СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СЫВОРОТКИ К АНТИГЕНАМ ВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА BACILLUS ANTHRACIS Российский патент 2005 года по МПК A61K39/07 A61K39/40 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения иммунных сывороток от животных, зараженных вирулентным штаммом В.anthracis.

Известно, что морские свинки высокочувствительны к возбудителю сибирской язвы и погибают в течение короткого времени (3-4 суток) после заражения. Поэтому для изучения динамики антител или специфической антигенемии обычно используют невирулентные (одноплазмидные) штаммы этого микроорганизма (Выявление специфических антигенов при экспериментальной сибирской язве. Абалкин В.А., Сергеева Л.В., Черкасский Б.Л. // Журн. микроб., биол., эпидемиол. 1989, №12.-С.63-68).

Возможно использование коров, которых заражают большими дозами возбудителя (Факторы специфической и неспецифической защиты у коров, экспериментально зараженных сибирской язвой. Буравцева Н.П., Ракитина Е.Л., Неляпин Н.М. и др. //Актуальн. вопросы иммунодиагнос. особо опасных инфекций. Ч.1., Ставрополь, 1986).

Недостатком первого способа является то, что одноплазмидные штаммы обуславливают образование антител к определенным антигенам, что не позволяет выявить полный спектр антител в сыворотках животных. Это возможно лишь при иммунизации вирулентным штаммом этого микроорганизма. Второй метод - дорогостоящий.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является публикация "Факторы специфической и неспецифической защиты у коров, экспериментально зараженных сибирской язвой".

Цель изобретения - получение иммунных сывороток от морских свинок после введения животным споровой взвеси вирулентного штамма В.аnthracis.

Поставленная цель достигается тем, что морским свинкам перед заражением поочередно - вначале в правый пах, затем через 14 дней в левый пах вводят 0,2 мл неполного адъюванта Фрейнда (НАФ) с равным объемом физиологического раствора (опытная группа).

Контрольной группе животных вводят 0,4 мл физиологического раствора.

Через 14 дней после последнего введения НАФ животных обеих групп заражают введением в правых пах 20, 200, 2000 спор В.аnthracis 81/1 (по 5 животных на дозу).

Животные контрольной группы, зараженные 200 и 2000 спор, погибают в течение 3-4 суток, в то время как животные опытной группы, зараженные этими дозами спор, остаются живыми в течение 35 суток (срок наблюдения). При бактериологическом обследовании органов и крови на 21 и 35 сутки возбудитель сибирской язвы не был выделен.

В реакции иммунодиффузии в геле (РИД) с культуральными фильтрами (КФ) В.аnthracis 81/1 (tox⁺, cap⁺) СТИ (tox⁺, cap^-) 81/1/1TR (tox^-, cap^-) титры сывороток животных опытной группы составляли 1:4-1:16.

В РНГА с антигенными диагностикумами, приготовленными с использованием КФ В.аnthracis СТИ, Davis (tox^-, cap⁺), 81/1TR титры антител сывороток этих животных колебались в пределах 1:80-1:640, с несенсибилизированными эритроцитами - 1:20.

Специфичность РНГА подтверждали РТНГА и РНат.

Предлагаемый способ получения сибиреязвенной сыворотки от морских свинок, зараженных вирулентным штаммом, может быть полезным для оценки разрабатываемых диагностических препаратов.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа

Пример 1. Введение животным неполного адъюванта Фрейнда

Равные объемы неполного адъюванта Фрейнда и 0,85% раствора хлористого натрия смешивали с помощью медицинского шприца и инъекционной иглы до получения стойкой эмульсии. По 0,4 мл эмульсии вводили морским свинкам в правый пах. Через 14 дней подобную эмульсию этим животным вводили в левых пах.

Контрольной группе животных вводили от 0,4 мл 0,85% раствора хлористого натрия.

Пример 2. Получение споровой взвеси В.аnthracis 81/1

В.аnthracis 81/1 высевали на агар Хоттингера, чашки инкубировали при 37°С в течение трех суток, затем при комнатной температуре - трое суток. Выросшую культуру снимали петлей в пробирки, в которые вносили 0,85% раствора хлористого натрия. Биомассу суспендировали с помощью пипетки и прогревали при 80°С 10 мин, повторно суспендировали после прогревания, оставляли в холодильнике (4°С) на 12 часов.

Оставшуюся взвесь отсасывали и титровали по 0,5 мл в 4,5 мл физраствора, высевали по 0,1 мл на агар Хоттингера для определения концентрации жизнеспособных спор.

Пример 3. Заражение морских свинок спорами В.аnthracis 81/1

В день заражения животных через 14 суток после последнего введения НАФ споровую взвесь тировали повторно для определения концентрации спор. Животным опытной и контрольной групп вводили в правых пах по 20, 200, 2000 спор в объеме 0,5 мл.

Пример 4. Бактериологическое обследование павших животных

Обычно в течение 3-4 суток погибали морские свинки контрольной группы, зараженные 200, 2000 спорами В.аnthracis 81/1, и часть животных, зараженных 20 спорами этого микроорганизма.

