ШТАММ BACTERIUM PRODIGIOSUM (SERRATIA MARCESCENS) В-Ю Л\-1 — ПРОДУЦЕНТ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ Советский патент 1974 года по МПК C12N9/16 C12N1/20 C12N15/01 

1

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к штамму Bacterium prodigiosum (Serratia marcescens) B-10 M-1 нродуценту неспецифической эндонуклеазы.

Известный Штамм Bacterium prodigiosum недостаточно активно продуцирует внеклеточную неспецифическую эндонуклеазу (40- 90 ед/мл культуральной жидкости).

Цель изобретения - увеличение активности - достигается тем, что штамм В. prodigiosum В-10 М-1 получают из исходного музейного штамма В. prodigiosum В-10 под действием нитрозометил мочевины.

Для этого культуру В. prodigiosum В-10 выращивают в среде, содержащей в 1000 мл воды 22 г моногидрата лимонной кислоты, 0,5 г N32504, 5 г КН2РО4, 0,8 г MgSOi 7Н2О, 0,04 г NaCl, 0,042 г MgSO 4Н2О и 10 г глюкозы, при рН 7,0, устанавливаемом с помощью , до оптической плотности 0,65 (по ФЭК-М со светофильтром № 3).

Культуру охлаждают 1 час, центрифугируют (5000 об/мин, 20 мин), разводят в свежей среде до оптической плотности 0,2, вводят в среду до 0,2% нитрозометилмочевины, инкубируют 5 мин, встряхивая на качалках при 30° С. Обработанную мутагеном суспензию высевают в чашки Петри с индикаторной средой, предназначенной для выявления продуцентов эндонуклеазы, содержащей

0,6 мг1мл рибонуклеиновой кислоты (РНК) и 0,01 % толуидина голубого, окращивающего среду с РНК в голубой цвет. Вокруг колоний, выделяющих эндонуклеазу, через 24 час роста в результате гидролиза РНК образуется ореол ярко-розового цвета. Отбирают колонии с большими по сравнению с контролем зонами РНК-азной активности. Все отобранные варианты проверяют на эндонуклеазпую активность при выращивании на пептонной среде, что позволяет отобрать ряд мутантов, наиболее эффективно продуцирующих эндонуклеазу в среду. Наиболее активным среди них оказался мутант М-1, характерИзующийся следуюпщми свойствами.

Морфология. Клеткн короткие палочки размером 0,8 - 3 - 0,6 - 0,8 мк; вытянутые, одиночные, (Парные или в цепочках, подвиж-, ные, грам-отрицательные.

Культуральные признаки и физнологобиохимпчсские свойства.

На МПА - колонии округлые, гладкие, блестящие, бесцветные, диаметром 1,5-2,0мм (через 48 час роста Прн 30°С).

Ирофиль колоний выпуклый.

На РПА - колонии округлые, бесцвет-, пые, с гладкими краями. Поверхность колоний гладкая, блестящая. Профиль колоний выпуклый.

Желатину разжижает.

Молоко свертывает, но не пептонизирует.

Крахмал гидролнзует очень слабо.

Клетчатку не разлагает.

Штамм является ауксотрофом, требует добавки в питательную среду серина и лизина.

Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита образует кислоту, на лактозе кислота не образуется.

Нитраты восстанавливает до нитритов. Оптимальный режим роста: температура 28-30°С, рН среды 6-8.

При выращивании на пептонной среде штамм образует до 3600 ед внеклеточной эндонуклеазы на 1 мл культуральной жидкости при значительном снижении активности сопутствующей фосфомоноэстеразы.

Штамм устойчив в отнощении эндонуклеазной активности. При его использовании в

одинаковых условиях достигается значительно больщий выход фермента, чем при использовании известного штамма. Активность фосфодиэстеразы у щтамма 10%, а фосфомоноэстеразы 0,13-0,36% от активности основного фермента. Значительное снижение активности фосфомонозстеразы позволяет ири промышленном ферментативном гидролизе РНК-ДНК получить мононуклеотиды; представляющие интерес в производстве АТФ,

ртнтерфероногенов и др.

Эффективность предлагаемого штамма В. prodigiosum В-10 М-1 представлена в таблице.

Пример. Штамм В. prodigiosum B-IO М-1 выращивают на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 24 час, суспендируют в физиологическом растворе до плотности 1-10 клеток/лы и инокулируют в 20 мл пептонной среды в количестве 1-10 клеток/лл среды. ИнюубГируют в колбах Эрленмейера йа 100 мл в течение 65-70 час при 30° С. Через 16, 25, 26-29, 39-40, 47 и 64 час, отбирают по 0,5 мл культуральной жидкости и определяют внеклеточную эндонуклеазную активность. Наличие превращения РНК или ДНК IB олигонуклеотиды 1под действием культуральной жидкости определяют по появлению кислоторастворимого материала с абсорбцйей при 260 ммк (спектрофотометр СФ-4А, кюветы L 1 см). Максимум эндонуклеазной активности наблюдается в интервале 24-40 час и достигает 700-1800 ед1мл культуральной жидкости. При выращивании мутанта в таких же условиях, но со встряхива«ием иа качалках (160 об/мин) или в колбах Виноградского в 20 мл среды без встряхивания вследствие улучшенного режима аэрации эндонуклеазная активность возрастает до 3600 ед/мл в период максимального выделения фермента (26 час роста). При измерении активности фосфомоноэстеразы за единицу активности этого фермента прпнимают увеличение оптической плотности на 0,1 при 400 ммк за 15 мин инкубации при 37° С. В качестве субстрата используют rt-нитрофенилфосфат натрия и измеряют светопоглощение на спектрофотометре СФ-4А. Предмет изобретения Штамм Bacterium prodigiosum (Serratia marcescens) В-10 М-1 -продуцент .неспецифической эндонуклеазы. Морфология. Клетки короткие палочки размером 0,8-3 0,6-0,8 мк, вытянутые, одиночные, парные или в цепочках, подвижные, грам-отрицательные. Культуральные иризнаки и физиологобиохимические свойства. На МПА - колонии, округлые, гладкие, блестяшие, бесцветные, диаметром 1,5-2,0 мм (через 48 час роста при 30°С). Профиль колоний выпуклый. На РПА - колонии округлые, бесцветные, с гладкими краями. Поверхность колоний гладкая, блестящая. Профиль колоний выпуклый. Желатину разжижает. Молоко свертывает, но не пептонизирует. Крахмал гидролизует очень слабо. Клетчатку не разлагает. Штамм является ауксотрофом, требует добавки в питательную среду серина и лизина. 5 Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, маннита образует кислоту, на лактозе кислота не образуется. Нитраты восстанавливает до нитритов. Оптимальный режим роста: температура5 28-30° С; рН среды 6-8. б При выращивании на пептонной среде штамм образует до 3600 ед внеклеточной эндонуклеазы на 1 мл культуральной жидкости при значительном снижении активности сопутствующей фосфомоноэстеразы.