Штамм бактерий SеRRатIа маRсеSсеNS - продуцент эндонуклеазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N9/22 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий S.marcescens, продуцирующий неспецифическую эндонуклеазу (К.Ф.З. 1.4.9), которая может быть использована в научно-исследовательских работах по изучению противоопухолевых и противовирус- ных свойств эндонуклеазы при исследовании структуры хроматина для получения мононуклеотидов.

Цель изобретения - получение беспигментного штамма S.marcescens, обладающего более высоким уровнем эндонуклеазной активности в культураль- ной жидкости.

Штамм получен методом двухэтапной обработки:

Iэтап - облучение пигментного штамма S.marcescens 211 Вй АТСС - 9986 ультрафиолетовым светом с последующим отбором колоний с наибольшей эндонуклеазной активностью;

IIэтап - обработка мутанта, полученного на предыдущей стадии нитрозогуаниди- ном и отбор наиболее активного продуцента.

Штамм S.marcescens ВКПМ 6-4870(28- 13) имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные размером 1,5-2x0,8-1 мкм, одиночные, парные или соО

о ю Ј

единенные в короткие цепочки, грамотри- цательные, подвижные.

На мясопептонном агаре через 24 ч роста образует блестящие гладкие бесцветные колонии, выпуклые, с ровным краем, диаметром 1,5-2 мм. На картофеле-блестящий бесцветный налет. Молоко свертывает, но не пептонизирует, желатин разжижает медленно.

Физиолого-биохимические признаки. Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, инозит, маннит, салицилат. Не ферментирует лактозу, адонит, дульцит, ксилозу, арабино- зу, рамнозу. Не расщепляет мочевину, сероводород, индол не образует. Реакция Фогес-Проскауэра положительная, реакция с метил-рот отрицательная.

Оптимальная температура для роста 28-30° С, рИ среды 7,4-7,6.

Эндонуклеазная активность. Эндонуклеазная активность через 24 ч выращивания на качалке 180-200 об. при оптимальной температуре достигает 450000-500000 виск. ед./мл, 90000-100000 опт. ед./мл/ч, 150-160 мкм расщепленной ДНК/мл/мин.

Максимальная Эндонуклеазная активность наблюдается на 24 ч культивирования.

Эндонуклеазную активность определяют вискозиметрическим методом и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в2%-ной HCIO-q. Реакционная смесь объемом 1 мл содержит: 1 мг ДНК, 0,07 М трис-HCI, рН 8,5, 0,007 М . 0,1 мл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют 15-20 мин при 37° С, реакцию останавливают добавлением равного объема 4%-ной охлажденной HCICM. Кислотонерастворимый материал удаляют центрифугированием на холоду при бОООд, 20 мин, В надосадочной жидкости после разведения в 20 раз измеряют оптическое поглощение при 260 нм на спектрофотометре СФ-16. За единицу активности принимают количество фермента, которое дает увеличение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента), на одну оптическую единицу за час инкубации в пересчете на 1 мл культуральной жидкости (А260 ед/мл/ч).

В качестве субстрата используют препараты высокополимерной ДНК из тимуса теленка, выделенной по методу Кэя в модификации Бенинга, или коммерческие препараты высокополимерной ДНК.

Сравнительная характеристика активности внеклеточной эндонуклеазы штаммов

S.marcescens известных и предлагаемого в качестве продуцента эндонуклеазы на питательной среде следующего состава:

Глицерин5

Цитрат аммония5

Двузамещенный фосфат калия10

Сернокислый магний0,5

Хлористый натрий0,5

0 Сернокислое железо0,025

Гидролизат казеина1

Дрожжевой экстракт3

рН среды7,6

для получения эндонуклеазы представлена 5 в таблице.

П р и м е р 1. Получение штамма с повышенной эндонуклеазной активностью.

