СРЕДА ДЛЯ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ПАТОГЕННОЙ TREPONEMA PALLIDUM Российский патент 2009 года по МПК C12N1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при мониторинге биологических и генетических свойств возбудителя сифилиса - Treponema pallidum (патогенной бледной трепонемы), а также с целью поддержания жизнеспособности «диких штаммов» патогенной бледной трепонемы и при разработке методов серодиагностики сифилиса с использованием корпускулярных антигенов.

Экспериментальными исследованиями было установлено, что бледная трепонема при культивировании на искусственных питательных средах теряла свойство патогенности [1, 2, 3].

Известно использование лабораторных животных (биологической модели) для сохранения взятых от больных сифилисом людей клинических изолятов патогенной бледной трепонемы. Так, путем заражения различных лабораторных животных (приматов, кроликов, морских свинок) были получены и детально охарактеризованы лабораторные штаммы патогенной бледной трепонемы (Никольса, Будапештский, 1 Иркутский, VIII и XII ЦКВИ и другие) [3, 4]. Поддержание жизнеспособности указанных лабораторных штаммов осуществлялось путем их последовательных перевивок на лабораторных животных. В настоящее время в Российской Федерации в вивариях при крупных клинико-диагностических лабораториях дерматовенерологических диспансеров имеется только один штамм патогенной бледной трепонемы - штамм Никольса.

Известна среда для сохранения жизнеспособности патогенной Treponema pallidum, состав которой включает физиологический раствор, содержащий тканевой экстракт семенников зараженного сифилисом кролика и глицерин, добавленный из расчета 15% к объему среды. Обеспечение жизнеспособности патогенной Treponema pallidum в среде сохранения осуществляется путем быстрого замораживания и последующего хранения при низких температурах (минус 70...80°С) [5]. Эта среда сохранения патогенной бледной трепонемы была выбрана в качестве ближайшего аналога.

Однако для использования известной среды для сохранения патогенной бледной трепонемы необходимо первоначально получить адаптированную к условиям жизнедеятельности в организме лабораторного животного (кролика) культуру (лабораторный штамм) патогенной бледной трепонемы и лишь затем возможно гарантированное сохранение жизнеспособности полученной из кроличьего орхита взвеси возбудителя в соответствии с приведенным способом. Процедура получения нового лабораторного штамма трудоемка, так как процесс адаптации микроорганизма к условиям существования в организме другого биологического вида занимает длительное время. Эта процедура дорога и, в ряде случаев, неосуществима по ряду причин организационного характера (необходимость наличия вивария, а также обеспечение возможности оперативного заражения кролика материалом от больного сифилисом) [3, 4]. При этом отмечается отсутствие стабильности в результатах работ по получению новых лабораторных штаммов патогенной бледной трепонемы и невозможность повторного воспроизведения штамма в случае падежа лабораторного животного в связи с тем, что больной сифилисом пациент (источник получения клинического изолята «дикой» патогенной бледной трепонемы), в соответствии с действующими нормативами, должен начать специфическое лечение не позднее 24 часов после установления диагноза.

Технической задачей изобретения является разработка среды для длительного сохранения жизнеспособности клинических изолятов «дикой» патогенной бледной трепонемы, полученных непосредственно от больных сифилисом людей, минуя этап получения лабораторного штамма.

Эта задача достигается за счет того, что в качестве взвеси патогенных бледных трепонем используют нативную межтканевую жидкость (райц-серум), содержащую возбудителя сифилиса, полученную путем раздражения поверхности эрозивных или язвенных морфологических элементов на коже и слизистых оболочках больного сифилисом человека. Полученную вышеуказанным способом межтканевую жидкость собирают дробными порциями и в количестве не менее 0,03-0,06 мл, с соблюдением условий стерильности, переносят в пробирки-эппендорфы, содержащие 0,6-0,75 мл физиологического раствора и 0,09-0,11 мл глицерина, перемешивают, контролируют содержание в полученной среде возбудителя сифилиса, замораживают и хранят при температуре минус 70...80°С.

