCR4 (Tamamura H. и соавт., 2003), так и опухолевого роста in vivo с применением малых молекул-антагонистов CXCR4, таких как AMD 3100 (Rubin J.B. и соавт., 2003; De Faico V. и соавт., 2007) или моноклональных антител (патент WO 2004/059285 A2). Таким образом, CXCR4 представляет собой признанную терапевтическую мишень для рака.

Хемокиновый рецептор 2 (CXCR2), другой хемокиновый рецептор, также описан как целевая мишень в онкологии. Действительно, CXCR2 передает аутокринный сигнал клеточного роста в некоторых типах опухолевых клеток, а также может действовать на рост опухоли опосредованно, стимулируя ангиогенез (Tanaka Т. и соавт., 2005).

Хемокиновый рецептор CXCR2 содержит 360 аминокислот. Он экспрессируется преимущественно в эндотелиальных клетках и особенно при неоваскуляризации. Несколько хемокинов связывают рецептор CXCR2, а именно, CXCL5, -6, -7, IL-8, GRO-α, -β и γ. которые принадлежат к ERL⁺-проангиогенным хемокинам. Рецептор CXCR2 обладает гомологией последовательности с рецептором CXCR4 (37% идентичность последовательности и 48% гомология последовательности). Ось CXCR2/лиганды вовлечена в некоторые механизмы опухолевого роста, такие как метастазирование (Singh RK. и соавт., 199), клеточная пролиферация (Owen J.D. и соавт., 1997) и ERL⁺-хемокин-опосредованный ангиогенез (Stricter R.M. и соавт., 2004; Romagnani и соавт., 2004). Наконец, опухоль-связанные макрофаги и нейтрофилы являются ключевыми элементами индуцированного воспалением опухолевого роста, а хемокины, такие как CXCL5, интерлейкин-8 и GRO-α, инициируют рекрутинг нейтрофилов.

Димеризация стала универсальным механизмом регуляции функции рецепторов, сопряженных с G-белком, к которым относятся хемокиновые рецепторы (Wang J. и Norcross M., 2008). Гомо- и гетеродимеризация в ответ на связывание хемокинов, как было показано, требуются для инициации и изменения передачи сигналов многими хемокиновыми рецепторами. Растущее число фактов подтверждает гипотезу о том, что димеры или олигомеры рецепторов, возможно, являются основной функциональной единицей хемокиновых рецепторов. Димеры хемокиновых рецепторов, как обнаружили, свободны от лигандов, и хемокины индуцируют конформационные изменения димеров рецепторов. Как известно, CXCR4 образует гомодимеры, но также и гетеродимеры, например, с 5-опиоидным рецептором (DOR) (Hereld D., 2008) или с CCR2 (Percherancier Y. и соавт., 2005). В последнем примере пептиды, являющиеся производными трансмембранных доменов CXCR4, ингибировали активацию, блокируя лиганд-индуцированные конформационные переходы димеров (Percherancier Y. и соавт., 2005). Другое исследование показало, что пептид CXCR4-TM4, синтетический пептид трансмембранного региона CXCR4, уменьшает энергию перехода между промоторами гомодимеров CXCR4 и ингибирует SDF-1-индуцированную миграцию и полимеризацию актина в злокачественных клетках (Wang J. и соавт., 2006). Совсем недавно также было описано, что CXCR7 образует функциональные гетеродимеры с CXCR4 и усиливает SDF-1-индуцированную передачу сигналов (Sierro F. и соавт., 2007). Другие примеры конститутивных гетеродимеров включают исследования, показывающие, что CXCR1 и CXCR2 взаимодействуют, также образуя соответствующие гомодимеры. Ни для одного из них не было отмечено взаимодействия с другим GPCR (α1А-адренорецептор), что показывает специфичность взаимодействия CXCR1 и CXCR2 (Wilson S. и соавт., 2005).

Как указывалось ранее, рецепторы CXCR4 и CXCR2 представляют собой интересные опухолевые мишени. Блокирование этих рецепторов позволяет ингибировать рост опухоли и метастазирование очень эффективным образом, с уменьшением пролиферации опухолевых клеток, ангиогенеза, миграции и инвазии опухолевых клеток, рекрутинга нейтрофилов и макрофагов опухолями и с ингибированием CXCR4-позитивных раковых стволовых клеток.

Заявитель уже раскрывал моноклональные антитела, обозначаемые как 515H7 и 414Н5, которые связывают и индуцируют конформационные изменения как гомодимеров CXCR4/CXCR4, так и гетеродимеров CXCR4/CXCR2 и обладают высокой противоопухолевой активностью (см. WO 2010/037831).

Настоящее изобретение ставит своей целью обеспечить по меньшей мере один реагент, который может применяться как диагностический и прогностический инструмент для выявления и/или мониторинга онкогенных нарушений, особенно тех, которые отличаются экспрессией CXCR4 или опосредованы аномальной экспрессией CXCR4. В особенности изобретение обеспечивает новое выделенное антитело, способное к связыванию с CXCR4, которое может применяться для диагностических или прогностических целей.

Неожиданно, в отличие от антител из предшествующего уровня техники, заявитель синтезировал настоящее антитело, способное специфически связываться с CXCR4, экспрессируемым как мономер CXCR4 или как гомодимер CXCR4/CXCR4. С другой стороны, антитело согласно изобретению существенно не связывается с каким-либо из известных гетеродимеров CXCR4/X и, конкретнее, не связывается, в частности, с гетеродимером CXCR4/CXCR2. Как будет обсуждаться ниже в настоящем описании, это свойство представляет большой интерес для целей диагностики. Другие особенности и преимущества изобретения будут видны из подробного описания и примеров, которые приводятся ниже.

В первом аспекте изобретение относится к выделенному антителу, или его антигенсвязывающему фрагменту, или производному, которые с высокой аффинностью связываются с CXCR4, предпочтительно, с человеческим CXCR4, и таким образом могут быть полезны для диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных нарушений, опосредованных экспрессией CXCR4.

Другие особенности и преимущества изобретения будут видны из подробного описания и примеров, которые приводятся ниже.

Предпочтительно, изобретение включает антитела, их производные соединения и их функциональные фрагменты согласно настоящему изобретению, полученные геннорекомбинантным способом или путем химического синтеза.

В первом варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению представляет собой моноклональное антитело.

Под "моноклональным антителом" понимают антитело, происходящее из практически однородной популяции антител. Конкретнее, индивидуальные антитела в популяции являются идентичными, за исключением некоторых возможных природных мутаций, которые могут обнаруживаться в минимальных пропорциях. Иными словами, моноклональные антитела включают в себя однородные антитела, возникающие в результате размножения одного клона клеток (например, гибридомы, эукариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело, прокариотической клетки-хозяина, трансфицированной молекулой ДНК, кодирующей однородное антитело, и. т.д.), и в целом отличаются тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела являются высоко специфичными и направленными против одного антигена. Вдобавок, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые, в типичном случае, включают различные антитела против различных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное тело направлено против одного эпитопа антигена. Типичное антитело IgG образовано двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями, которые соединены с помощью дисульфидных связей. Каждая тяжелая и легкая цепь содержат константный регион и вариабельный регион. Каждый вариабельный регион содержит три сегмента, называющиеся "регионы, определяющие комплементарность" ("CDRs") или "гипервариабельные регионы", которые в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Они обычно обозначаются как CDR1, CDR2 и CDR3 (нумеруются последовательно с N-конца). Более высоко консервативные части вариабельных регионов называются "каркасные области".

Существуют три региона, определяющих комплементарность тяжелой цепи и три региона, определяющих комплементарность легкой цепи. Термин "регион, определяющий комплементарность" или "регионы, определяющие комплементарность" используется здесь с целью указать, в зависимости от случая, один, или несколько, или даже все эти регионы, которые содержат большую часть аминокислотных остатков, ответственных за связывание аффинностью антитела с антигеном или эпитопом, которые оно распознает.

Согласно изобретению, регионы, определяющие комплементарность антитела, определяют согласно нумерации IMGT. Для человека, квалифицированного в данной области, очевидно, как вывести из определяющих комплементарность регионов по IMGT определяющие комплементарность регионы согласно Кэбботу. Определяющие комплементарность регионы согласно Кэбботу должны рассматриваться как часть объема изобретения.

Уникальная нумерация IMGT была определена для сравнения вариабельных доменов вне зависимости от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, С., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. В уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одну и ту же позицию, например, цистеин - 23 (1-й Cys), триптофан - 41 (консервативный Trp), гидрофобная аминокислота - 89, цистеин - 104 (2-й Cys), фенилаланин или триптофан - 118 (J-Phe или J-Trp). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизованное разграничение каркасных регионов (FR1-IMGT: позиции с 1 по 26, FR2-IMGT: с 39 по 55, FR3-IMGT: с 66 по 104 и FR4-IMGT: с 118 по 128) и регионов, определяющих комплементарность (CDR1-IMGT: с 27 по 38, CDR2-IMGT: с 56 по 65 и CDR3-IMGT: с 105 по 117). Поскольку разрывы [гэпы] представляют собой незанятые позиции, длина регионов, определяющих комплементарность по IMGT (показанная в квадратных скобках и разделенная точками, например, [8.8.13]), становится ключевой информацией. Уникальная нумерация IMGT применяется в двухмерных графических представлениях, называемых "жемчужные нити" [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в трехмерных структурах IMGT/базах данных трехмерных структур [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Т cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное включает по меньшей мере один регион, определяющий комплементарность (CDR), имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы аминокислотных последовательностей SEQ ID NOs. 1-6, или по меньшей мере один CDR, последовательность которого после оптимального выравнивания имеет по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичность последовательностям SEQ ID NOs 1-6.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению включает: i) тяжелую цепь, включающую по меньшей мере один из следующих: CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, как определено согласно нумерационной системе IMGT, где CDR-H1 включает последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2 включает последовательность SEQ ID No. 2 и CDR-H3 включает последовательность SEQ ID No. 3; и/или ii) легкую цепь, включающую по меньшей мере один из следующих: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, как определено согласно нумерационной системе IMGT, где CDR-L1 включает последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2 включает последовательность SEQ ID No. 5 и CDR-L3 включает последовательность SEQ ID No. 6.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное включает тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 включает последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2 включает последовательность SEQ ID No. 2 и CDR-H3 включает последовательность SEQ ID No. 3.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное включает легкую цепь, где указанная легкая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 включает последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2 включает последовательность SEQ ID No. 5 и CDR-L3 включает последовательность SEQ ID No. 6.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его функциональный фрагмент или производное включает тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 включает последовательность SEQ ID No. 1, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 1 после оптимального выравнивания;

- CDR-H2 включает последовательность SEQ ID No. 2, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 2 после оптимального выравнивания; и

- CDR-H3 включает последовательность SEQ ID No. 3, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело согласно изобретению, его функциональный фрамент или производное включает легкую цепь, где указанная легкая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где: CDR-L1 включает последовательность SEQ ID No. 4, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 4 после оптимального выравнивания; CDR-L2 включает последовательность SEQ ID No. 5, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 5 после оптимального выравнивания; и CDR-L3 включает последовательность SEQ ID No. 6, или последовательность по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 6 после оптимального выравнивания.

В еще одном другом варианте осуществления изобретения, антитело, или его функциональный фрагмент, или производное включают: тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-H3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичность последовательностям SEQ ID Nos. 1, 2 или 3, соответственно (после оптимального выравнивания),

и легкую цепь, включающую три региона, определяющих комплементарность, как они определены согласно IMGT, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6, или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичности последовательностям SEQ ID Nos. 4, 5 или 6, соответственно. В смысле настоящего изобретения, "процент идентичности" между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот означает, что процент идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученными после оптимального выравнивания, является исключительно статистическим, и различия между двумя последовательностями распределены случайным образом по их длине. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или двух аминокислотных последовательностей традиционно выполняется сравнением последовательностей после их оптимального выравнивания, где указанное сравнение выполняется посегментно или с использованием "окна выравнивания". Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть выполнено, в дополнение к сравнению вручную, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Уотермана (1981) [Ad. App. Math. 2:482], с помощью алгоритма локальной гомологии Ниддлмана и Вунша (1970) [J. Mol. Biol. 4:443], с помощью метода поиска сходства Пирсона и Липмана (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или с помощью компьютерного программного обеспечения, использующего такие алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения, разработанного Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или с помощью программного обеспечения для сравнения последовательностей BLAST NR или BLAST Р).

Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или двумя аминокислотными последовательностями определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей, в которых последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, подлежащая сравнению, может иметь добавления или делеции по сравнению с референтной последовательностью для оптимального выравнивания между двумя последовательностями. Процент идентичности вычисляется определением числа позиций, в которых аминокислотные или нуклеотидные остатки в двух последовательностях идентичны, делением числа идентичных позиций на общее число позиций в окне выравнивания и умножением результата на 100, чтобы получить идентичность между двумя последовательностями, выраженную в процентах. Например, программа BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova и соавт., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250) доступная на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, может использоваться с параметрами, заданными по умолчанию (особенно для параметеров: "штраф за открытие делеции": 5 и "штраф за расширение/продолжение делеции": 2; выбранная матрица (являющаяся, например, матрицей "BLOSUM 62", предложенная программой); выраженная в процентах идентичность между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, вычисляется непосредственно программой.

Для аминокислотной последовательности, проявляющей по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% идентичность с референтной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают те, что содержат референтную последовательность, определенные модификации, особенно делецию, добавление или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или расширение. В случае замены одной или нескольких последовательных или непоследовательных аминокислот предпочтительными являются те замены, в которых заменяемые аминокислоты заменяются "эквивалентными" аминокислотами. Здесь выражение "эквивалентные аминокислоты" предназначено для указания любых аминокислот, которые, вероятно, могут быть замещены одной из структурных аминокислот, однако без модификации биологической активности соответствующих антител, и из которых определенные примеры приведены ниже.

Эквивалентные аминокислоты могут быть определены и через их структурную гомологию с аминокислотами, которые они заменяют, через результаты сравнительных испытаний биологической активности различными антителами, которые, вероятно, будут получены. В качестве неограничивающего примера, таблица 1 ниже суммирует возможные замены, которые, вероятно, осуществляются без результирующих существенных изменений биологической активности соответствующего модифицированного антитела; обратные замены, естественно, возможны при тех же условиях.