Iэтап. Исходный штамм Вй-211 АТСС- 9986 выращивают на мясопептонном агаре

0 в течение 18 ч при 30° С. Выросшие клетки смывают 0,5%-ным физиологическим раствором, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,1 М Na-фосфатном буфере до оптической плотности 0,12-0,15 при

5 650 нм, Полученную суспензию клеток облучают бактерицидной ультрафиолетовой лампой БУФ-2 в течение 1QO с. К облученной суспензии добавляют мясопептонный бульон - 1/3 объема суспензии и инкубируют в

0 темноте в течение 3 ч при 30° С. После инкубирования клетки высеивают в чашки Петри с мясопептонным агаром, в который добавлен индикатор для выявления продуцентов эндонуклеазы, содержащий

5 0,6 мг/мл дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и 0,01% толуидинового голубого, окрашивающего среду с ДНК с голубой цвет. Вокруг колоний, выделяющих эндо- нуклеазу, через 24 ч роста в результате гид0 релиза ДНК образуется ореол розового цвета. Отбирают колонии с наибольшими по сравнению с контролем зонами ДНК-азной активности.

IIэтап. Клетки наиболее активного му- 5 танта, отобранного на I этапе выращивают

на мясопептонном бульоне до середины

экспоненциальной фазы (ОПббо 0,50),

осаждают центрифугированием, отмывают

- отсреды 0,1 М фосфатным буфером, рН 5,5.

0 Клетки суспендируют в том же буфере до ОПб50 0,40. Кгдрлученной суспензии добавляют N-метил-нитро N-нитрозогуанидин (Н Г) мг/мл в 0,1 М цитратном буфере, рН 5,5) до конечной концентрации 75 мкг/мл.

5 Клетки инкубируют в течение 30 мим в водяной бане при 37° С. Затем клетки осаждают центрифугированием, промывают 0,1 М фосфатным буфером, рН 7, чтобы удалить НГ, и рассеивают разведением на чашки с

индикаторной средой с ДНК. Отбирают беспигментные колонии с наибольшими зонами гидролиза ДНК. Все отобранные мутан- ты проверяют на эндонуклеазную активность на жидкой среде.

Наибольшая активность выявлена у му- танта 28-13.

П р и м е р 2. Изучение эндонуклеазной активности.

Исходный штамм Вй - 211 АТСС-9986 и штамм 28-13 выращивают в течение суток в пробирке со скошенной средой указанного состава, смывают 0,5%-ным физиологическим раствором и засевают из расчета 1 мл инокулята на 100 мл среды в колбу объемом 1 л с 200 мл среды.

Выращивание ведут на качалке (200 об/мин) при оптимальной температуре 30° С в течение 24 ч. Затем бактериальные клетки отделяют центрифугированием при бОООд, 20 мин. В надоса- дочной жидкости определяют эндонуклеазную активность вискозиметри- чески и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 2%-ной HCI04. Результаты представлены в таблице.

Полученный штамм отличается от исходного Вй-211 АТСС-9986 большими размерами клеток, более медленным разжижением желатина, от ш-та,мма ВКПМ В-3857 - отсутствием пигментообразова- ния.

Эндонуклеазная активность штамма 28-13 в 150 раз превышает активность исходного штамма и в 1.5 раза штамма ВКПМ - В-3857. Наиболее высокая активность штамма 28-13 достигается на 24-й час роста.

Использование предлагаемого штамма 28-13 в качестве продуцента эндонукле- азы позволяет повысить эндонуклеазную активность за период одной ферментации на 150% по сравнению с культивированием на той же среде штамма ВКПМ В-3857. Преимуществом предлагаемого штамма по сравнению со штаммом ВКПМ В-3857 является стойкое отсутствие пигментации.

Формула изобретения Штамм бактерий Serratia marcescens ВКПМ В-4870 - продуцент эндонуклеазы:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий S.MARCESCENS, продуцирующий неспецифическую эндонуклеазу (К.Ф.З. 1. 4. 9), которая может быть использована в научно-исследовательских работах по изучению противоопухолевых и противовирусных свойств эндонуклеазы при исследовании структуры хроматина для получения мононуклеотидов. Цель изобретения - получение беспигментного штамма SERRATIA MARCESCENS ВКПМ В-4870 (28 - 13), обладающего более высоким уровнем эндонуклеазной активности в культуральной жидкости. Полученный методом индуцированного мутагенеза беспигментный штамм S. MARCESCENS 28 - 13 обладает эндонуклеазной активностью, в 150 раз превышающей активность исходного штамма Вй - 211 АТСС - 9986, в 1,5 раза - активность пигментного штамма ВКПМ В-3857 с повышенной активностью эндонуклеазы. 1 табл.

Эндонуклеазная активность различных штаммов S, marcescens