Техническим результатом изобретения является упрощение процедуры сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной бледной трепонемы, полученных непосредственно от пациентов, так как при этом исключается длительный этап получения лабораторного штамма T.pallidum на лабораторных животных.

Преимущества предлагаемой среды сохранения:

- применение среды сохранения позволяет поддерживать жизнеспособность «диких» штаммов бледной трепонемы с сохранением ее патогенных (вирулентных) свойств;

- для получения среды сохранения клинических изолятов патогенной бледной трепонемы не требуется дорогостоящих реагентов;

- применение предлагаемой среды сохранения клинических изолятов патогенной бледной трепонемы снижает прямые экономические затраты, связанные с приобретением и содержанием лабораторных животных, используемых для первичного заражения или пассажей инфекционного материала.

Кроме того, разработанная среда не содержит дополнительных ингредиентов, способных вызывать биологическую реакцию, вследствие чего клинические изоляты бледной трепонемы могут быть использованы для исследования непосредственно после разморозки (оттаивания), без отмывания или другой дополнительной обработки. Возможность приготовления нескольких раздельных аликвот среды сохранения с патогенной бледной трепонемой позволяет произвольно регулировать время выполнения различных видов работ с полученным клиническим изолятом бледной трепонемы (молекулярные методы исследования генетических маркеров возбудителя сифилиса, их адаптацию к условиям существования в организме лабораторного животного с целью получения новых лабораторных штаммов, восстановление утраченного лабораторного штамма патогенной бледной трепонемы).

Изобретение осуществляют следующим образом.

Поверхность эрозивного (язвенного) элемента на коже или слизистых оболочках больного сифилисом очищают стерильным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором. Затем поглаживающими движениями стерильной пластиковой ложки Фолькмана производят легкое раздражение поверхности элемента, избегая повреждения мелких кровеносных сосудов. Указанные действия вызывают ток межтканевой жидкости из глубины воспаленных тканей к поверхности. Межтканевую жидкость (райц-серум) собирают пластиковой ложечкой Фолькмана, вмещающей 0,010-0,015 мл. Повторными действиями переносят 0,03-0,06 мл (5-10 доз) межтканевой жидкости в стерильную пробирку-эппендорф, содержащую 0,6-0,75 мл физиологического раствора и 0,09-0,11 мл глицерина. Среду тщательно перемешивают, приготавливают препарат для микроскопии бледной трепонемы в темном поле зрения, пробирку со средой и возбудителем сифилиса закрывают пробкой.

Содержание патогенной бледной трепонемы в приготовленной среде контролируют путем микроскопии нативного препарата на предметном стекле, покрытом покровным стеклом, в темном поле зрения (окуляр - х7, объектив - х40, бинокулярная насадка - х1,5). В приготовленном препарате среды должны содержаться подвижные бледные трепонемы с типичной морфологией и характерными видами движений. Количество трепонем должно быть не менее 2-5 в поле зрения, что соответствует концентрации 2-5·10⁵ микроорганизмов в 1 мм³. При этом концентрация возбудителей сифилиса в среде не влияет на сохранение жизнеспособности и вирулентности клинического изолята патогенной бледной трепонем. Исследование приготовленной среды производят для контроля присутствия и визуальной идентификации типичных бледных трепонем.

Для сохранения жизнеспособности клинического изолята патогенной бледной трепонемы, полученного вместе с райц-серумом, среду в пробирке быстро замораживают и подвергают хранению при температуре минус 70...80°С. Срок сохранения жизнеспособности и вирулентных свойств клинических изолятов патогенной бледной трепонемы с применением разработанной среды по экспериментальным данным составляет не менее 12 месяцев.

Эффективность разработанной среды иллюстрируются примерами, где для оценки жизнеспособности и вирулентности (патогенности) клинических изолятов патогенной бледной трепонемы использована биологическая модель лабораторного животного (кролика):

Пример 1.