Таблица 1: Оригинальный остаток: Замена(ы): Ala (А) Val, Gly, Pro Arg (R) Lys, His Asn (N) Gln Asp (D) Glu Cys (С) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) Asp Gly (G) Ala His (H) Arg Ile (I) Leu Leu (L) Ile, Val, Met Lys (K) Arg Met (M) Leu Phe (F) Tyr Pro (P) Ala Ser (S) Thr, Cys Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Phe, Trp Val (V) Leu, Ala

Как известно тем, кто квалифицирован в данной области, наибольшая вариабельность (длина и состав) среди шести регионов, определяющих комплементарность, обнаружена в трех регионах, определяющих комплементарность тяжелой цепи и, конкретнее, в CDR-H3 этой тяжелой цепи.

В частном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к мышиному антителу, или к его производным соединениям или функциональным фрагментам.

В другом варианте осуществления изобретения, изобретение раскрывает антитело, а также его антигенсвязывающие фрагменты и производные, где указанное антитело включает тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность, основанные на определении регионов, определяющих комплементарность, по IGMT: CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 1 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 1 после оптимального выравнивания; CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 2 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 2 после оптимального выравнивания; и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 3 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания, и легкую цепь, где указанная легкая цепь включает следующие три региона, определяющих комплементарность: CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 4 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 4 после оптимального выравнивания; CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 5 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 5 после оптимального выравнивания; и

CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 6 или последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 6 после оптимального выравнивания.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, изобретение относится к антителу, его антигенсвязывающему фрагменту или производному, включающему: i) тяжелую цепь, включающую следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-H3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3; и ii) легкую цепь, включающую следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанное антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное выбраны из:

a) антитела с тяжелой цепью, включающей три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-Н3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3, и с вариабельным доменом легкой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 8;

b) антитела с вариабельным доменом тяжелой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 7, и с легкой цепью, включающей следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6; и

c) антитела с вариабельным доменом тяжелой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 7, и с вариабельным доменом легкой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 8.

Согласно еще одному другому варианту осуществления изобретения, изобретение относится к антителу 427аВ1 или к одному из его антигенсвязывающих фрагментов или производных, где указанное антитело включает последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 7 или последовательность, по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 7 после оптимального выравнивания; и/или отличающемуся тем, что оно включает последовательность вариабельного домена легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID No. 8 или последовательность, по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательности SEQ ID No. 8 после оптимального выравнивания.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения, изобретение предоставляет антитело 427аВ1, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, где указанное антитело 427аВ1 включает:

a) тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает:

- следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-Н3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3; и вариабельный домен легкой цепи, имеющий последовательность SEQ ID No. 8, и

- вариабельный домен тяжелой цепи, где указанный вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID No. 7; и

b) легкую цепь, где указанная легкая цепь включает:

- следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6; и

- вариабельный домен легкой цепи, где указанный вариабельный домен легкой цепи имеет последовательность SEQ ID No. 8.

Изобретение также относится к любому соединению, являющемуся производным антитела, как описано в изобретении. "Антигенсвязывающее производное" или "производное" антитела означает, в частности, антитело, образованное пептидным каркасом и по меньшей мере одним из регионов, определяющих комплементарность оригинального антитела, с целью сохранить его способность быть распознаваемым. Такие производные соединения хорошо известны лицу, квалифицированному в данной области.

В частности, антитело по изобретению, его производное соединение или антигенсвязывающий фрагмент отличаются тем, что указанное производное соединение состоит из связывающего белка, включающего пептидный каркас, на который привит по меньшей мере один регион, определяющий комплементарность, где указанный регион, определяющий комплементарность, привит таким образом, чтобы сохранить, полностью или частично, свойства распознавания паратопа исходного антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанный антигенсвязывающий белок представляет собой белок слияния пептидного каркаса и по меньшей мере одного из указанных регионов, определяющих комплементарность.

Одна или несколько последовательностей из шести последовательностей регионов, определяющих комплементарность, описанных в настоящем изобретении, может быть также представлена в различных иммуноглобулиновых белковых каркасах. В этом случае белковая последовательность позволяет воссоздать пептидный скелет, подходящий для корректного фолдинга привитых регионов, определяющих комплементарность, что позволяет их паратопам сохранить антигенраспознающие свойства.

Лицо, квалифицированное в данной области, осведомлено о способах выбора типа белкового каркаса для прививки CDR. Конкретнее, известно, что для того, чтобы быть выбранными, такие каркасы должны удовлетворять как можно большему числу критериев (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13: 167-187):

- удовлетворительный филогенетический консерватизм;

- известная трехмерная структура (определенная, например, кристаллографически, ЯМР-спектроскопически или с помощью любых других техник, известных лицу, квалифицированному в данной области); малый размер, малое число или отсутствие посттранскрипционных модификаций; и/или

- простота получения, экспрессии и очистки.

Наконец, как описано выше, такие пептидные каркасы включают от одного до шести регионов, определяющих комплементарность, из оригинального антитела. Предпочтительно, но не обязательно, лицо, квалифицированное в данной области, выберет по меньшей мере один регион, определяющий комплементарность, из тяжелой цепи - как известно, она в первую очередь ответственна за специфичность антитела. Выбор одного или более регионов, определяющих комплементарность, является очевидным для лица, квалифицированного в данной области, которое затем выберет подходящие известные техники (Bes и соавт., FEBS letters 508, 2001, 67-74).

Настоящее изобретение, таким образом, относится к антителу, или его производному соединению, или его функциональному фрагменту, где пептидный каркас выбран из белков: а) филогенетически хорошо сохранившихся; о) с устойчивой структурой; с) с хорошо известной трехмерной молекулярной организацией, d) малого размера и/или е) включающих регионы, которые могут быть модифицированы путем делеции и/или инсерции без изменения свойств стабильности.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, указанный пептидный каркас выбран из: i) каркасов, происходящих из фибронектина, предпочтительно, домена 10 фибронектина типа 3, липокалина, антикалина, белка Z, происходящего из В-домена белка A Staphylococcus aureus, тиоредоксина А или белков с повторяющимся мотивом, таким как "анкириновый повтор" (Kohl и соавт., PNAS, 2003, том 100, No. 4, 1700-1705), повтор "армадилло", повтор, богатый лейцином, и тетратрикопептидный повтор или iii) белковые ингибиторы нейрональной NO-синтазы (PIN).

Другой аспект изобретения относится к функциональным фрагментам описанных выше антител.

Конкретнее, изобретение направлено на антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент, где указанный функциональный фрагмент выбран из фрагментов Fv, Fab, (Fab')₂, Fab', scFv, scFv-Fc и диател, или любого фрагмента, время полужизни которого было увеличено, такого как ПЭГилированные фрагменты.

"Антигенсвязывающие фрагменты" (или "функциональные фрагменты": для целей настоящего изобретения эти два термина являются синонимами) антитела согласно изобретению, здесь и далее относится, например, к фрагментам Fv, scFv (одноцепочечные вариабельные фрагменты), Fab, F(ab')₂, Fab', scFv-Fc или диателам, или к любому фрагменту, время полужизни которого было увеличено с помощью химической модификации, такой как добавление полиалкиленгликоля, такого как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование) (ПЭГилированные фрагменты называются Fv-ПЭГ, scFv-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab')₂-ПЭГ и Fab'-PEG), или с помощью инкорпорирования в липосомы, микросферы или в сополимер молочной и гликолевой кислот. В частности, указанные фрагменты согласно изобретению содержат по меньшей мере один из отличительных регионов, определяющих комплементарность, по изобретению, так, что они сохраняют, хотя бы частично, связывающую активность и специфичность родительского антитела.

Предпочтительно, указанные антигенсвязывающие фрагменты будут содержать или включать частичную последовательность вариабельной тяжелой или легкой цепи антитела, производными которого они являются, где указанная частичная последовательность является достаточной для сохранения той же специфичности связывания, которую имеет и антитело, из которого они происходят, и достаточной аффинности. Указанная аффинность указанного фрагмента, предпочтительно, по меньшей мере равна 1/100, более предпочтительно, по меньшей мере равна 1/10 аффинности антитела, из которого они происходят.

Такой антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере пять аминокислот, предпочтительно, 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 или 100 последовательно идущих друг за другом аминокислот из последовательности антитела, из которого он происходит.

Согласно настоящему изобретению, антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены из антител по изобретению такими методами, как ферментативное расщепление, включая расщепление пепсином или папаином, и/или разрыв дисульфидных мостиков с помощью химического восстановления. Фрагменты антител также могут быть получены с помощью рекомбинантно-генетических техник или с помощью пептидного синтеза. Для ясности, Таблица 2 ниже суммирует различные аминокислотные последовательности, сооответствующие антителу 427аВ1 по изобретению.

Таблица 2 (где "Mu" означает мышиный): Антитело Тяжелая цепь Легкая цепь SEQ ID No. 427аВ1 CDR-H1 1 CDR-H2 2 CDR-H3 3 CDR-L1 4 CDR-L2 5 CDR-L3 6 "Mu" вариабельный домен 7 "Mu" вариабельный домен 8

Согласно другому аспекту, изобретение относится к мышиной гибридоме, способной секретировать моноклональное антитело согласно изобретению. Предпочтительно, указанная гибридома представляет собой гибридому, депонированную в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Институт Пастера, Париж, Франция) 25 июня 2008 г. под номером 1-4018. Указанная гибридома была получена слиянием спленоцитов иммунизированных мышей Balb/C с клетками миеломы линий Sp 2/O-Ag 14.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, моноклональное антитело, здесь и далее обозначаемое 427аВ1, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его производное секретируются указанной гибридомой.

Новый аспект настоящего изобретения относится к выделенной нуклеиновой кислоте, отличающейся тем, что она выбрана из следующих нуклеиновых кислот:

а) нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, кодирующей антитело, его производное соединение или функциональный фрагмент согласно изобретению;

b) нуклеиновой кислоты, включающей последовательность ДНК, включающую последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID No. 9-14 или из последовательности по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательностям SEQ ID No. 9-14 после оптимального выравнивания;

с) нуклеиновой кислоты, включающей последовательность ДНК, включающую последовательности SEQ ID No. 15 или 16, или последовательность по меньшей с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательностям SEQ ID No. 15 или 16 после оптимального выравнивания; d) РНК, транслированной с нуклеиновых кислот, как они определены в а), b) или с);

e) нуклеиновых кислот, комплементарных нуклеиновым кислотам, как они определены в а), b) и с); и

f) нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 18 нуклеотидов, способной к гибридизации в строгих условиях с последовательностями SEQ ID No. 15 или 16, или с последовательностью по меньшей мере с 80%, предпочтительно, с 85%, 90%, 95% и 98% идентичностью последовательностям SEQ ID No. 15 или 16 после оптимального выравнивания, или ее комплементарной последовательности.

Таблица 3 ниже суммирует различные нуклеотидные последовательности, относящиеся к антителу 427аВ1 по изобретению.

Таблица 3 (где "Mu" означает мышиный): Антитело Тяжелая цепь Легкая цепь. SEQ ID No 427аВ1 CDR-H1 9 CDR-H2 10 CDR-H3 11 CDR-L1 12 CDR-L2 13 CDR-L3 14 "Mu" вариабельный домен 15 "Mu"вариабельный домен 16

Термины "нуклеиновая кислота", "нуклеиновая последовательность", "последовательность нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид", "олигонуклеотид", "полинуклеотидная последовательность" и "нуклеотидная последовательность", использованные в настоящем описании взаимозаменяемым образом, означают точную последовательность нуклеотидов, модифицированную или немодифицированную, определяющую фрагмент или регион нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды, и представляющую собой двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК или продукты транскрипции указанных ДНК.

"Нуклеиновые последовательности, проявляющие процент идентичности с предпочтительной последовательностью по меньшей мере 80%, предпочтительно, 85%, 90%, 95% и 98% после оптимального выравнивания" означает нуклеиновые кислоты, проявляющие, по отношению к референтной нуклеиновой последовательности, определенные модификации, такие как, в частности, делеция, усечение, удлинение, химерное слияние и/или замена, особенно точечная. Предпочтительно, это последовательности, которые кодируют те же самые аминокислотные последовательности, что и референтная последовательность, связанная с вырождением генетического кода, или комплементарные последовательности, которые могут специфически гибридизоваться с референтными последовательностями, предпочтительно, в условиях высокой жесткости, особенно тех, что определены ниже.

Гибридизация в условиях высокой жесткости означает, что условия, относящиеся к температуре и ионной силе, выбирают таким образом, что они позволяют поддерживаться гибридизации между двумя комплементарными фрагментами ДНК. Исключительно для иллюстрации, условия высокой жесткости этапа гибридизации для целей определения полинуклеотидных фрагментов, описанных выше, преимущественно следующие.

ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизацию выполняют в два этапа: (1) прегибридизация при 42°С в течение трех часов в фосфатном солевом буфере (20 ммоль/л, pH 7.5), содержащем 5Х буфер для денатурации (1Х буфер для денатурации соответствует раствору of 0,15 М натрия хлорида и 0,015 М натрия цитрата), 50% формамида, 7% натрия додецилсульфата, 10Х Denhardt's, 5% декстрансульфата, 1% ДНК спермы осетра; (2) первичная гибридизация в течение 20 часов при температуре в зависимости от длины зонда (например, 42°С для зонда длиной более 100 нуклеотидов), с последующими двумя 20-минутными промываниями при 20°С в 2Х буфере для денатурации с 2% натрия додецилсульфата, одним 20-минутным промыванием при 20°С в 0,1Х буфере для денатурации, с добавлением 0,1% натрия додецилсульфата. Последнее промывание выполняют в 0,1Х буфере для денатурации с добавлением 0,1% натрия додецилсульфата в течение 30 минут при 60°С для зонда длиной более 100 нуклеотидов. Крайне жесткие условия гибридизации, описанные выше для полинуклеотида определенного размера, могут быть адаптированы специалистом в данной области, для более длинных или коротких нуклеотидов, согласно процедурам, описанным в Sambrook и соавт. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001).

Изобретение также относится к вектору, включающему полинуклеотид по изобретению.

Особенно изобретение приводит клонирующие и/или экспрессионные векторы, которые несут такую нуклеотидную последовательность.