В опытной группе за это время погибала часть морских свинок, зараженных 2000 спор, а животные, зараженные 20 и 200 спорами В.аnthracis 81/1 оставались живыми в течение длительного времени (срок наблюдения 35 суток).

ЛД₅₀ В.аnthracis 81/1 для животных контрольной группы составляло примерно 20 спор, для животных опытной группы - 2000 спор (см. таблицу).

При осмотре павших животных отмечали отеки в месте введения возбудителя, при вскрытии - кровенаполнение с кровоизлияниями в печени и селезенке.

При посеве на агар Хоттингера отпечатков внутренних органов этих животных выделяли В.аnthracis, который идентифицировали до чувствительности к фагу К и в тесте жемчужного ожерелья.

Пример 5. Бактериологическое обследование выживших после заражения морских свинок, забор крови у животных

На 21 и 35 сутки выживших морских свинок после хлороформирования вскрывали. Кровь забирали из сердца. Кров и отпечатки внутренних органов засевали на агар Хоттингера.

При вскрытии на 21 и 35 сутки после заражения внутренние органы животных были без особенностей. В.аnthracis из внутренних органов и крови этих животных не выделяли.

После проверки на стерильность сыворотки крови этих животных отсасывали, инактивировали при 56°С 30 мин. К инактивированным сывороткам добавляли 1% мертиолят 1:100 и хранили в холодильнике до использования в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции иммунодиффузии в геле (РИД).

Пример 6. Получение антигенных эритроцитарных диагностикумов

Для сенсибилизации формализированных таннизированных эритроцитов барана использовали оптимальные для сенсибилизации разведения культуральных фильтратов (КФ) различных генотипов В.аnthracis.

Культуральные фильтраты В.аnthracis СТИ, 81/1TR, Davis получали по ранее описанной методике (Барков А.М., Липницкий А.В., Евтеева Е.В. Выделение и антигенная характеристика компонентов культурального фильтрата Bacillus аnthracis. //Биотехнология, 2000. №6.-С.27-33).

Сенсибилизацию эритроцитов проводили по (Bushanan T.M., Feeley J.C., Haues P.S., Brachman P.S. "Anthrax inderect hemagglutination test //J.Immunol, 1971.-Vol.107.-P.2631-2636").

Пример 7. Проверка в РНГА активности и специфичности сывороток морских свинок, выживших после заражения В.аnthracis 81/1.

РНГА ставили по общепринятой методике в объеме 0,025 мл. В качестве разбавителя использовали 1% нормальную кроличью сыворотку в физрастворе рН 7,2. Исследуемые сыворотки титровали в разбавителе с 1:10 до 1:1280. После внесения диагностикумов в объеме 0,025 мл плашки встряхивали, инкубировали при 37°С 40 мин. Результат учитывали в течение 20 мин.

Специфичность РНГА подтверждали контролями: разбавитель + эритроцитарный диагностикум; сыворотки исследуемых морских свинок + несенсибилизированные танизированные эритроциты.

Титры сывороток, полученные на 21 и 35 сутки после заражения спорами В.аnthracis 81/1, составляли для диагностикума на основе КФ. В.аnthracis СТИ 1:320-1:640; для диагностикумов на основе КФ В.аnthracis 81/1TR и Davis- 1:80-1:320 (см. таблицу).

Специфичность РНГА подтверждена также РТНГА и РНАт.

Пример 8. Активность сывороток морских свинок, выживших после заражения В.аnthracis 81/1 в РИД

Сыворотки морских свинок были неодинаково активны в РИД с КФ различных генотипов В.аnthracis и образовывали зоны преципитатов в разделении 1:4-1:16. (см. чертеж).

Таким образом, предварительное введение морским свинкам НАФ обуславливает длительное выживание животных после заражения 10 ЛД₅₀ В.аnthracis 81/1 с образованием антител к различным антигенам вирулентного штамма В.аnthracis.

Использование сывороток таких животных будет полезным для (отбора) оценки сибиреязвенных диагностических препаратов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Способ заключается в том, что животным перед заражением поочередно - вначале в правый, затем через 14 суток в левый пах вводят 0,2 мл неполного адъюванта Фрейнда с равным объемом физиологического раствора. Последующее введение через 14 дней в правый пах до 10 ЛД₅₀ споровой взвеси Bacillus anthracis 81/1 не приводит к гибели животных в течение длительного времени (срок наблюдения 35 суток). Способ позволяет получать иммунные сыворотки и использовать их в дальнейшем для оценки сибиреязвенных диагностических препаратов. 1 ил., 1 табл.

Способ получения иммунной сыворотки к антигенам вирулентного штамма Bacillus anthracis, отличающийся тем, что морским свинкам перед заражением поочередно, вначале в правый, затем через 14 дней в левый пах вводят 0,2 мл неполного адъюванта Фрейнда с равным объемом физиологического раствора, через 14 дней после последнего введения неполного адъюванта Фрейнда, в правый пах морским свинкам вводят до 10 ЛД₅₀ споровой взвеси Bacillus anthracis 81/1, все зараженные животные выживают до 35 суток (срок наблюдения).