31.01.2006 г., от пациента М. со вторичным сифилисом путем деликатного раздражения поверхности эрозивного шанкра в области венечной борозды была получена взвесь бледных трепонем в межтканевой жидкости. С соблюдением правил асептики она была собрана ложкой Фолькмана и в количестве около 0,05 мл перенесена в пробирки-эппендорфы, содержавшие по 0,6 мл стерильного физиологического раствора и 0,09 мл стерильного глицерина. Всего было приготовлено 5 дубликатов среды сохранения с клиническим изолятом возбудителя сифилиса. После тщательного перемешивания были приготовлены контрольные нативные препараты среды, а пробирки со средой были немедленно заморожены и сохранялись при температуре минус 70...80°С.

В нативном препарате при микроскопии в темном поле (окуляр - х7, объектив - х40, бинокулярная насадка - х1,5) были обнаружены подвижные патогенные бледные трепонемы с типичной морфологией и характерными видами движений в количестве от 6 до 10 в поле зрения, что соответствовало содержанию 6·10⁵-1·10⁶ микроорганизмов в 1 мм³.

18.05.2006 г. через 3,5 месяца после помещения в низкотемпературный холодильник среды сохранения, содержавшей патогенную бледную трепонему (полученную от пациента М.), две пробирки были разморожены при комнатной температуре, и их содержимое использовано для заражения здорового кролика (путем введения шприцем по 0,7 мл клинического материала в среде сохранения внутрь каждого яичка).

При наблюдении за кроликом клинических признаков развития сифилитической инфекции установлено не было. С сывороткой крови кролика, взятой на 22 день после заражения, наблюдали слабоположительные результаты исследования в RPR (++) и в РИПА (+/++ в разведении 1:80 и 1:160). В образцах сыворотки крови, взятых на 32-94 дни после инфицирования, было отмечено нарастание позитивности ответов в реакциях: RPR (++++, титр 1:8-64) и РПГА (++++, титр 1:1280-20960).

При последующей перевивке (пассаже) кусочков органов (печени, почек, яичек, селезенки) от первично инфицированного кролика здоровому лабораторному животному наблюдали развитие скрытой формы сифилиса, подтвержденное развитием у него гуморального иммунного ответа в виде выработки реагиновых (определяемых в RPR) и трепонемоспецифических (определяемых в РПГА) антител в высоком титре.

Пример 2.

20.12.2006 г. через 10,5 месяцев после помещения в низкотемпературный холодильник среды сохранения, содержавшей патогенную бледную трепонему, полученную от пациента М. в январе 2006 года и сохранявшуюся при температуре минус 70...80°С, две пробирки со средой сохранения были подвергнуты размораживанию при комнатной температуре и их содержимое в количестве по 0,73 мл шприцем было введено внутрь каждого яичка здоровому кролику.

При наблюдении за лабораторным животным в течение 80 дней не наблюдали появления клинических признаков сифилитической инфекции. С сывороткой крови кролика, взятой на 25 день после заражения, получили положительные результаты при исследовании ее в RPR (+++) и в РПГА (+++ в разведении 1:160). В образцах сыворотки крови, взятых в более поздние сроки наблюдения - на 65-80 дни после инфицирования, также было отмечено нарастание уровня антител в серологических реакциях: RPR (++++, титр 1:16-64) и РПГА (++++, титр 1:1280-5120).

Пассаж кусочков органов (печени, почек, яичек, селезенки) от первично инфицированного кролика здоровому лабораторному животному, произведенный на 80 день после заражения, продемонстрировал развитие гуморального иммунного ответа в ответ на внедрение инфекционного агента в виде выработки реагиновых и трепонемоспецифических антител, исследованных с помощью RPR, РИФ_ц, и РПГА.