Векторы по изобретению, предпочтительно, содержат элементы, позволяющие экспрессировать нуклеотидную последовательность в данной клетке-хозяине. Чтобы экспрессировать антитела по изобретению, полинуклеотиды, кодирующие тяжелые или легкие цепи указанных антител, вставляют в экспрессионные векторы, такие, что гены оперативно связаны с транскрипционными и трансляционными последовательностями. "Оперативно связанные" последовательности включают и контрольные последовательности экспрессии, сцепленные с целевым геном, и контрольные последовательности экспрессии, которые проявляют транс-активность или воздействие на расстоянии, чтобы контролировать целевой ген. Термин "контрольная последовательность экспрессии", как применяется в данном описании, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для эффекта экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Контрольные последовательности экспрессии включают соответствующие последовательности, инициирующие транскрипцию, терминирующие транскрипцию, промоторные и энхансерные последовательности; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг или сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (например, консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, когда необходимо, последовательности, которые повышают секрецию белка. Природа таких контрольных последовательностей различается в зависимости от организма хозяина: у прокариот такие контрольные последовательности включают, в общем случае, промотор, рибосомальный сайт связывания и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, в общем случае, такие контрольные последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин "контрольные последовательности" предназначен для обозначения, как минимум, всех компонентов, наличие которых является необходимым для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, наличие которых является предпочтительным, например, лидерных последовательностей или последовательностей партнеров слияния.

Термин "вектор", как он используется в данном описании, предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной к транспортировке другой молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Один тип векторов представляет собой "плазмида", которая относится к кольцевой двухнитевой петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другой тип векторов представляет собой вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина в результате введения в клетку-хозяина, и, таким образом, реплицируются одновременно с геномом хозяина.

Векторы согласно изобретению могут также содержать последовательность, обеспечивающую стабильное поддержание указанных векторов в клетке-хозяине. Будет понятно, что такие последовательности, называемые ориджинами репликации, различаются в зависимости от типа клетки-хозяина. Лицом, квалифицированным в данной области, могут быть выбраны и оптимизированы различные элементы в зависимости от применяемой клетки-хозяина. Для этих целей нуклеотидные последовательности могут быть вставлены в самореплицирующиеся векторы в выбранного хозяина или быть интегративными векторами выбранного хозяина.

Такие векторы приготавливаются способами, типично применяемыми лицами, квалифицированными в данной области, и результирующие клоны могут быть введены в подходящего хозяина стандартными способами, такими как липофекция, электропорация, тепловой шок или химические методы.

Изобретение также направлено на клетки-хозяева, трансформированные вектором или включающие вектор, как он описан в настоящем изобретении.

Клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотических или эукариотических систем, например, таких как бактериальные клетки, но также и клетки дрожжей или животные клетки, особенно клетки млекопитающих. Также могут применяться клетки насекомых или растений.

Изобретение также относится к животным, отличным от человека, или к растениям, которые содержат трансформированные клетки согласно изобретению.

Другой аспект изобретения относится к способу продуцирования антитела согласно изобретению, антигенсвязывающего фрагмента или производного, отличающемуся тем, что указанный способ включает этапы: а) культивирование клетки-хозяина согласно изобретению в надлежащей среде в надлежащих условиях; и b) выделение указанного антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента или производного.

Экспрессированное в результате антитело может быть затем очищено из культуральной среды или из клеточного экстракта. Растворимые формы антитела по изобретению могут быть восстановлены из культурального супернатанта. Они могут быть затем очищены любым способом, известным в области очистки иммуноглобулиновых молекул, напрмер, с помощью хроматографии (например, ионно-обменной, аффинной, в частности, аффинности белка А к Fc, и.т.д.), центрифугирования, различной растворимости или с помощью любых других стандартных техник очистки белков. Подходящие способы очистки будут ясны лицу, обладающему обычными знаниями в данной области.

Полипептиды согласно изобретению также могут быть получены химическим синтезом. Указанные способы получения также входят в объем настоящего изобретения. Некоторые способы химического синтеза, такие как твердофазные техники (особенно см. Steward и соавт., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.) или частично твердофазные техники конденсацией фрагментов или рутинным синтезом в растворе, также известны специалисту в данной области. Полипептиды, полученные химическим синтезом и содержащие неприродные аминокислоты, также включены в объем изобретения. Антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или производные, которые могут быть получены способом согласно изобретению, также включены в объем настоящего изобретения.

Как указано выше, антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное способны связывать CXCR4 как мономер и/или гомодимер.

Неожиданно заявителем было показано, что указаное антитело, его антигенсвязывающий фрагмент, или производное существенно не связывают CXCR4 как гетеродимер. Предпочтительно, указанное антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное не связывают CXCR4/CXCR-2 гетеродимер.

Антитела из предшествующего уровня техники, такие как 515Н7, как известно, способны связывать CXCR4 как мономер, гомодимер или гетеродимер (WO 2010/037831). Напротив, антитело согласно изобретению проявляет строгую специфичность в отношении изоформ CXCR4, так как оно способно различать гомо- и гетеродимеры. Это свойство делает антитело согласно изобретению предпочтительным инструментом для дифференциального скрининга и, например, для характеризации опухоли.

"CXCR4 как мономер и/или гомодимер" или "мономерный/гомодимерный CXCR4" (для целей настоящей заявки эти два термина являются синонимами и, как подразумевается, используются взаимозаменяемо) в данном описании относятся к CXCR4 в мономерной форме, т.е. не участвующему в каком-либо физическом взаимодействии с каким-либо белком-партнером, и/или в гомодимерной форме, т.е. образующему комплекс с другой молекулой CXCR4. Выражение "CXCR4 как мономер и/или гомодимер", или "мономерный/гомодимерный CXCR4", как подразумевается, специфически исключает гетеродимеры CXCR4, то есть димеры CXCR4 с любыми другими белками-партнерами, за исключением самого CXCR4. В частности, выражение "CXCR4 как мономер и/или гомодимер" или "мономерный/гомодимерный CXCR4" специфически исключает CXCR4/CXCR2 гетеродимеры.

Изобретение, таким образом, относится к антителу, описанному выше, или к его антигенсвязывающему фрагменту или производному, для применения в диагностик in vitro или ex vivo и/или для прогнозирования онкогенных нарушений, связанных с экспрессией CXCR4.

Изобретение, таким образом, относится к способу in vitro или ex vivo диагностики и/или прогнозирования онкогенных нарушений, связанных с экспрессией CXCR4, включающему этап исследования связывания антитела согласно изобретению, или его антигенсвязывающего фрагмента или производного, с CXCR4.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, онкогенное нарушение представляет собой онкогенное нарушение, связанное с экспрессией мономера и/или гомодимера CXCR4.

В соответствии с тем, как использовано в данном описании, термин "диагностика" заболевания относится к процессу идентификации или выявления наличия патологического гиперпролиферативного онкогенного нарушения, связанного с или опосредованного экспрессией мономерного/гомодимерного CXCR4, мониторинга прогрессирования заболевания, и идентификации или выявления клеток или образцов, которые являются показательными для нарушений, связанных с экспрессией мономерного и/или гомодимерного CXCR4. В соответствии с тем, как он использован в данном описании, термин "прогноз" означает вероятность выздоровления от болезни или предсказание возможного развития или исхода болезни. Например, если образец от субъекта является негативным при окрашивании с антителом согласно изобретению, то прогноз для указанного субъекта является более благоприятным, чем если образец является позитивным при окрашивании с мономерным/гомодимерным CXCR4. Образцы могут быть оценены по уровню экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 по соответствующей шкале, как это будет описано далее.

Связывание антитела согласно изобретению, или его фрагмента или производного, с CXCR4, включая мономеры CXCR4, гомодимеры CXCR4/CXCR4 и гетеродимеры CXCR4/CXCR-2, может быть исследовано множеством путей, которые известны специалисту в данной области. Один такой метод, а именно BRET-анализ (резонансный перенос энергии биолюминесценции), детально описан в WO 2010/037831. Антитело 515Н7 может с удобством применяться в качестве позитивного контроля для анализа связывания.

Антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное может представлять собой мышиное антитело. Однако химерную или гуманизированную версию такого антитела также следует рассматривать как часть объема настоящего изобретения, поскольку такие антитела должны включать определяющие комплементарность регионы антитела, описанного в данном документе.

Важно отметить, что антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное не блокируют связывание 515Н7 с CXCR4. Таким образом, является возможным применять антитело согласно изобретению в процессе лечения антителом 515Н7 без перекрестного взаимодействия между указанными видами лечения, так как эти два антитела не конкурируют за CXCR4. Антитело согласно изобретению, таким образом, представляет собой критический инструмент для мониторинга эффективности терапии на основе указанного антитела 515Н7, например, путем визуализации опухоли in vivo.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанное антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное не обладают какой-либо противоопухолевой активностью in vivo.

Это свойство представляет большой интерес для диагностических применений, так как оно позволит применять антитело для скрининга пациентов или для отслеживания прогрессирования заболевания, используя агент, который не окажет никакого влияния или не будет иметь последствий для пациента. Это свойство делает антитело 427аВ1 предпочтительным инструментом для скрининга пациентов, подлежащих лечению, поскольку оно не будет влиять на пациента. Как будет понятно специалисту в данной области, заявитель предоставил действительно новое и обладающее изобретательским уровнем антитело, позволяющее распознавать CXCR4 как в мономерной, так и в гомодимерной форме, при этом не обладающее противоопухолевой активностью in vivo

Антитело может быть представлено в форме иммуноконъюгата или меченного антитела, чтобы получить поддающийся выявлению и/или измерению сигнал. Когда оно используется с подходящими метками или иными соответствующими поддающимися выявлению биомолекулами или химическими веществами, анитело согласно изобретению, в частности, применимо для диагностики in vitro и in vivo и для прогностических приложений.

Метки для применения в иммунологических анализах в целом известны тем, кто квалифицирован в данной области. Указанные метки включают, в том числе, ферменты, радиоизотопы и флуоресцентные, люминесцентные и хромогенные вещества, включая окрашенные частицы, такие как коллоидное золото или латексные гранулы. Различные типы меток или способов конъюгирования меток с антителами согласно изобретению - такие как те, что изложены ниже - хорошо известны тем, кто квалифицирован в данной области.

В соответствии с тем, как использовано в данном документе, термин "онкогенное нарушение, связанное с экспрессией мономера и/или гомодимера CXCR4" предназначается для обозначения заболеваний и других нарушений, для которых, как было показано, имеет место наличие аберрантно высоких уровней мономерного/гомодимерного CXCR4 у субъекта, страдающего указанным нарушением, или потенциально имеющего указанное нарушение, как фактор, ответственный за патофизиологию нарушения, так и фактор, виновный в ухудшении нарушения. Такие нарушения могут проявляться, например, повышением уровня CXCR4, предпочтительно, мономера и/или гомодимера CXCR4 на клеточной поверхности пораженных клеткок или тканей у субъекта, страдающего от указанного нарушения. Повышение уровня мономерного и/или гомодимерного CXCR4 может быть выявлено, например, применением антитела 427аВ1 по изобретению.

В определенных вариантах осуществления изобретения, "повышенная экспрессия", когда он касается мономера и/или гомодимера CXCR4, относится к уровню экспрессии белка или гена, которые демонстрируют статистически существенное повышение экспрессии (измеренное по экспрессии белка или по экспрессии РНК), по сравнению с контролем.

В другом варианте осуществления изобретения, изобретение относится к способу выявления наличия экспрессирующей мономерный/гомодимерный CXCR4 опухоли у субъекта, причем указанный способ включает этапы: а) введения субъекту антитела согласно изобретению, его антигенсвязывающего фрагмента или производного; и b) выявления связывания указанного антитела, где указанное связывание указывает на наличие опухоли.

Предпочтительный аспект изобретения представляет собой ex vivo способ выявления наличия у субъекта опухоли, экспрессирующей мономерный/гомодимерный CXCR4, где указанный способ включает этапы:

(a) контактирования биологического образца, полученного у указанного субъекта, с антителом согласно изобретению, или с его антигенсвязывающим фрагментом, или производным, и

(b) выявления связывания указанного антитела с биологическим образцом.

Связывание антитела согласно изобретению может быть выявлено различными методами исследования, доступными специалисту в данной области. Хотя любые подходящие средства для выполнения анализов включены в объем изобретения, можно отметить, в частности, флуоресценция-активированный клеточный сортинг, энзим-связанный иммуносорбентный анализ, вестерн-блоттинг и иммуногистохимический анализ.

В другом варианте осуществления изобретения, изобретение относится к способу выявления локализации у субъекта опухоли, экспрессирующей мономерный/гомодимерный CXCR4, включающему этапы:

(а) введения указанному субъекту антитела согласно изобретению, или его антигенсвязывающего фрагмента, или производного; и

(b) выявления связывания указанного антитела, где указанное связывание показываает наличие опухоли.

Что касается выявления наличия экспрессирующей опухоли, могут быть применены многие техники, известные человеку, квалифицированному в данной области. Все же предпочтительными способами являются иммуногистохимический анализ или флуоресценция-активированный клеточный сортинг.

Другой аспект изобретения относится к способу in vitro или ex vivo определения процента клеток в опухоли у субъекта, экспрессирующих мономер и/или гомодимер CXCR4, где указанный способ включает этапы:

(a) контактирования биологического образца, полученного у указанного субъекта с антителом согласно изобретению, его антигенсвязывающим фрагментом или производным; и

(b) подсчета процента клеток, экспрессирующих CXCR4 как мономер и/или гомодимер в указанном биологическом образце.

Еще один другой аспект изобретения относится к способу определения in vitro или ex vivo уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 в опухоли у субъекта, где указанный способ включает этапы:

(a) контактирования биологического образца, полученного у указанного субъекта, с антителом согласно изобретению, его антигенсвязывающим фрагментом или производным; и

(b) количественного определения уровня связывания указанного антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или производного с мономерным/гомодимерным CXCR4 в указанном биологическом образце.

Уровень экспрессии и уровень связывания указанного антитела с мономерным/гомодимерным CXCR4 могут быть измерены иммуногистохимически или с помощью активированного флуоресценцией клеточного сортинга, предпочтительно, иммуногистохимически.

После того, как количество мономера и/или гомодимера CXCR4 в исследуемом образце определено, результаты могут быть сопоставлены с результатами контрольных образцов, полученными способом, сходным с тем, что и в исследуемых образцах, но у индивидуумов, не имеющих гиперпролиферативных онкогенных нарушений, связанных с экспрессией мономера и/или гомодимера CXCR4. Если уровень мономерного/гомодимерного CXCR4 в исследуемом образце существенно повышен, можно заключить, что существует повышенная вероятность того, что у субъекта, у которого он получен, имеется или разовьется указанное нарушение.

