Штамм BACTERIUM PRODIGIOSUM (SERRATIA MARCESCENS) В-10, М-2 - продуцент неспицифической эндонуклеазы Советский патент 1993 года по МПК C12N1/20 C12N9/16 C12N1/20 C12R1/43 

Изобретение относится к микробиологии и представляет собой новый штамм Bacterium prodlglosum S.marcescens) В-10, М-2, который может быть использован как продуцент неспацифической эндонуклеазы препарата для борьбы с вирусными инфен:Цйонными заболеваниями животных и насекомых.

Известен штамм Bacterium prodtglosum (S.marcescens) В-10. М-1, синтезирующий внеклеточную неспецифическую эндонуклеазу в количестве до 3600 ед/мя культуральной жидкости при выращивании на пептонной среде.

Однако штамм Bacterium prodtglosum (S.marcesQens) В-10, М-1 обладает недостаточно высокой активностью внеклеточной неспецифической эндонуклеазы для получения фермента.

Цель изобретения - увеличение активности - достигается тем, что штамм Bacterium prodiglosum В-10, М-2 получают из исходного музейного штамма B.prodlgfosum В-10. М1 под действием нитрозометилмочевины.

Для этого культуру Bacterium prodiglosum В-10, М-1 выращивали в минимальной среде следующего состава: лимонная кислота-моногидрат 22 г,- NaCJ 0.04 г MnSO 4Н2О 0,04 г; глюкоза 10.0; рН доводили до 7.0 . вода дистиллированная 1 л до оптической плотности (ОП) 0.63 (ОП измеряли с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-М, светофильтр № 3), Культуру охлаждали в течение 1 ч. центрифугировали (5000 об/мин) 20 мин, разводили в свежей среде до ОП 0.2, добавляли в среду нитроэометилмочевину до 0.2% и бактерии инкубировали в течение 15 мин при встряхивании на качалке при 30°С. Обработанную мутагеном суспензию еысевали на чашки Петри с индикаторной средой для выявления продуцентов эндонуклеазы. Индикаторная среда содержала РНК (рибонуклеиновая кислота) О.б мг/мм и толуидиновый голубой (0.01 %). который окрашивает среду с РНК в голубой цвет. Вокруг колоний бактерий, выделяющих Эндонуклеазу, через 24 ч роста в результате гидролиза РНК появлялись ореолы йрко-розового цвета. Отбирались колонии с большими по сравнению с контролем зонами рибонуклеазной активности. Отобранные варианты проверялись на эндонуклеазную активность при выращивании на пептонной среде.

При такой проверке был отобран мутант В.prodtglosum В-10, М-2, характеризующийся следующими свойствами.

Морфология. Клетки - подвижные короткие палочки, одиночные, парные или в цепочках; грамотрицательные. Величина

клеток односуточной культуры на рыбном

питательном агаре (РПА) 1-3 х 0.6-0,8 мкм.

Культуральиые признаки и физиологобиохимические свойства. При посеве на

РПА колонии округлые, гладкие, диаметром 1,5 мм (через 48 ч роста при ). Профиль колоний выпуклый. Пигментная окраска колоний, характерная для вида B.protflgiosum, отсутствует. Желатину разжижает, молоко

0 саертывает, крахмал гидролизует.слабо, клетчатку не разлагает, нитраты восстанавливает до нитритов. Штамм является ауксотрофом. Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита образует кислоту, на лактозе кислоту ие образует. Оптимальный режим роста: температура 28-30°С; рН среды 7-8.

При лабораторной проверке эндонуклеазной активности полученного штамма B.prodigJosum В-10, М-2 и сравнении ее с

0 активностью известного штамма B.prodigiosum В-10, М-1 при выращивании на пептонной среде оказалось что В.prodiglosum В-10, М-2 к 24 ч роста образует по 15000 ед. фермента на 1 мл среды.

5 тогда как известный штамм В.prodiglosum В-10, М-1 образует к 26 ч роста 3600 ед. эндонуклеазы.

Активность фосфодизстеразы у штамма B.prodigiosum В-10, М-2 составляет 0.10 0,14%. а активность фосфомоноэстеразы 0,004-0.016% от активности неспецифической эндонуклеазы в период 24-31 ч роста. У известного штамма B.prodlgtosum В-10, М-1 активность фосфодиэстеразы составля5 от 1.0% и активность фосфомонозстеразы . 0,13-0.36% от активности основного фермента.

Выращивание штамма B.prodigtosum В-10. М-2 ДЛИ проверки эндонуклеазной ак0 тиБности проводили при условиях, описанных для известного штамма B.prodigiosum В-10, М-1.

Сравнительные данные по динамике накопления эндонуклеазы предлагаемого

S штамма B.prodlgiosum В-10, М-2 и известного штамма B.prodlgiosum В-10. М-1 представлены в таблице.

П р и м е р. Штамм B.prodlgiosum В-10. М-2 выращивали на скошенном рыбном питательном агаре в течение 24 ч. Клетки суспендировали в физиологическом растворе до плотности 1x10 кл/мл и инокулировали в количестве 1x10 кл/мл в25мл пептонной среды следующего состава: пептон 16 г;

5 NaCI 5.0 г; MgClz 0,1 г; трис-буфер 6.05 г; НаО диет. 1.0 л, рН 8.2-8.3. /1нкубирование проводили а колбах Эрленемейера объемом 100 мл со встряхиванием на качалках (160 об/мин) при 30°С. Через Определенные интервалы времени из культуральной среды

отбирали пробы по 5 мл, проводили испытание на внеклеточную эндонуклеазную активность. Проверку превращения РНК или ДНК в олигонуклеотиды под действием культуральной жидкости проводили по появлению кислоторастворимого материала с адсорбцией при 260 нм.

При измерении активности фосфомоноэстеразы за единицу активности фосфомоноэстеразы принимали увеличение оптической плотности на 0,1 ОП при 400 им

за 15 мин инкубации при 37°С. В качестве

субстрата использовали п-нитрофенилфосфат натрия.

За единицу активности фосфодиэстеразы принимали увеличение ОП раствора Сабис-нитрофенилфосфатанаО,1 ОПпри400нм за 15 мин инкубации при 37°С. Измерение

проводили на спектрофотометре СФ-16 в

кюветах L 1 см. (56) Авторское свидетельство СССР

№ 431214, кл. С 12 К 1/02, 1974.

Ф О р м у Л а и 3 о б р е т е и и я

ШТАММ BACTERIUM PRODIGIOSUM (SERRATIA MARCESCENS) В-10. Mf2 ,- Продукт неспецисЬической эндонуклеазы

,хранится в музее культур промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика Г ЦМПМ В-1992.