ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS M-10 - ПРОДУЦЕНТ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ВЫРАЖЕННЫМ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C12N9/16 C12R1/01 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма Serratia marcescens М-10, являющегося продуцентом невнеклеточной неспецифической эндонуклеазы. Фермент эндонуклеаза бактериальная может быть использован как основное действующее вещество препаратов для лечения и профилактики вирусных инфекционных заболеваний животных, в частности телят и птицы, и насекомых (пчелы).

Цель изобретения - увеличение содержания эндонуклеазы (ед. акт.) в 1 мл культуральной среды. Увеличение эндонуклеазной активности достигается получением штамма Serratia marcescens М-10 из музейного штамма Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) В-10 M-2 (ВКПМ В-1992) под действием нитрозометилмочевины с последующим отбором наиболее высокоактивных вариантов.

Известен штамм Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) B-10 M-2 (ВКПМ B-1992), синтезирующий неспецифическую энлонуклеазу в количестве до 15000 ед. фермента на 1 мл культуральной жидкости при выращивании на пептонной среде (МПБ или среда Лурия). Штамм получен из штамма Bacterium prodiglosum В-10 М-1 под действием мутагена - нитрозометилмочевины (Институт цитологии и генетики СО АН СССР, авторы - З.И. Панфилова, Р.И. Салганик; SU 928794 А1).

Недостатком данного штамма является низкая активность (15000 ед. акт.) и соответственно выход фермента эндонуклеазы бактериальной. В настоящее время бактериальная эндонуклеаза применяется в основном для лечения вирусных заболеваний пчел. Неспецифическая бактериальная эндонуклеаза может быть также использована для лечения вирусных инфекционных заболеваний птиц и молодняка крупного рогатого скота.

Увеличение эндонуклеазной активности достигается получением штамма Serratia marcescens М-10 из музейного штамма Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) В-10 M-2 (ВКПМ В-1992) под действием нитрозометилмочевины. Для этого штамм Serratia marcescens В-10 М-2 выращивали на среде L (Лурия) следующего состава, г:

дрожжевой экстракт - 5,0;

пептон - 15,0;

NaCl - 5,0;

вода дистиллированная - до 1 л.

Культуру выращивали в течение 18 часов при 30°С до оптической плотности 0,7. Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М (светофильтр №3). Затем культуру охлаждали в течение 1 ч до 15°С, клетки отделяли центрифугированием в течение 20 мин, скорость вращения ротора 5000 об/мин. В клеточную массу добавляли свежей среды L (0,5 л) и 0,2% нитрозометилмочевины, инкубировали при встряхивании на качалке в течение 15 мин при 30°С. Суспензию, обработанную мутагеном, высевали на индикаторную среду и инкубировали в течение 24 ч при 30°С. Индикаторная среда имела следующий состав, г:

рибонуклеиновая кислота (РНК) - 0,6;

толуидиновый голубой - 0,1;

агар питательный - 38;

вода дистиллированная до - 1 л.

Краситель толуидиновый голубой окрашивал среду в голубой цвет. После инкубирования культуры в результате гидролиза РНК при выделении эндонуклеазы вокруг колоний появлялись ореолы розового цвета. Диаметр ореолов служил качественным показателем ферментной активности. Отбирали клоны, у которых проявились ореолы наибольших размеров по сравнению исходным штаммом, диаметр не менее 18-20 мм.

В результате отбора был отобран штамм-мутант Serratia marcescens М-10, характеризующийся следующими морфологическими и культуральными признаками.

Морфологические признаки. Клетки - подвижные, прямые, палочковидные, размером 0,5-0,8 × 1,0-3,0 мкм, грамотрицательные.

Культуральные признаки. При посеве на мясо-пептонном агаре (МПА) через 48 ч роста при 30°С культура образует округлые, гладкие, выпуклые колонии светло-коричневого цвета, диаметром 1,5-1,7 мм. Оптимальный режим роста: pH 6,5-7,5; температура 28-30°С.

Физиолого-биохимические свойства. Штамм является ауксотрофом. Из глюкозы, сахарозы, мальтозы и маннита образует кислоту. На лактозе кислоту не образует. Крахмал гидролизирует слабо, клетчатку не разлагает. Молоко свертывает, желатин разжижает. Нитраты восстанавливает до нитритов.

При выращивании на мясо-пептонном бульоне (МПБ) штамм Serratia marcescens М-10 к 24 ч роста образует 25000-30000 ед. фермента на 1 мл культуральной жидкости, тогда как штамм Serratia marcescens (Bacterium prodiglosum) В-10 M-2 к 24 ч роста образует 15000 ед. фермента.

Пример. Штамм Serratia marcescens М-10 и штамм Serratia marcescens В-10 М-2 выращивали на МПА в течение 24 ч. Затем отбирали типичные колонии, суспендировали клетки в среде L до плотности 1×10⁹ кл/мл и инокулировали в количестве 1×10⁷ кл/мл в 250 мл среды L. Инкубирование проводили при 30°С в колбах Эрленмейера объемом 750 мл со встряхиванием на лабораторном шейкере Stuart SSL1, скорость 180 об/мин. Через каждые 2 часа из культуральной среды отбирали пробы по 5 мл для качественного и количественного определения эндонуклеазной активности.

Качественная оценка эндонуклеазной активности проводилась на индикаторной среде с красителем толуидиновый голубой. Количественное определение внеклеточной эндонуклеазы проводилось по появлению кислородорастворимого осадка под действием культуральной жидкости на РНК, с последующей адсорбцией при 260 нм. Измерение проводили на спектрофотометре СФ-16 (кювета L=1 дм³).

Данные по количеству и времени накопления внеклеточной эндонуклеазы штаммами Serratia marcescens М-10 и Serratia marcescens В-10 М-2 приведены в таблице.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Serratia marcescens, являющийся продуцентом неспецифической бактериальной эндонуклеазы. Штамм депонирован в ВКМ под номером VKM В-2931D. Эндонуклеазная активность штамма к 36 ч культивирования на мясо-пептонном бульоне составляет 28720 ед./ мл культуральной жидкости. 1 табл., 1 пр.

Штамм бактерий Serratia marcescens М-10 - продуцент неспецифической бактериальной эндонуклеазы, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под № VKM B-2931D.