Что касается развития целевой противоопухолевой терапии, то диагностика с использованием иммуногистохимических техник дает in situ информацию об уровне экспрессии рецепторов и, таким образом, позволяет отобрать пациентов, чувствительных к лечению, после определения уровня экспрессии рецепторов, необходимых для такого лечения.

Определение стадии имеет потенциальное прогностическое значение и обеспечивает критерии для разработки оптимальной терапии (Simpson и соавт., J. Clin. Oncology 18:2059, 2000). Например, выбор лечения для солидных опухолей основан на определении стадии опухоли, которое обычно выполняется с помощью TNM-теста (система классификации опухолей, основанная на определении трех факторов: Т - размер первичной опухоли, N - состояние лимфатических узлов, М - наличие или отсутствие отдаленных метастазов) от Американского объединенного комитета по раку. В общем, признано, что, хотя этот тест и система определения стадии предоставляет некоторую существенную информацию в отношении стадии, на которой солидный рак был диагностирован у пациента, он является неточным и недостаточным. В частности, он не позволяет идентифицировать ранние стадии прогрессирования опухоли.

Изобретение, таким образом, относится к in vitro или ex vivo способу определения оценки в баллах опухоли у субъекта, где указанный способ включает этапы:

(a) контактирования биологического образца от субъекта с антителом по изобретению, или с его антигенсвязывающим фрагментом, или с его производным,

(b) количественного определения уровня связывания указанного антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или производного, с мономерным/гомодимерным CXCR4 в указанном биологическом образце; и

(c) оценки в баллах опухоли путем сравнения количественно определенного уровня связывания указанного антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или производного у субъекта, с подходящей шкалой.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанное антитело для диагностики способно связывать целевой рецептор в случае, когда образцы тканей являются фиксированными в формалине, фиксированными в заменителе формалина, таком как заменитель формалина Glyco-Fix^®, залитыми в парафин и/или замороженными.

Предпочтительно, уровень экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 измеряют иммуногистохимически или с помощью активированного флуоресценцией клеточного сортинга, более предпочтительно, иммуногистохимически.

Любой общепринятый способ анализа рисков может быть применен для оценки прогностического значения мономера и/или гомодимера CXCR4. Репрезентативные аналитические методы включают регрессионный анализ по Коксу, который представляет собой полупараметрический метод для моделирования выживаемости или данных "время-событие" при наличии усеченных ограниченных случаев (Хосмер и Лемешов, 1999; Кокс, 1972). В отличие от других методов анализа выживаемости, например, таблиц выживания Каплана-Мейера, регрессионный анализ по Коксу позволяет включать в модели независимые переменные - предикторы. Используя традиционные методы анализа, например, регрессионный анализ по Коксу, возможно исследовать гипотезы, касающиеся корреляции мономер/гомодимер CXCR4-экспрессирующего статуса первичной опухоли со временем до начала заболевания либо до рецидива (продолжительность выживания без признаков заболевания, или время до начала метастатического заболевания), или время от момента заболевания до смерти (общая продолжительность выживания). Регрессионный анализ по Коксу также известен как анализ пропорциональных рисков Кокса. Этот метод является стандартом для исследования прогностического значения опухолевых маркеров на продолжительность выживания пациента. При использовании в мультипараметрическом режиме эффект нескольких переменных исследуют параллельно, таким образом, что могут быть определены индивидуальные переменные, имеющие независимое прогностическое значение, т.е. наиболее существенные маркеры. Термин "негативный или позитивный статус по мономерному/гомодимерному CXCR4" также обозначается здесь как негативный по мономерному/гомодимерному CXCR4 [мономер/гомодимер CXCR4(-)] или позитивный по мономерному/гомодимерному CXCR4 [мономер/гомодимер CXCR4(+)].

Образец может быть оценен в "баллах" в процессе диагностики или мониторинга рака. В самой простой форме, образцы могут быть оценены качественно (с помощью иммуногистохимии) как негативные или позитивные, судя по визуальному осмотру образцов. Более количественная оценка включает оценивание двух параметров: интенсивности окрашивания и доли окрашенных ("позитивных") клеток в образце.

"Мономерный/гомодимерный CXCR4 статус" в данном описании относится к классификации опухоли как позитивной по мономеру и/или гомодимеру CXCR4 [мономерный/гомодимерный CXCR4(+)] или негативной по мономеру и/или гомодимеру CXCR4 [мономерный/гомодимерный CXCR4(-)] на основе определения уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4. Экспрессия CXCR4 может быть выявлена и измерена любым подходящим методом, доступным лицу, квалифицированному в данной области, таким как иммуногистохимия или флуоресценция-активированный клеточный сортинг.

В варианте осуществления изобретения, для обеспечения стандартизации образцы могут быть оценены в баллах по уровню экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 по различным шкалам, большая часть которых основана на оценке интенсивности продукта реакции и процента позитивных клеток (Payne и соавт., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology 2008, 52, 82-90).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанная оценка в баллах включает применение соответствующей шкалы, основанной на двух параметрах, которыми являются интенсивность окрашивания и процент позитивных клеток.

В качестве первого примера, основанного на доктрине Quick Allred, в результате оценки иммуногистохимического анализа рецептора эстрогена и рецептора прогестерона, образцы могут быть оценены по уровню экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR по общей шкале от 0 до 8, сочетающей оценку в баллах интенсивности реактивности и доли окрашенных клеток (Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol. 1999; 17; 1474-1481). Более конкретно, первый критерий (интенсивность реактивности) оценивается по шкале от 0 до 3, где 0 соответствует отсутствию реактивности, а 3 соответствует сильной реактивности. Второй критерий, доля реактивности, оценивается по шкале от 0 до 5, где 0 соответствует отсутствию реактивности, а 5 соответствует 67-100% доле реактивности. Оценка в баллах интенсивности реактивности и оценка в баллах доли реактивности затем суммируются с получением общей оценки от 0 до 8.

Общий балл 0-2 считается негативным, тогда как общий балл 3-8 считается позитивным.

Согласно данной шкале, термины "негативный" или "позитивный" (мономерный/гомодимерный CXCR4-статус опухолей) применительно к настоящему описанию обозначают уровни экспрессии мономера и/или гомодимера CXCR4, которые соответствуют оценке в баллах 0-2 или 3-8 по шкале Allred, соответственно. Таблица 4 ниже иллюстрирует руководство по интерпретации результатов иммуногистохимии согласно методу Allred.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, способ согласно изобретению ссылается на соответствующую шкалу, представляющую собой шкалу от 0 до 8, где отсутствие реактивности оценивается как 0, а высокая [сильная] реактивность в пропорции 67-100% оценивается как 8.

В другом варианте осуществления изобретения, приведен способ in vitro или ex vivo определения статуса опухоли у субъекта, где указанный способ включает этапы:

(а) оценку в баллах опухоли у субъекта согласно шкале Allred; и

(b) определение статуса опухоли как положительного по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке по шкале Allred от 3 до 8; или

(c) определение статуса опухоли как отрицательного по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке по шкале Allred от 0 до 2;

В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 3 по шкале Allred.

В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 4 по шкале Allred.

В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 5 по шкале Allred.

В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 6 по шкале Allred.

В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 7 по шкале Allred. В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 8 по шкале Allred. В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке от 3 до 8 по шкале Allred.

В качестве второго примера, основанного на идее традиционного оценивания в баллах для иммуногистохимической оценки, например, рецепторов HER-2, образцы могут быть оценены в баллах по уровню экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 каким-либо более простым способом, где указанный способ сочетает интенсивность окрашивания (предпочтительно, мембранного окрашивания) и долю клеток, которые проявляют окрашивание по комбинированной шкале от 0 до 3+. По данной шкале, обозначаемой как упрощенная шкала, 0 и 1+ являются негативными, тогда как 2+ и 3+ означают позитивное окрашивание. Несмотря на это, оценки в баллах 1+-3+ могут быть перекодированы как позитивные, поскольку каждый позитивный балл можно связать с существенно более высоким риском рецидива и фатального заболевания, по сравнению с баллом 0 (негативный), но повышение интенсивности среди положительных баллов может обеспечить уменьшение дополнительного риска.

Говоря в целом, термины "негативный" или "позитивный" мономерный/гомодимерный CXCR4 статус опухолей применяются в настоящем описании для обозначения уровней экспрессии мономера и/или гомодимера CXCR4, соответствующих оценкам в баллах 0-1+ или 2+-3+ по упрощенной шкале, соответственно. Следует рассматривать только полную периферическую реактивность мембран инвазивной опухоли, зачастую напоминающей внешним видом "мелкоячеистую сетку". Согласно имеющимся руководствам, образцы, имеющие граничную оценку в баллах для мономера и/или гомодимера CXCR4 (балл от 2+ до 3+), подлежат дополнительной оценке. Следует отвергнуть иммуногистохимический анализ и повторить исследование или провести повторное исследование флуоресцентной гибридизацией in situ или другим методом, если, в качестве неограничивающего примера, контрольные образцы не соответствуют ожиданиям, артефакты оказывают влияние на большинство образцов и образцы здоровых грудных протоков (внутренний контроль) имеют резкую мембранопозитивность, что позволяет предположить избыточное демаскирование антигена.

Для большей ясности, таблица 5 ниже суммирует эти параметры.

Таблица 5 Статус по мономерному и/или гомодимерному CXCR4 е Иммуногистохимическое описани 0 Отстутствие реактивности или мембранная реактивность в менее чем 10% опухолевых клеток 1+ Слабая/едва заметная мембранная реактивность выявляется в более чем 10% опухолевых клеток. Клетки иммунологически реактивны только частично (реагируют только частью мембраны). 2+ Полная мембранная реактивность (от слабой до умеренной) наблюдается более чем в 10% опухолевых клеток. 3+ Резко выраженная полная реактивность наблюдается в более чем 10% опухолевых клеток.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, способ согласно изобретению ссылается на соответствующую шкалу, которая представляет собой шкалу от 0 до 3+, где отсутствие реактивности мембран опухолевых клеток оценивается как 0, а резко выраженная реактивность мембран (с более чем 10% опухолевых клеток) оценивается как 3+.

Более детально, как описано выше, указанная соответствующая шкала представляет собой шкалу от 0 до 3, где отсутствие реактивности мембран опухолевых клеток оценивается как 0; едва заметная реактивность мембран в более чем 10% опухолевых клеток оценивается как 1+; реактивность мембран от слабой до умеренно полной в более чем 10% опухолевых клеток оценивается как 2+; и резко выраженная реактивность в более чем 10% опухолевых клеток оценивается как 3+.

Таким образом, другой вариант осуществления изобретения приводит способ in vitro или ex vivo определения статуса опухоли у субъекта, где указанный способ включает этапы:

(a) оценки в баллах опухоли у субъекта согласно упрощенной шкале, как описано выше; и

(b) определения статуса опухоли как положительного по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке в баллах от 2+ до 3+; или

(c) определения статуса опухоли как отрицательного по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке в баллах от 0 до 1+.

В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 2+.

В частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 3+.

В другом частном аспекте изобретения, опухоль является положительной по мономерному/гомодимерному CXCR4 при оценке 2+ или 3+.

Результаты теста или анализа согласно изобретению могут быть представлены в любом из множества форматов.

Результаты могут быть представлены качественно. Например, отчет о тесте может показывать только, был или не был выявлен конкретный полипептид, возможно, с указанием пределов определения. Результаты могут быть представлены полуколичественно. Например, могут быть определены различные диапазоны, и диапазонам могут быть присвоены оценки в баллах (например, от 0 до 3+ или от 0 до 8, в зависимости от используемой шкалы), которые предоставляют определенную степень количественной информации. Такая оценка может отражать различные факторы, например, число клеток, в которых выявляется CXCR4 как мономер и/или гомодимер, интенсивность сигнала (которая может показывать уровень экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 или CXCR4-несущих клеток), и.т.д. Результаты могут быть представлены количественным образом, например, как процент клеток, в которых выявлен полипептид CXCR4, как концентрация белка, и. т.д.

Как будет понятно специалисту в данной области, итоговый результат, обеспечиваемый тестом, будет варьировать в зависимости от технических ограничений теста и биологического значения, связанного с выявлением полипептида. Например, в случае определенных полипептидов чисто качественный результат (например, выявляется или не выявляется полипептид при определенном уровне детекции) предоставляет существенную информацию. В других случаях необходим более количественный результат (например, отношение уровня экспрессии полипептида в испытуемом образце к нормальному уровню).

Изобретение также относится к способу определения того, является ли онкогенное нарушение чувствительным к лечению антагонистами CXCR4, где указанный способ включает этапы: (а) определения in vitro или ex vivo статуса опухоли у субъекта, как описано выше, и

(b) определения онкогенного нарушения как чувствительного к антагонисту CXCR4, если статус является позитивным по мономерному/гомодимерному CXCR4.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антагонист CXCR4 представляет собой анти-СХСР4 антитело, или его фрагмент или производное, как описано выше.

В другом аспекте, изобретение относится к способу диагностики патологического гиперпролиферативного онкогенного нарушения или чувствительности патологического состояния, связанного с экспрессией мономерного/гомодимерного CXCR4 у субъекта, где указанный способ включает:

(а) определение наличия или отсутствия мономерного/гомодимерного CXCR4 в образце, и

(b) диагностику патологического состояния или чувствительности к патологическому состоянию, основанного на наличии или отсутствии указанного мономера и/или гомодимера CXCR4.

В способах по изобретению выявление клеток, экспрессирующих мономерный/гомодимерный CXCR4, или увеличение уровня мономерного/гомодимерного CXCR4 в общем является показательным у пациента с подозреваемым или имеющимся нарушением, опосредованным мономерным/гомодимерным CXCR4.

Изобретение, таким образом, обеспечивает способ предсказания риска развития рака у индивидуума, где указанный способ включает выявление уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 в биологическом образце, где высокий уровень экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 указывает на высокий риск развития рака.

Показали, что экспрессия CXCR4 значительно связана с прогрессирующими стадиями опухоли в некоторых типах рака. (Schimanski и соавт., J Clin Oncol, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I., 24(18S): 14018, 2006; Lee и соавт., Int J Oncol., 34(2):473-480, 2009; Pagano, Tesi di dottorato, Università degli Studi di Napoli Federico II, 2008).