Таким образом, приведенные примеры 1 и 2, демонстрируют:

- успешное получение клинического изолята патогенной бледной трепонемы от больного сифилисом человека (подтвержденное путем микроскопии контрольных препаратов);

- возможность длительного непрерывного хранения клинического изолята патогенной бледной трепонемы в разработанной среде сохранения при условиях низкой температуры (минус 70...80°С) в течение 3,5 и 10,5 месяцев без потери вирулентности (таблица);

- подтверждение жизнеспособности и патогенных свойств клинических изолятов патогенной бледной трепонемы, сохранявшихся в разработанной среде, осуществленное путем экспериментального заражения лабораторных животных. Развитие у кроликов латентной формы сифилитической инфекции было установлено на основании появления у них гуморального иммунного ответа в сроки, типичные для такого способа заражения. Факт заражения лабораторных животных сифилисом, а не пассивной их иммунизации нежизнеспособным биологическим материалом, был подтвержден при перевивке кусочков органов от первично инфицированных кроликов кроликам первого пассажа.

Таблица
Результаты исследования жизнеспособности и патогенности клинических изолятов патогенной Treponema pallidum в зависимости от сроков храненияИзучаемые свойстваСрок хранения клинических изолятов патогенной Treponema pallidum0,5 мес3,5 мес6 мес10,5 мес12 месЖизнеспособность и патогенностьСохраненыСохранены (пример 1)СохраненыСохранены (пример 2)Сохранены

Источники информации

1. Д.К.Заболотный. К вопросу о культурах спирохет.//Избранные труды. Том 2. Холера. Сифилис. Эпидемиологические и другие работы. - Киев: Издательство Академии наук УССР, 1951. - С.186-188.

2. Р.Р.Гельтцер. Выращивание бледной спирохеты и значение этих культур.//Сборник научных трудов Ставропольского института эпидемиол. и микробиол., 1947. - Выпуск 1. - С.83.

3. Н.М.Овчинников. Экспериментальный сифилис. - М.: Медгиз, 1955. - 388 с.

4. Н.М.Овчинников. Экспериментальный сифилис кроликов.//Методы экспериментальной химиотерапии (Практическое руководство)./Под ред. Г.П.Першина. Изд.2-е. - М.: Медицина, 1971. - С.89-91.

5. Патент RU №2292388 А1. Способ сохранения жизнеспособности штамма патогенных бледных трепонем. А.А.Кубанова, С.В.Ротанов, Н.В.Фриго, Т.И.Милонова./ФГУ «ЦНИКВИ Росздрава». - Бюллетень «Изобретения, полезные модели» от 27.01.07. - №3.

Изобретение касается среды для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной бледной трепонемы. Среда по изобретению содержит 0,6-0,75 мл физиологического раствора, 0,09-0,11 мл глицерина и 0,03-0,06 мл межтканевой жидкости (райц-серума) человека, содержащей возбудителя сифилиса, которую получают при осторожном раздражении поверхности эрозивных или язвенных клинических элементов у больного сифилисом. Полученную среду тщательно перемешивают, контролируют содержание в ней патогенной бледной трепонемы и подвергают немедленному замораживанию и хранению при температуре минус 70...80°С. Среда по изобретению гарантированно сохраняет жизнеспособность и вирулентность (патогенность) «диких» штаммов возбудителя сифилиса. Применение среды сохранения создает условия для проведения генетических исследований по изучению изменчивости бледной трепонемы, минуя этап получения лабораторного штамма. 1 табл.

Среда для сохранения жизнеспособности клинических изолятов патогенной Treponema pallidum (бледной трепонемы), содержащая физиологический раствор, глицерин и взвесь патогенной бледной трепонемы, отличающаяся тем, что в качестве взвеси патогенной бледной трепонемы она содержит межтканевую жидкость, полученную с поверхности эрозивных или язвенных клинических элементов непосредственно от больного сифилисом человека (райц-серум), при следующем количественном соотношении компонентов, мл:

физиологический раствор0,6-0,75глицерин0,09-0,11межтканевая жидкость0,03-0,06