Таким образом, изобретение также относится к способу оценки агрессивности опухоли. "Агрессивность опухоли", как применяется здесь, относится к быстро растущей и имеющей тенденцию к быстрому метастазированию опухоли. В одном варианте осуществления изобретения, указанный метод включает этапы:

(a) определения уровня мономерного/гомодимерного CXCR4, экспрессированного клетками в образце опухоли от индивидуума, и

(b) определения уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4, экспрессированного в образце эквивалентной ткани, взятом у того же индивидуума в более поздний момент времени,

(c) вычисления отношения между уровнем экспрессии, полученным на этапе (а), и уровнем экспрессии, полученным на этапе (b),

где отношение экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 в образце опухоли спустя некоторое время предоставляет информацию о рисках прогрессирования рака.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, отношение уровня, полученного на этапе (а), к уровню, полученному на этапе (b), меньшее 1, указывает на агрессивность опухоли. В другом варианте осуществления изобретения, отношение, большее или равное 1, указывает на неагрессивность опухоли.

Другим аспектом изобретения является мониторинг экспрессии мономера и/или гомодимера CXCR4 в ответ на терапию, направленную на мономерный/гомодимерный CXCR4. Такой мониторинг может быть очень полезен, если указанная терапия "запускает" понижающую регуляцию и/или деградацию мономерного/гомодимерного CXCR4.

В частности, мониторинг экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 на клеточной поверхности может быть инструментом первостепенного значения для оценки эффективности лечения в ходе клинических испытаний и "персонализированной" терапии.

Изобретение, таким образом, обеспечивает способы определения подходящего субъекту терапевтического режима.

Увеличение или уменьшение уровня мономерного/гомодимерного CXCR4 является показателем развития рака, связанного с мономерным/гомодимерным CXCR4. Таким образом, измеряя увеличение числа клеток, экспрессирующих мономерный/гомодимерный CXCR4 или изменения концентрации мономерного/гомодимерного CXCR4, присутствующего в различных тканях или клетках, можно определить, является ли конкретный терапевтический режим, направленный на улучшение [состояния при] злокачественной опухоли, связанной с CXCR4, эффективным.

Таким образом, настоящее изобретение также направлено на способ определения эффективности терапевтического режима, разработанного для того, чтобы облегчить онкогенное нарушение, связанное с мономерным/гомодимерным CXCR4 у субъекта, страдающего от указанного нарушения, включающий этапы:

(a) определения первого уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 в биологическом образце, выделенном у субъекта в первый момент времени;

(b) определения второго уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 в биологическом образце, выделенном у субъекта во второй, более поздний момент времени;

(c) определения отношения уровня, полученного на (а), к уровню, полученному на (b); и

(d) определения эффективности указанного терапевтического режима как высокой, если отношение на этапе (с) больше 1; или

(e) определения эффективности указанного терапевтического режима как низкой, если отношение на этапе (с) меньше или равно 1.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, терапевтический режим, разработанный для облегчения онкогенного нарушения, связанного с мономерным/гомодимерным CXCR4 у субъекта, страдающего указанным нарушением, включает введение указанному субъекту ингибитора CXCR4.

Другой предпочтительный вариант осуществления изобретения предоставляет способ выбора пациента, для которого прогнозировано или не прогнозировано улучшение на введение терапевтического количества ингибитора CXCR4, где указанный способ включает этапы:

(a) определения уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 у указанного пациента;

(b) определения референтного уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 у здорового индивидуума;

(c) определения соотношения между уровнем, полученным на этапе (а), и референтным уровнем, полученным на этапе (b), и

(d) выбора пациента как того, кому предсказано улучшение в результате введения терапевтического количества ингибитора CXCR4, если отношение на этапе (с) больше 1; или

(e) выбора пациента как того, кому предсказано улучшение в результате введения терапевтического количества ингибитора CXCR4, если отношение на этапе (с) меньше или равно 1.

В смысле настоящего описания, выражение "ингибитор CXCR4" или "ингибирующее CXCR4 соединение" обозначает любое соединение или молекулу, способные связываться с CXCR4 и ингибировать связывание лиганда CXCR4. В качестве неограничивающего примера, ингибиторы CXCR4 включают AMD3100 и AMD3465. Другие ингибиторы CXCR4, которые могут применяться, включают, без ограничения, СТСЕ-0214, СТСЕ-9908, СР-1221 (линейные пептиды, циклические пептиды, природные аминокислоты, неприродные аминокислоты и соединения-пептидомиметики); Т140 и аналоги; 4F-бензоил-TN24003; KRH-1120; KRH-1636; KRH-2731; аналог полифемузина; ALX40-4C; или соединения, описанные в WO 01/85196; WO 99/50461; WO 01/94420; WO 03/090512, каждое из которых включено сюда посредством ссылки.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанные ингибиторы представляют собой моноклональные антитела, такие как описанные в патентах WO 2008/060367 и WO 2009/140124.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанный ингибитор CXCR4 представляет собой моноклональное антитело 515H7 (WO 2010/037831).

Также задачей изобретения является обеспечение способа визуализации in vivo онкогенного нарушения, связанного с экспрессией мономера и/или гомодимера CXCR4. Такой способ применим для in vivo локализации опухолей, так же как и для мониторинга их инвазивности. Аналогичным образом, способ применим для мониторинга прогрессирования и/или ответа на лечение у пациентов с ранее диагностированным раком, опосредованным мономерным/гомодимерным CXCR4.

В первом аспекте, изобретение обеспечивает реагент для in vivo визуализации, где указанный реагент включает антитело согласно изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, где указанное антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, предпочтительно, являются меченными, более предпочтительно, радиоактивно меченными. Указанный реагент может вводиться пациенту, страдающему раком, опосредованным мономерным/гомодимерным CXCR4, в комбинации с фармацевтически эффективным носителем. Настоящее изобретение также предполагает применение указанного реагента в медицинской визуализации у пациентов, страдающих мономер/гомодимер CXCR4-опосредованным раком. Способ по изобретению включает этапы:

(a) введения указанному пациенту эффективного для визуализации количества визуализирующего реагента и

(b) выявления указанного реагента.

В первом варианте осуществления изобретения, визуализирующий агент включает целевую группу и активную группу.

Как применяют в данном документе, термин "целевая группа" обозначает агент, который специфически распознает и связывает мономерный/гомодимерный CXCR4 на клеточной поверхности. В частном варианте осуществления изобретения, целевая группа представляет собой антитело, его фрагмент или производное, как описано выше. "Активная группа", как применяется в данном документе, представляет собой агент, который позволяет выявлять указанный визуализирующий агент in vivo. Активная группа согласно изобретению включает, в частности, радиоактивные элементы, такие как технеций-99m (^99mTc), медь-67 (Cu-67), скандий-47 (Sc-47), лютеций-177 (Lu-177), медь-64 (Cu-64), иттрий-86 (Y-86) или йод-124 (1-124).

Визуализирующий агент вводится в количестве, эффективном для диагностического применения у млекопитающих, таких как человек, и затем выявлются локализация и накопление визуализирующего агента. Локализация и накопление визуализирующего агента могут быть выявлены с помощью радионуклидной визуализации, радиосцинтиграфии, визуализации методом ядерного магнитного резонанса, компьютерной томографии, позитрон-эмиссионной томографии, компьютерной аксиальной томографии, рентгеновских и магнитно-резонансных визуализирующих методов, определения флуоресценции и определения хемилюминесценции.

"Биологический образец" может быть любым образцом, который может быть взят у субъекта. Такой образец должен позволять определить уровень экспрессии биомаркера по изобретению. Природа образца, таким образом, будет зависеть от природы опухоли. Предпочтительные биологические образцы для определения уровня экспрессии указанных биомаркеров выявлением активированных Akt- или Erk-белков включают такие образцы, как образец крови, образец плазмы или образец лимфы, если рак представляет собой жидкую опухоль. "Жидкими опухолями" в данном описании называются опухоли крови и костного мозга, например, гематологические злокачественные заболевания, такие как лейкемия и множественная миелома. Предпочтительно, биологический образец представляет собой образец крови. Разумеется, такие образцы крови могут быть получены полностью безопасным сбором крови у пациента и, таким образом, делают возможной неинвазивную диагностику фенотипов, отвечающих и не отвечающих на терапию ингибиторами CXCR4.

"Биологический образец", как применяется в данном документе, также включает образцы солидного рака от исследуемого пациента, где рак представляет собой солидный рак. Такие образцы солидного рака позволяют квалифицированному лицу выполнить любой тип измерений уровня биомаркера по изобретению. В некоторых случаях способы согласно изобретению могут дополнительно включать предварительный этап взятия образца солидного рака у пациента. "Образцом солидного рака" в данном описании называется образец ткани опухоли. Даже у пациентов, страдающих раком, ткани, являющиеся участком опухоли, по-прежнему включают неопухолевую здоровую ткань. Таким образом, "образец рака" должен быть ограничен до опухолевой ткани, взятой у пациента. Указанный "образец рака" может представлять собой биоптат или образец, взятый при хирургической (резекционной) терапии.

Согласно одному аспекту, образец от пациента, представляет собой раковую клетку или раковую ткань.

Этот образец может быть взят и, если необходимо, подготовлен согласно способам, известным лицу, квалифицированному в данной области.

Раковая клетка или раковая ткань в настоящем изобретении не являются частично ограниченными.

Как применяется в данном документе, термин "рак" относится или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое типично характеризуется нерегулируемой пролиферацией клеток. Термины "рак" и "раковый", как они применяются в данном описании, охватывают все стадии заболевания. Таким образом, "рак", как он применяется в данном документе, может включать как доброкачественные, так и злокачественные опухоли. Примеры рака включают, без ограничения, карциному, бластому, саркому и лейкемию или лимфоидные злокачественные опухоли. Более конкретно, рак, согласно настоящему изобретению, выбран из группы, включающей плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легких, включая мелкоклеточный рак, немелкоклеточный рак, аденокарциному легких или плоскоклеточную карциному легких, перитонеальный рак, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, включая желудочно-кишечный рак и желудочно-кишечный стромальный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевыводящих путей, гепатому, рак груди, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, анальную карциному, карциному пениса, меланому, поверхностно-распространяющуюся меланому, меланому типа злокачественного лентиго, акральные лентигинозные меланомы, узловые меланомы, множественную миелому и β-клеточную лимфому (включая высокодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ); малую лимфоцитарную неходжкинскую лимфому; среднедифференцированную фолликулярную неходжкинскую лимфому; среднедифференцированную диффузную неходжкинскую лимфому; низкодифференцированную иммунобластную неходжкинскую лимфому; низкодифференцированную лимфобластную неходжкинскую лимфому; низкодифференцированную мелкоклеточную лимфому с нерассеченными ядрами; неходжкинскую лимфому с генерализованной лимфаденопатией; мантийно-клеточную лимфому; СПИД-связанную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема; хроническую лимфоцитарную лейкемию (ХЛЛ); острую лимфобластную лейкемию (ОЛЛ); волосатоклеточную лейкемию; хроническую миелобластную лейкемию (ХМЛ); острую миелобластную лейкемию (ОМЛ); и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (ПТЛН), а также аберрантную сосудистую пролиферацию, связанную с факоматозами, отек (такой как отек, связанный с опухолями мозга), синдром Мейгса, рак головного мозга, а также рак головы и шеи и связанные метастазы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанный рак выбран из рака простаты, остеосаркомы, рака легких, рака груди, рака эндометрия, лейкемии, лимфомы, множественной миеломы, рака яичника, рака поджелудочной железы и рака толстого кишечника В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанный рак включает клетку лимфомы, клетку лейкемии или клетку множественной миеломы.

Уровень экспрессии мономера и/или гомодимера CXCR4 преимущественно сравнивается с или измеряется по отношению к уровням в контрольной клетке или образце, также обозначаемому как "референтный уровень" или "референтный уровень экспрессии". "Референтный уровень", "референтный уровень экспрессии", "контрольный уровень" и "контроль" применяются в настоящем описании взаимозаменяемо. Как применяется здесь, "контрольный уровень" означает отдельный базовый уровень, измеренный в сопоставимой контрольной клетке, которая в общем случае не является больной или раковой. Она может быть от того же индивидуума, или от другого индивидуума, который является здоровым или не проявляет того же заболевания, что и индивидуум, у которого получен исследуемый образец. В контексте настоящего изобретения, термин "референтный уровень" означает "контрольный уровень" экспресии мономерного/гомодимерного CXCR4, применяемый для оценки исследуемого уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4 в содержащем раковую клетку образце от пациента.

Например, когда уровень мономера и/или гомодимера CXCR4 в биологическом образце у пациента выше, чем референтный уровень мономера и/или гомодимера CXCR4, клетки будут признаны имеющими высокий уровень экспрессии мономера и/или гомодимера CXCR4, или гиперэкспрессирующими мономер и/или гомодимер CXCR4.

Референтный уровень может быть определен множеством способов. Уровни экспрессии могут, таким образом, определять число клеток, экспрессирующих мономерный/гомодимерный CXCR4. В качестве альтернативы, уровни экспрессии могут определять уровень экспресии указанного мономерного/гомодимерного CXCR4 независимо от числа клеток, экспрессирующих мономерный/гомодимерный CXCR4.

Таким образом, референтный уровень для каждого пациента может быть задан референтным отношением мономерного/гомодимерного CXCR4, где референтное отношение может быть определено любыми способами определения референтных уровней, описанными ниже.

Например, контроль может представлять собой заранее заданное значение, которое может принимать множество форм. Он может представлять собой отдельную критическую величину, такую как медиана или среднее. "Референтный уровень" может представлять собой единичное число, в равной мере определяемое для каждого пациента индивидуально, или референтный уровень может меняться в зависимости от специфических субпопуляций пациентов. Таким образом, например, более пожилые люди могут иметь иной референтный уровень, чем более молодые люди, для того же типа рака, а женщины могут иметь иной референтный уровень, чем мужчины, для того же типа рака. В качестве альтернативы, "референтный уровень" может быть определен измерением уровня экспрессии мономера и/или гомодимера CXCR4 в неонкогенных раковых клетках из той же ткани, что и ткань исследуемых неопластических клеток. Точно так же "референтный уровень" может представлять собой определенное отношение мономера и/или гомодимера CXCR4 в неопластических клетках пациента к мономеру и/или гомодимеру CXCR4 в неопухолевых клетках того же пациента. "Референтный уровень" может также представлять собой уровень мономера и/или гомодимера CXCR4 культивируемых in vitro клеток, которые могут быть подвергнуты манипуляциям таким образом, чтобы стимулировать опухолевые клетки, или любым другим способом, который дает уровень экспрессии, точно определяющий референтный уровень. С другой стороны, "референтный уровень" может быть установлен на основе сравения групп, таких как группы, не имеющие повышенных уровней мономерного/гомодимерного CXCR4, и группы, имеющие повышенные уровни мономерного/гомодимерного CXCR4. Другим примером групп сравнения могли бы быть группы, имеющие конкретное заболевание, состояние или симптомы, и группы, не имеющие заболевания. Заранее заданные уровни могут быть упорядочены по группам, например, если исследуемая популяция разделена равным (или неравным) образом на группы, такие как группа низкого риска, группа среднего риска и группа высокого риска.

Референтный уровень может быть также определен с помощью сравнения уровней мономера и/или гомодимера CXCR4 в популяциях пациентов, имеющих тот же рак. Это может быть суммировано, например, с помощью анализа гистограммы, где отдельная когорта пациентов графически представлена и где первая ось представляет уровень мономера и/или гомодимера CXCR4, а вторая ось представляет число пациентов в когорте, у которых опухолевые клетки экспрессируют CXCR как мономер и/или гомодимер на данном уровне. Две или более отдельные группы пациентов могут быть определены с помощью идентификации подмножеств популяций когорты, имеющих одинаковые или сходные уровни мономера и/или гомодимера CXCR4. Затем может быть выполнено определение референтного уровня на основе уровня, наилучшим образом различающего эти отдельные группы. Референтный уровень может также представлять собой уровень двух или более маркеров, одним из которых является мономерный/гомодимерный CXCR4. Два или более маркера могут быть представлены отношением уровней каждого из маркеров.

Аналогичным образом, явно здоровая популяция будет иметь иной ‘нормальный’ диапазон, чем популяция, известная в качестве популяции, имеющей состояние, связанное с экспрессией мономера и/или гомодимера CXCR4. Соответственно, выбранный заранее заданный уровень может принимать во внимание категорию, в которую попадает индивидуум. Соответствующие диапазоны и категории могут быть выбраны лицом, обладающим обычными познаниями в данной области, не более чем рутинным экспериментированием. Под "повышенным", "увеличенным" здесь понимается уровень, высокий по сравнению с выбранным контролем. В типичном случае, контроль будет основываться на практически здоровых индивидуумах в соответствующей возрастной категории.

Будет также понятно, что контроли согласно изобретению могут представлять, в дополнение к заранее заданным значениям, образцы или материалы, исследуемые параллельно с экспериментальными материалами. Примеры включают ткани или клетки, полученные в то же время у того же субъекта, например, части отдельной биопсии или части отдельного клеточного образца у субъекта.

В другом варианте осуществления изобретения, изобретение относится к фармацевтической композиции для in vivo визуализации онкогенных нарушений, связанных с экспрессией мономера и/или гомодимера CXCR4, где указанная композиция включает моноклональное антитело по изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, где указанное антитело, его фрагмент или производное являются меченными и способны in vivo к связыванию мономера и/или гомодимера CXCR4, а также фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте, настоящее изобретение предоставляет набор, применимый для описанных выше способов, где указанный набор включает антитело по изобретению.

Упаковочные материалы включают комбинацию заданных количеств реагентов с инструкцией по выполнению диагностического анализа, т.е. наборы также входят в объем изобретения. Набор содержит антитела для выявления и количественного определения in vitro мономерного/гомодимерного CXCR4, например, в энзим-связанном иммуносорбентном анализе или вестерн-блот исследовании. Антитело по настоящему изобретению может быть приведено в наборе для выявления и количественного определения in vitro мономерного/гомодимерного CXCR4, например, в энзим-связанном иммуносорбентном анализе или вестерн-блот исследовании. Если антитело является меченным ферментом, набор будет включать субстраты и кофакторы, необходимые для фермента (например, предшественники субстрата, обеспечивающие детектируемый хромофор или флуорофор). Дополнительно могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или лизирующий буфер) и другие. Такой набор может включать емкость, разделенную на отсеки таким образом, чтобы получить один или несколько контейнеров, такие как флаконы, пробирки и. т.п., содержащие отдельные элементы изобретения. Например, один контейнер может содержать первое антитело, связанное с нерастворимым или частично растворимым носителем. Второй контейнер может содержать растворимое, меченное детектируемой меткой второе антитело, в лиофилизованной форме или в растворе. Емкость может также содержать третий контейнер, содержащий меченное детектируемой меткой третье антитело в лиофилизованной форме или в растворе. Набор такой природы может использоваться в сэндвич-анализе по изобретению. Надпись или вкладыш в упаковку могут предоставлять описание композиции, а также инструкции по предназначенному применению in vitro и в диагностических целях. Реагенты могут быть даны в виде сухих порошков, обычно лиофилизованных, включая эксципиенты, которые при растворении будут обеспечивать раствор реагента, имеющий соответствующую концентрацию.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретения, изобретения, моноклональные антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, или производные, как они определены в данном документе, являются меченными детектируемым веществом, так что они могут быть упакованы и применены, например, в наборах для диагностики или идентификации клеток, имеющих вышеупомянутый антиген. Неограничивающие примеры таких меток включают флуорофоры, такие как флуоресцеин изотиоцианат; хромофоры, радионуклиды, биотин и ферменты. Такие меченные антитела или связывающие фрагменты могут применяться, например, для гистологической локализации антигена, твердофазного иммуноферментного анализа, клеточного сортинга, также как и для других иммунологических техник для выявления или количественного определения мономерного/гомодимерного CXCR4 и клеток, несущих этот антиген.

Изобретение также включает наборы, где антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное являются меченными.

Также предоставлены наборы для применения в качестве позитивного контроля для очистки или образования иммунопреципитатов мономерного/гомодимерного CXCR4 из клеток. Для выделения и очистки мономерного/гомодимерного CXCR4 набор может содержать описанное здесь антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент или производное, сцепленные с гранулами (например, с сефарозными гранулами). Могут быть предоставлены наборы, которые содержат антитела для in vitro или ex vivo выявления и количественного определения мономерного/гомодимерного CXCR4, например, в вестерн-блоттинге или в энзим-связанном иммуносорбентном анализе. Набор включает контейнер, надпись и вкладыш, вложенный в контейнер или присоединенный к нему. Контейнер содержит композицию, включающую по меньшей мере одно антитело по изобретению, его антигенсвязывающий фрагмент или производное. Могут быть включены дополнительные контейнеры, которые содержат, например, растворители, буферы, контрольные антитела., его антигенсвязывающий фрагмент или производное Надпись или вкладыш в упаковку могут предоставлять описание композиции, а также инструкции по предназначенному примению in vitro или диагностическому применению.

Конкретнее, изобретение относится к набору для определения мономерного/гомодимерного CXCR4-статуса опухоли любыми методами, известными человеку, квалифицированному в данной области. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, как это будет описано в экспериментальных примерах, изобретение относится к набору для определения мономерного/гомодимерного CXCR4-статуса опухоли иммуногистохимическими методами или с помощью активированного флуоресценцией клеточного сортинга.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, набор по изобретению включает по меньшей мере антитело против мономерного/гетеродимерного CXCR4, или его антигенсвязывающий фрагмент, или производное, как описано выше, где указанное антитело, предпочтительно, является меченным.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, набор для выявления наличия и/или локализации у субъекта опухоли, экспрессирующей мономерный/гомодимерный CXCR4, дополнительно включает реагент для выявления степени связывания между указанным анти-СХСР4 антителом и мономерным/гомодимерным CXCR4.

Набор согласно изобретению может дополнительно включать реагент для количественного определения уровня связывания между указанным антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, или производным, и мономерным/гомодимерным CXCR4.

В еще одном другом варианте осуществления изобретения, набор согласно изобретению дополнительно включает позитивный и негативный контрольные образцы [позитивный и негативный контроли] для оценки в баллах уровня экспрессии мономерного/гомодимерного CXCR4.

Указанный набор может дополнительно включать поликлональное антитело, специфически распознающее мышиные антитела. Преимуществнно, указанное поликлональное антитело является меченным.

Другие характеристики и преимущества изобретения ясны из продолжения описания с примерами и фигурами, легенды которых приведены ниже.

Фигура 1 показывает, что моноклональное антитело 427аВ1 распознает и мономеры, и гомодимеры CXCR4 в клеточных лизатах.

Фигуры 2А и 2В показывают, что моноклональное антитело 427аВ1 образует иммунопреципитаты как с мономерами, так и с гомодимерами CXCR4. Фигуры 3А, 3В, 3С, 3D и 3Е показывают, что, по данным активированного флуоресценцией клеточного сортинга, моноклональное антитело 427аВ1 распознает CXCR4 на клеточной мембране.

Фигуры 4А и 4В показывают, что, по данным активированного флуоресценцией клеточного сортинга, моноклональное антитело 427аВ1 связывается с CXCR4 на клеточной мембране даже в присутствии анти-СХСР4 терапевтического моноклонального антитела 515Н7.

Фигура 5 показывает, что моноклональное антитело 427аВ1 не модулирует конформацию гетеродимеров CXCR4/CXCR2.

Фигура 6 показывает, что моноклональное антитело не влияет на модель роста ксенотрансплантата опухоли MDA-MB-231 у Nod/Scid мышей.

Фигура 7 показывает: а) иммуногистохимическое окрашивание RAMOS с применением m427аВ1 и b) иммуногистохимическое окрашивание RAMOS с применением mIgG1.

Фигура 8 показывает: а) иммуногистохимическое окрашивание ксенотрансплантатных опухолей KARPAS299 с применением 427аВ1 и b) иммуногистохимическое окрашивание ксенотрансплантатных опухолей KARPAS299 с применением mIgG1.

Пример 1: Получение анти-СХСР4 моноклонального антитела (MAT) 427аВ1 (F50067-006(5C) 427аВ1 cl1B, номер I-4018 в Национальной коллекции культур микроорганизмов).

Для получения моноклональных антител к CXCR4 мыши Balb/c были иммунизированы рекомбинантными клетками NIH3T3-CXCR4 и/или пептидами, соответствующими экстрацеллюлярному М-концу и петлям CXCR4. Мыши возрастом 6-16 недель на момент первой иммунизации были один раз подкожно (п.к.) иммунизированы антигеном в полном адъюванте Фрейнда, с последующими 2-6 иммунизациями антигеном в неполном адъюванте Фрейнда (подкожно). Мониторинг иммунного ответа осуществляли с помощью ретроорбитальных кровопусканий. Сыворотку исследовали энзим-связанным иммуносорбентным анализом, как описано ниже, и мышей с более высокими титрами анти-CXCR4 антител использовали для слияний. Мышам вводили внутривенную бустер-инъекцию антигена за два дня до умервщления и изъятия селезенки.

- Энзим-связанный иммуносорбентный анализ

Чтобы выбрать мышей, продуцирующих анти-CXCR4 антитела, сыворотку от иммунизированных мышей исследовали энзим-связанным иммуносорбентным анализом. Вкратце, микротитрационные планшеты покрывали очищенным N-концевым [аминокислотные остатки 1-41] пептидом, конъюгированным с бычьим сывороточным альбумином (5 мкг эквивалента пептида/мл, 100 мкл/лунку) инкубировали при 4°С в течение ночи, затем блокировали 0,5% желатином в фосфатном солевом буфере (250 мкл/лунку). Разведения плазмы от CXCR4-иммунизированных мышей добавляли к каждой лунке и инкубировали 2 часа при 37°С. Планшеты промывали фосфатным солевым буфером и затем инкубировали с козьим антителом против иммуноглобулинов IgG мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена (Jackson Laboratories) в течение 1 часа при 37°С. После промывания планшеты инкубировали с субстратом ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), реакцию останавливали через 5 минут после добавления 1 М H₂SO₄ (100 мкл/лунку). Мышей, которые выработали наиболее высокие титры анти-CXCR4 антител, использовали для выработки антитела.

- Получение гибридом, продуцирующих антитела к CXCR4

Мышиные спленоциты, выделенные у мышей Balb/c, выработавших самые высокие титры анти-CXCR4 антител, сливали с клетками мышиной миеломы линии Sp2/O с помощью полиэтиленгликоля. Затем клетки высеивали в микротитрационные планшеты (примерно 1×10⁵ клеток/лунку) с последующей двухнедельной инкубацией в селективной среде, содержащей среду UltraCULTURE, с добавлением 2 ммоль/л L-глютамина, 1 ммоль/л натрия пирувата и 1× и 1×гипоксантин-аминоптеринтимидиновой среды. Затем планшеты исследовали энзим-связанным иммуносорбентным анализом на анти-CXCR4 моноклональные антитела (IgG). Гибридомы, секретирующие антитело, затем субклонировали по меньшей мере дважды серийным разведением, культивировали in vitro, чтобы получить антитело для дальнейшего анализа.

Пример 2: Моноклональное антитело 427аВ1 распознает и мономеры, и гомодимеры CXCR4 в клеточных лизатах.

Трансфицированные клетки NIH3T3-hCXCR4, раковые клетки MDA-MB-231 (рак груди) и U937 (острая миелоидная лейкемия) дважды промывали в фосфатном солевом буфере. Затем 100*10⁶ клеток/мл подвергали лизису в течение 30 минут при 4°С с применением следующего буфера: 20 ммоль/л трис-HCl (pH 8.5), 100 ммоль/л (NH₄)₂SO₄, 10% глицерина, 1% 3-[(3-хлорамидопропил)диметиламмонио]-2-гидрокси-1-пропансульфоната и 1% смеси ингибиторов протеазы. Клеточный лизат собирали центрифугированием в течение 20 минут при 10000 об./мин. и +4°С и анализировали вестерн-блоттингом, применяя моноклональное антитело 427аВ1 как первичное антитело. Фигура 1 показывает, что моноклональное антитело 427аВ1 распознает и мономеры, и гомодимеры CXCR4 в NIH3T3-CXCR4. Линии раковых клеток MDA-MB-231 и U937, по-видимому, экспрессируют CXCR4 в основном в виде гомодимеров.

Пример 3: Моноклональное антитело 427аВ1 образует иммунопреципитаты как мономеров, так и гомодимеров CXCR4.

Конгломераты клеток NIH3T3-CXCR4 промывали трис-гидрохлоридом (20 мМ, pH 8,5), содержащим 100 мМ (NH₄)₂SO₄, затем суспендировали в лизирующем буфере (20 мМ трис гидрохлорид, pH 8,5, содержащий 100 мMNH4)₂SO₄, 10% глицерина, 1% 3-[(3-хлорамидопропил)диметиламмонио]-2-гидрокси-1-пропансульфоната и коктейль ингибиторов протеазы (10 мкл/мл)). Клетки разрушали гомогенизатором Potter Elvehjem. Солюбилизированные мембраны собирали центрифугированием при 105000 g при +4°С в течение 1 часа, затем инкубировали в течение ночи при +4°С с нагруженными антителом 427аВ1 гранулами сефарозы, смесь заливали в стеклянную колонну 4В и промывали лизирующим буфером. Белки, захваченные моноклональным антителом 427аВ1, элюировали и анализировали вестерн-блоттингом, используя моноклональное антитело 427аВ1 в качестве первичного антитела. Целевые фракции собирали, концентрировали и использовали как для вестерн-блоттинг анализа, так и для препаративного разделения методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в 4-12% бис-трис геле). После окрашивания серебром целевые полосы вырезали из геля и подвергали расщеплению в геле, используя автоматизированную систему расщепления белков, установку MassPREP (Waters, Милфорд,, Массачусетс, США). Пятна геля дважды промывали 50 мкл 25 мМ NH₄HCO₃ (Сигма, Стейнхайм, Германия) и 50 мкл ацетонитрила (Карло Эрба Реактифс-SDS, Вал де Риль, Франция). Цистеиновые остатки восстанавливали при 60°С в течение 1 часа с помощью 50 мкл 10 мМдитиотреитола, приготовленного в 25 мМ NH₄HCO₃ и алкилировали при комнатной температуре в течение 20 минут с помощью 50 мкл 55 мМ йодоацетамида (Сигма), приготовленного в 25 мМ NH₄HCO₃. После дегидратации пятен геля в ацетонитриле белки расщепляли в геле в течение ночи, добавляя 10 мкл 12,5 нг/мкл модифицированного свиного трипсина (Promega, Мэдисон, Виннипег, США) в 25 мМ NH₄HCO₃ при комнатной температуре. Полученные пептиды экстрагировали 35 мкл 60% ацетонитрила, содержащего 5% муравьиной кислоты (Riedel-de Haёn, Seeize, Дания), с последующим удалением избытка ацетонитрила и подвергали нано-жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии. Массив данных, собранных при проведении анализа методом нано-жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии, обрабатывали и конвертировали в файлы *.mgf, чтобы направить в поисковую машину MASCOT™. Поиски выполняли с допуском измерения 0,25 Да в режимах масс-спектрометрии и тандемной масс-спектрометрии. Фигура 2А показывает вестерн-блот анализ элюированных концентрированных фракций, полученных в результате иммунопреципитации с использованием гранул сефарозы, нагруженных моноклональным антителом 427аВ1. Три полосы с кажущимися молекулярными весами 37-43, 75 и 150 кДа были распознаны с помощью моноклонального антитела 427аВ1.

Элюированную концентрированную фракцию после иммунопреципитации с использованием гранул сефарозы, нагруженных моноклональным антителом 427аВ1, разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и визуализировали с помощью окрашивания серебром. Полосы при 37-43, 75 и 150 кДа вырезали из геля (Фигура 2В), расщепляли трипсином и анализировали с помощью жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией, как описано выше. Собранный список пиков был направлен в Mascot™ для поиска по базе пептидных последовательностей. CXCR4 был идентифицирован во всех полосах:

В полосе 37-43 кДа (полоса номер 1) было идентифицировано 6 пептидов CXCR4 посредством поисковой машины MASCOT™: пептид EENANFNK (аминокислотные остатки 31-38), содержащийся на N-конце; пептид YLAIVHATNSQR (аминокислотные остатки 135-146) и пептид YLAIVHATNSQRPR (аминокислотные остатки 135-148), и пептид 184-188 YICDR (аминокислотные остатки 184-188), содержащиеся в экстрацеллюлярной петле 2; пептид QGCEFENTVHK (аминокислотные остатки 272-282), содержащийся в экстрацеллюлярной петле 3, и пептид TSAQHALTSVSR (аминокислотные остатки 311-322), содержащийся на С-конце.

Полоса 75 кДа (полоса номер 2) содержала пять пептидов CXCR4: пептид EENANFNK (аминокислотные остатки 31-38), содержащийся на N-конце CXCR4; пептид YLAIVHATNSQR (аминокислотные остатки 31-38), содержащийся в интрацеллюлярной петле 2; пептид YLAIVHATNSQRPR (аминокислотные остатки 135-148), содержащийся в интрацеллюлярной петле 2; пептид QGCEFENTVHK (аминокислотные остатки 272-282), содержащийся в экстрацеллюлярной петле 3, и пептид TSAQHALTSVSR (аминокислотные остатки 311-322), содержащийся на С-конце. Указанные пептиды были идентифицированы посредством поисковой машины MASCOT™.

В полосе 150 кДа (полоса номер 3) было идентифицировано два пептида посредством поисковой машины MASCOT™: пептид EENANFNK (аминокислотные остатки 31-38), содержащийся на N-конце, и 311-322 пептид TSAQHALTSVSR (аминокислотные остатки 311-322), содержащийся на С-конце.

Результаты, полученные в этом исследовании, ясно показывают, что моноклональное антитело 427аВ1 образует иммунопреципитаты с CXCR4. Вдобавок, моноклональное антитело 427аВ1 распознает CXCR4 как в виде мономера, так и в виде гомодимера.

Пример 4: Моноклональное антитело 427аВ1 распознает CXCR4, локализованный на клеточной мембране, по данным анализа методом активированного флуоресценцией клеточного сортинга.

В этом эксперименте специфическое связывание моноклонального антитела 427аВ1 с человеческим CXCR4 изучали с помощью FACS-анализа (активированного флуоресценцией клеточного сортинга). Линии раковых клеток NIH3T3, NIH3T3-hCXCR4 (трансфицированные клетки), MDA-MB-231, Hela, HT-29 и U937 инкубировали с моноклональным антителом 427аВ1 (0-10 мкг/мл). Затем клетки промывали 1% бычьим сывороточным альбумином/ фосфатным солевым буфером/ 0,01% азидом натрия. Затем к клеткам добавляли меченные Alexa™ вторичные антитела и оставляли для инкубирования при 4°С в течение 20 минут. Затем клетки вновь дважды промывали. После второго промывания выполняли анализ методом активированного флуоресценцией клеточного сортинга.

Результаты этих исследований связывания представлены на Фигуре 3. Они показывают, что 427аВ1 связывается с человеческими трансфицированными клетками линии CXCR4-NIH3T3 (Фигура 3А), но не с родительскими клетками NIH3T3 (данные не показаны). Это моноклональное антитело также было способно распознавать линии человеческих раковых клеток, например, клетки рака толстой кишки HT-29 (Фигура 3В), клетки рака груди MDA-MB-231 (Фигура 3С), промиелоцитарные раковые клетки (Фигура 3D) и клетки рака шейки матки Hela (Фигура 3Е), позволяя предположить, что эти клеточные линии в норме экспрессируют мономеры и/или гомодимеры CXCR4.

Пример 5: Моноклональное антитело 427аВ1 Mab связывается с CXCR4 на клеточной мембране даже в присутствии терапевтического моноклонального анти-CXCR4 антитела 515Н7 (по данным FACS-анализа).

В данном эксперименте исследовали методом активированного флуоресценцией клеточного сортинга (FACS-анализ) конкурентное связывание анти-СХСР4 моноклональных антител 427аВ1 и 515Н7 с человеческим CXCR4.

Трансфицированные клетки NIH3T3-hCXCR4 вначале инкубировали с биотинилированным моноклональным антителом 515Н7 (5 мкг/мл), которое распознает клетки NIH3T3-CXCR4 (Фигура 4А), а затем - как с моноклональным антителом 427аВ1, так и с моноклональным антителом 515Н7 (0-1 мг/мл) в течение 1 часа при 4°С. Затем клетки промывали 1% бычьим сывороточным альбумином / фосфатным солевым буфером / 0,01% азидом натрия. После этого к клеткам добавляли меченный стрептавидин и инкубировали при 4°С в течение 20 минут перед следующей парой промываний. После второго промывания выполняли анализ методом активированного флуоресценцией клеточного сортинга. Результаты этих исследований связывания представлены на Фигуре 4В и показывают, что анти-CXCR4 моноклональное антитело 427аВ1 связывается с человеческими CXCR4-NIH3T3 трансфицированными клетками даже в присутствии моноклонального антитела 515Н7. Напротив, присутствие биотинилированного моноклонального антитела 515Н7, как и ожидалось, ингибировало связывание немеченного моноклонального антитела 515Н7 с CXCR4.

Пример 6: Моноклональное антитело 427аВ1 не модулирует конформацию гетеродимеров CXCR4/CXCR2 по данным BRET-анализа.

Это функциональное исследование позволяет оценить конформационные изменения, индуцированные SDF-1 и/или связыванием моноклонального антитела 427аВ1 с рецептором CXCR4, на уровень гетеродимера CXCR2/CXCR4.

Экспрессионные векторы для каждого из исследуемых партнеров взаимодействия были сконструированы как белки слияния с соответствующим красителем (люцифераза Renilla reniformis (Rluc) и желтый флуоресцентный белок (YFP)) с использованием традиционных молекулярно-биологических техник. За два дня до проведения BRET клетки HEK293 были временно трансфицированы экспрессионными векторами, кодирующими соответствующие партнеры BRET, CXCR4-Rluc и CXCR4-YFP. На следующий день клетки распределяли по 96 покрытым полилизином белым MW чашкам Петри на полную культуральную среду [минимальная среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко, дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой]. Клетки вначале культивировали при 37°С с 5% CO₂, чтобы обеспечить клеточную адгезию к чашкам Петри. Затем клетки подвергали голоданию в течение ночи с 200 мкл среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко, на лунку. Непосредственно перед проведением эксперимента BRET минимальную эссенциальную среду Игла, модифицированную по способу Дульбекко, удаляли, и клетки быстро промывали фосфатным солевым буфером. Затем клетки инкубировали в течение 15 минут при 37°С в фосфатном солевом буфере в присутствии или в отсутствие антитела, перед добавлением 5 мкМ целентеразина Н с или без SDF-1, до итогового объема 50 мкл. После инкубации в течение 5 минут при 37°С и дальнейшей инкубации в течение 20 минут при комнатной температуре, инициировали обнаружение светового излучения при 485 нм и 530 нм, используя многофункциональный анализатор Mithras LB940 (Berthold) (1 сек./длину волны/лунку; 15-кратный повтор при комнатной температуре).

Вычисление отношения BRET выполняли, как описано ранее (Angers и соавт., 2000): [(эмиссия_{530 нм})-(эмиссия_{485 нм})×Cf]/(эмиссия_{485 нм}), где Cf=(эмиссия_{530 нм})/(эмиссия_{485 нм}), для клеток, экспрессирующих в тех же экспериментальных условиях один лишь белок слияния Rluc. Упрощение этого уравнения показывает, что отношение BRET соответствует отношению 530/485 нм, полученному, когда оба партнера BRET присутствуют, с поправкой на отношение 530/480 нм, полученное в тех же условиях эксперимента, когда только один партнер, слитый с Rluc, представлен в анализе. Для удобства чтения результаты представлены в виде процента от основного сигнала.

SDF1 (300 нмоль/л) уменьшал примерно на 20% BRET-сигнал, полученный в результате пространственной близости CXCR4 и CXCR2 рецепторов. Это, вероятно, указывает на образование гетеродимеров CXCR4/CXCR2 или на конформационные изменения предсуществующих димеров (Фигура 5). Моноклональное антитело 427аВ1 не модулировало индуцированные SDF-1 конформационные изменения гетеродимеров CXCR2/CXCR4 и не модулировало пространственную близость CXCR4/CXCR2. Это показывает, что моноклональное антитело 427аВ1 не влияет на конформацию гетеродимеров CXCR4/CXCR2 (Фигура 5).

Пример 7: Оценка активности моноклонального антитела 427аВ1 на модели роста ксенотрансплантата опухоли MDA-MB-231 у мышей с сочетанным аутоиммунным диабетом и тяжелым комбинированным иммунодефицитом [NOD/SCID-мышей].

Целью этого эксперимента было оценить ингибиторную активность анти-CXCR4 моноклонального антитела 427аВ1 против MDB-MB-231 ксенотрансплантата у Nod/Scid мышей [мыши с сочетанным аутоиммунным диабетом и тяжелым комбинированным иммунодефицитом].

Клетки MDA-MB-231, полученные из Европейской коллекции культивируемых клеток животных, рутинным образом культивировали в минимальной эссенциальной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (Инвитроджен Корпорейшн, Шотландия, Соединенное Королевство) 10% фетальной телячьей сывороткой (Сигма, Сент-Луис, США). Клетки разделяли за 48 часов до прививки таким образом, чтобы они находились в экспоненциальной фазе роста. Десять миллионов клеток MDA-MB-231 в фосфатном солевом буфере прививали 7-недельным Nod/Scid мышам (Шарль Ривер, Франция). Через 5 дней после имплантации опухоли измеряли (34 мм³³<V³<40 мм³), и животных разделяли на группы по 6 мышей, так, что в каждой группе были животные со сравнимыми размерами опухоли. Мыши были обработаны внутрибрюшинно насыщающей дозой моноклонального антитела 427аВ1 (2 мг/мышь). Затем мышам вводили инъекционно дважды в неделю моноклональное антитело 427аВ1 в дозе 1 мг/мышь. Группу, получавшую фосфатный солевой буфер, вввели в эксперимент в качестве контрольной группы. Объем опухоли измеряли дважды в неделю и вычисляли по формуле □/6 × длина × ширина × высота. Статистический анализ выполняли для каждого измерения с помощью теста Манна-Уитни.

В ходе лечения случаев смерти не было отмечено. По сравнению с контрольной группой, получавшей фосфатный солевой буфер, не наблюдалось существенного ингибирования роста опухоли при D40 (р=0,485) для антитела 427аВ1 в дозе 1 мг. В дополнение к этому, средний объем опухоли через 5 недель лечения моноклональным антителом 427аВ1 не уменьшился (по сравнению с фосфатным солевым буфером (Фигура 6).

Пример 8: Моноклональное антитело 427аВ1 распознает CXCR4, представленный на клеточной мембране (опухоли, фиксированные в парафине, иммуногистохимическое окрашивание).

Срезы депарафинировали, регидратировали и помещали на 5 минут в преднагретый до 98°С ЭДТА (pH 8) для термического восстановления эпитопов и, дополнительно, на 5 минут - в теплый трис-ацетатный буфер. Затем пластины промывали водой из-под крана в течение 5 минут. После 3 промываний трис-буферным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween 20 (TBS-T) (Dako S3006), блокировали эндогенную пероксидазную активность, используя реагент блокирующий пероксидазную активность реагент K4007 фирмы Dako в течение 5 минут. Срезы промывали TBT-S и инкубировали в блокирующем реагенте (UltraV block-TA-125UB- LabVision) в течение 5 минут перед инкубированием в течение ночи при 4°С с анти-CXCR4 мышиным моноклональным антителом (5 мкг/мл, клон 427аВ1, Пьер Фабре) или с мышиным IgG1κ (5 мкг/мл, Х0931, Dako) в качестве изотипического контроля. Срезы промывали TBS-T и инкубировали с реагентом для иммуногистохимического определения увеличения сигнала (SignalStain Boost) (пероксидаза хрена, HRP, М) в течение 30 минут при комнатной температуре. Для увеличения [выхода] бурого продукта реакции использовали диаминобензидин (Dako К3468). Пластины погружали в гематоксилин на 4 минуты для контрастного окрашивания (Dako S3309) и промывали в фосфатном солевомбуфере перед заливкой заливочной средой Paramount и покрытием покровным стеклом. В этой иммуногистохимической процедуре бурый продукт реакции коррелирует с позитивным окрашиванием клеточной мембраны, а отсутствие бурого продукта коррелирует с негативным окрашиванием и отсутствием визуализации клеточной мембраны.

Моноклональное антитело 427аВ1 по-разному окрашивает клеточные мембраны различных типов опухолей. Фигуры 7 и 8 иллюстрируют окрашивание, выполненное на двух ксенографтных моделях, для которых была описана противоопухолевая активность терапевтического анти-CXCR4 антитела hz515H7: RAMOS и KARPAS299.

Как показано на Фигурах 7 и 8, для KARPAS299 (Фигура 8) выявлена более низкая экспрессия, чем для RAMOS (Фигура 7). Эти данные прекрасно коррелируют с исследованием экспрессии CXCR4 с помощью проточной цитометрии. Действительно, клетки RAMOS экспрессируют примерно в 5 раз больше CXCR4, чем KARPAS299 (связывающая способность антитела составляет 200000 для RAMOS и 40 ООО для KARPAS299). Мембранное окрашивание слабее для KARPAS299 (Фигура 8), тогда как для RAMOS мембранное окрашивание существенно сильнее (Фигура 7).

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу, специфически связывающемуся с CXCR4, и его антигенсвязывающему фрагменту, нуклеиновой кислоте, кодирующей вышеуказанное антитело или его фрагмент, вектору, клетке-хозяину, содержащим вышеуказанную нуклеиновую кислоту, а также способу получения указанного антитела или его фрагмента. Также раскрыта мышиная гибридома, депонированная в Национальной коллекции культур микроорганизмов 25 июня 2008 г. под номером I-4018. Изобретение также относится к способам диагностики с использованием вышеуказанного антитела или его фрагмента, а также к набору для их осуществления. Изобретение позволяет эффективно осуществлять диагностику заболеваний, характеризующихся экспрессией CXCR4. 14 н. и 16 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 8 пр.

1. Антитело, специфически связывающееся с CXCR4 (хемокиновый рецептор 4), или его антигенсвязывающий фрагмент, включающее:

i) тяжелую цепь, включающую следующие три региона, определяющих комплементарность (CDR), соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-H3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3; и

ii) легкую цепь, включающую следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6.

2. Антитело по п. 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело выбрано из:

a) антитела с тяжелой цепью, включающей следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-H3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3; и вариабельный домен легкой цепи, включающий последовательность SEQ ID No. 8;

b) антитела с вариабельным доменом тяжелой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 7, и с легкой цепью, включающей следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6; или

c) антитела с вариабельным доменом тяжелой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 7, и вариабельным доменом легкой цепи, включающим последовательность SEQ ID No. 8.

3. Антитело по п. 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело включает:

а) тяжелую цепь, где указанная тяжелая цепь включает: следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-H1, имеющий последовательность SEQ ID No. 1, CDR-H2, имеющий последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-H3, имеющий последовательность SEQ ID No. 3; и вариабельный домен тяжелой цепи, где указанный вариабельный домен тяжелой цепи имеет последовательность SEQ ID No. 7; и

b) легкую цепь, где указанная легкая цепь включает:

следующие три региона, определяющих комплементарность, соответственно: CDR-L1, имеющий последовательность SEQ ID No. 4, CDR-L2, имеющий последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-L3, имеющий последовательность SEQ ID No. 6; и вариабельный домен легкой цепи, где указанный вариабельный домен легкой цепи имеет последовательность SEQ ID No. 8.

4. Антитело по п. 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело способно к связыванию с мономером и/или гомодимером CXCR4.

5. Антитело по любому из пп. 1-4 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в in vitro или ex vivo диагностике онкогенных нарушений, связанных с экспрессией CXCR4, или для in vitro или ex vivo определения прогноза в отношении развития онкогенного нарушения, связанного с экспрессией CXCR4.

6. Антитело по п. 5 или его антигенсвязывающий фрагмент, отличающееся тем, что указанное онкогенное нарушение представляет собой онкогенное нарушение, связанное с экспрессией мономера и/или гомодимера CXCR4.

7. Антитело по п. 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой мышиное антитело.

8. Антитело по п. 1 или его антигенсвязывающий фрагмент, отличающееся тем, что указанное антитело не обладает какой-либо противоопухолевой активностью in vivo.

9. Мышиная гибридома для секреции антитела по любому из пп. 1-8, где указанная мышиная гибридома депонирована в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Институт Пастера, Париж, Франция) 25 июня 2008 г. под номером I-4018.

10. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8.

11. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 10, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота содержит:

(a) последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID No. 9-14; или

(b) последовательность ДНК, содержащую последовательности SEQ ID No. 15 или 16.

12. Экспрессионный вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п. 10 или 11.

13. Клетка-хозяин для продуцирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8, трансформированная вектором или включающая вектор по п. 12.

14. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8, включающий следующие этапы:

a) культивирование клетки-хозяина по п. 13 в культуральной среде и в надлежащих условиях культивирования и

b) выделение указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуральной среды или из указанных культивируемых клеток.

15. Способ выявления in vitro или ex vivo наличия опухоли, экспрессирующей мономерный и/или гомодимерный CXCR4, у субъекта, включающий следующие этапы:

(a) контактирование биологического образца, полученного у указанного субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-8, или полученным способом по п. 14, или продуцированным гибридомой по п. 9; и

(b) выявление связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с биологическим образцом.

16. Способ in vitro или ex vivo определения процента клеток, экспрессирующих мономер и/или гомодимер CXCR4 в опухоли у субъекта, включающий следующие этапы:

(a) контактирование образца, взятого у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-8, или полученным способом по п. 14, или продуцированным гибридомой по п. 9;

(b) выявление связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с биологическим образцом, обработанном на этапе (а); и

(с) подсчет в образце, обработанном на этапе (а), процента клеток, экспрессирующих мономер и/или гомодимер CXCR4.

17. Способ in vitro или ex vivo определения уровня экспрессии мономера и/или гомодимера CXCR4 в опухоли у субъекта, включающий следующие этапы:

(a) контактирование биологического образца, взятого у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-8, или полученным способом по п. 14, или продуцированным гибридомой по п. 9; и

(b) количественное определение уровня связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с мономерным и/или гомодимерным CXCR4 в биологическом образце, обработанном на этапе (а).

18. Способ по п. 17, где уровень связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с мономерным и/или гомодимерным CXCR4 измеряют с помощью иммуногистохимического исследования (ИГХ) или с помощью активированного флуоресценцией клеточного сортинга, предпочтительно с помощью ИГХ.

19. In vitro или ex vivo способ оценивания опухоли у субъекта как позитивной по мономерному и/или гомодимерному CXCR4 или негативной по мономерному и/или гомодимерному CXCR4, включающий следующие этапы:

(a) контактирование биологического образца от субъекта с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-8, или полученным способом по п. 14, или продуцированным гибридомой по п. 9;

(b) количественное определение уровня связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с мономерным и/или гомодимерным CXCR4 в указанном биологическом образце и

(c) оценивание опухоли у субъекта путем сопоставления количественно определенного уровня связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно соответствующей шкале,

где указанная соответствующая шкала основана на двух параметрах, которые представляют собой интенсивность окрашивания и процент позитивных клеток, и

где указанная соответствующая шкала представляет собой шкалу от 0 до 8, где отсутствие реактивности оценивается как 0, а сильная реактивность в пропорции "67-100%-пропорциональная реактивность" оценивается как 8 и где общий балл 0-2 считается негативным [мономерный и/или гомодимерный CXCR4(-)], а общий балл 3-8 считается позитивным [мономерный и/или гомодимерный CXCR4(+)].

20. In vitro или ex vivo способ оценивания опухоли у субъекта как позитивной по мономерному и/или гомодимерному CXCR4 или негативной по мономерному и/или гомодимерному CXCR4, включающий следующие этапы:

(a) контактирование биологического образца от субъекта с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из пп. 1-8, или полученным способом по п. 14, или продуцированным гибридомой по п. 9;

(b) количественное определение уровня связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с мономерным и/или гомодимерным CXCR4 в указанном биологическом образце и

(c) оценивание опухоли у субъекта путем сопоставления количественно определенного уровня связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно соответствующей шкале,

где указанная соответствующая шкала основана на двух параметрах, которые представляют собой интенсивность окрашивания и процент позитивных клеток, и

где указанная соответствующая шкала представляет собой шкалу от 0 до 3⁺, где отсутствие реактивности мембран опухолевых клеток оценивается как 0, а резко выраженная реактивность, такая как >10% опухолевых клеток, оценивается как 3⁺ и

где баллы 2⁺ или 3⁺ указывают на то, что статус опухоли является позитивным [мономерный и/или гомодимерный CXCR4(+)], а баллы 0 или 1⁺ указывают на то, что статус опухоли является негативным [мономерный и/или гомодимерный CXCR4(-)].

21. Способ in vitro или ex vivo определения эффективности терапевтического режима, разработанного таким образом, чтобы облегчить онкогенное нарушение, связанное с мономерным и/или гомодимерным CXCR4, у субъекта, страдающего от указанного нарушения, при этом указанного субъекта лечат в указанном терапевтическом режиме, включающий следующие этапы:

(а) определение первого уровня экспрессии мономерного и/или гомодимерного CXCR4 по п. 17 или 18 в биологическом образце, полученном у указанного субъекта в первый момент времени;

(b) определение второго уровня экспрессии мономерного и/или гомодимерного CXCR4 по п. 17 или 18 в биологическом образце, полученном у указанного субъекта во второй, более поздний, момент времени;

(c) определение соотношения между уровнем, полученным на этапе (а), и уровнем, полученным на этапе (b); и

(d) определение эффективности указанного терапевтического режима как высокой, если соотношение на этапе (с) больше 1; или

(e) определение эффективности указанного терапевтического режима как низкой, если соотношение на этапе (с) меньше или равно 1.

22. Способ по п. 21, где терапевтический режим разработан таким образом, чтобы облегчить онкогенное нарушение, связанное с мономерным и/или гомодимерным CXCR4 у субъекта, страдающего от указанного нарушения, и включает введение ингибитора CXCR4 указанному субъекту.

23. In vitro или ex vivo способ отбора пациентов, больных мономерным и/или гомодимерным CXCR4-позитивным раком, для которых предсказывают улучшение или его отсутствие в результате введения терапевтического количества ингибитора CXCR4, включающий следующие этапы:

(a) определение уровня экспрессии мономерного и/или гомодимерного CXCR4 у указанного пациента согласно способу по п. 17 или 18;

(b) определение референтного уровня экспрессии мономерного и/или гомодимерного CXCR4 у здоровых индивидуумов согласно способу по п. 17 или 18; и

(c) определение соотношения уровня, полученного на этапе (а), и уровня, полученного на этапе (b); и

(d) отбор пациента как такого, для которого предсказывают улучшение в результате введения терапевтического количества ингибитора CXCR4, если соотношение на этапе (с) составляет больше 1; или

(e) отбор пациента как такого, для которого не предсказывают улучшение в результате введения терапевтического количества ингибитора CXCR4, если соотношение на этапе (с) меньше или равно 1.

24. Способ по п. 22 или 23, где указанный ингибитор CXCR4 представляет собой моноклональное антитело, секретируемое гибридомой, депонированной в Национальной коллекции культур микроорганизмов (Институт Пастера, Париж, Франция) 25 июня 2008 г. под номером I-4018.

25. Набор для выявления мономерного и/или гомодимерного CXCR4 in vitro, включающий, по меньшей мере, антитело, специфически связывающееся с CXCR4 (хемокиновый рецептор 4), или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, или полученное способом по п. 14, или продуцируемое гибридомой по п. 9, и инструкцию по предназначенному применению in vitro.

26. Набор по п. 25, отличающийся тем, что указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является меченным.

27. Набор по любому из пп. 25 или 26, дополнительно включающий реагент для выявления степени связывания между указанным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и мономерным и/или гомодимерным CXCR4.

28. Набор по п. 25, дополнительно включающий реагент для количественного определения уровня связывания между указанным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и мономерным и/или гомодимерным CXCR4.

29. Набор по п. 25, дополнительно включающий позитивный и негативный контрольные образцы для оценки в баллах уровня экспрессии мономерного и/или гомодимерного CXCR4.

30. Набор по п. 29, дополнительно включающий поликлональное антитело, специфически распознающее мышиные антитела, где указанное поликлональное антитело предпочтительно является меченным.